发酵实验室检测方法汇总.docx
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发酵实验室检测方法汇总
目录
GSH检测方法(酶法)1
GSH检测方法(普通法)3
S-腺苷蛋氨酸(SAM)检测方法4
ATP和ADP检测方法6
NADH和NAD+检测方法8
葡萄糖检测方法10
尿素检测方法11
无机硒检测12
有机硒检测14
氧化性有关酶的酶活(GPx、CAT、SOD、MDA等)检测15
己糖激酶测定方法16
磷酸果糖激酶测定方法17
丙酮酸激酶测定方法18
γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶测定方法19
普鲁兰产量及其分子量20
总糖的测定-硫酸蒽酮法22
蔗糖检测方法23
NH4+浓度测定(改良的Berthelot法)24
蛋白质含量测定-考马斯亮蓝方法25
胞内pH(pHi)的测定26
整理人:
王玉磊(1-11)
杨波(12-15)
董颖颖(16-19)
余小六(20-26)
GSH检测方法(酶法)
原理
DTNB是一个由二硫键连接的带有两个苯环的化合物,,可以写成D-S-S-D,其中D代表苯环,在酶反应体系中存在如下反应:
G-S-H+D-S-S-D→G-S-S-D+DSH
G-S-H+G-S-S-D→G-S-S-G+DSH
谷胱甘肽还原酶的作用:
G-S-S-G+NADPH→2GSH+NADP+
其中,DSH在412nm处有最大吸收峰。
当反应体系中有微量GSH或者GSSG,足量的DTNB、NADPH和谷胱甘肽还原酶酶活,循环反应可以一直进行下去,反应液的颜色会越来越深。
在反应开始的5min中内,反应速率呈线性增加,并和体系内谷胱甘肽(包括氧化型和还原型)浓度成正比关系。
如果反应体系中不存在谷胱甘肽还原酶和NADPH,则只有最初的GSH能和DTNB反应,当GSH浓度很低时,生成的颜色物质基本不可测。
通过这样的循环反应,使得该方法可以检测到很低浓度的GSH,灵敏性和专一性强。
试剂
(1)125mM磷酸钠缓冲液,6.3mMEDTA,PH7.5
配制方法:
Ⅰ.称取NaH2PO4.H2O(分子量138)22.25g,EDTA(分子量372.24)2.35g配成1L溶液;
Ⅱ.称取Na2HPO4.2H2O(分子量178)17.25g,EDTA(分子量372.24)2.35g配成1L溶液;
Ⅲ.量取900mLNa2HPO4.2H2O溶液(pH约为7.9左右)加入试剂瓶,加入磁力拌器,边搅拌边慢慢加入NaH2PO4.2H2O溶液,直至pH达到7.5。
后者的用量大约在100ml左右。
(2)6mMDTNB
称取23.8mgDTNB(分子量396.3,SIGMAD-8130),溶于10mL磷酸钠缓冲液中,4℃可稳定一个月。
每次用量100μL,可测约100个样。
(3)0.3mMNADPH(分子量833.4)
称取12.5mg溶解于50mL磷酸钠缓冲液中,4℃稳定一星期。
每次用量700μL,可测70个样左右。
(4)50U/mL谷胱甘肽还原酶(GR)
如酶性质为:
172U/mg蛋白,蛋白含量为9.8mg/mL,相当于1685.6U/mL酶液。
取30μL酶液加到970μL磷酸钠缓冲液即可。
每次用量10μL,可测约100个样。
所配制的酶液在4℃可稳定一个星期甚至更长时间。
操作步骤
在2mL体积的比色皿中顺序加入100μLDTNB,700μLNADPH和经适当稀释的样品(25mL酒精萃取后的上清液稀释400倍:
10μL+3990μLH2O)200μL。
室温下加入10μL谷胱甘肽还原酶启动反应,测量412nm处反应体系的初始OD值和反应3min后的OD值。
标准曲线
1
2
3
4
5
6
GSH(nmol)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0.01mMGSH溶液(μL)
0
20
40
60
80
100
水(μL)
200
180
160
140
120
100
DTNB(μL)
100
100
100
100
100
100
NADPH(μL)
700
700
700
700
700
700
GR(μL)
10
10
10
10
10
10
注意事项
(1)采用精确的微量移液器
(2)反应比色杯。
实验的样品只能一个个的测,用在普通分光光度计上的是4mL比色皿,太大,必须用只有一半大(0.5cm)厚的比色皿。
(3)反应温度.严格来说,为保证重复性,应在25℃下进行反应,但是我们的分光光度计不能恒温,因此每次都需要做标准曲线。
(4)反应时间需精确控制,否则会影响反应速率计算,产生较大误差。
(5)加入GR时,需要用封口膜把比色皿封起来
(6)样品中的GSH浓度尽可能低一些,否则反应速率太大,没法控制,所以稀释倍数要尽量大些
参考文献
Tietze,F.,1969.Enzymaticmethodforquantitativedeterminationofmonogramamountsoftotalandoxidizedglutathione:
applicationtomammalianbloodandothertissue.Anal.Biochem.29,502-522.
GSH检测方法(普通法)
原理
DTNB与GSH反应产物D-S-H(D代表苯环)在412nm处有最大吸收峰,在一定范围内,GSH的浓度与反应液的颜色成正比关系。
试剂
(1)DTNB溶液:
50mM乙酸钠(M=136.08,含三个结晶水)、2mMDTNB(M=396.36)
100mL溶液中含有:
三水和乙酸钠0.6804g,DTNB0.0793g。
(2)Tris-HCl溶液:
1M三羟甲基胺基甲烷(M=121.14),pH8.0
100mL溶液中含有:
Tris碱12.114g,加浓HCl并稀释至pH=8.0。
操作步骤
针对细胞提取得到的样品,无需稀释即可直接检测:
0.2mLDTNB溶液+0.4mLTris-HCl溶液+4mLH2O+500μL样品,于412nm处检测吸光度值,对照标准曲线,得GSH含量。
标准曲线
GSH标准液浓度(g/L)
项目
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
水(mL)
4.5
4.3
4.3
4.3
4.3
4.3
Tris-HCl(mL)
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
DTNB(mL)
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
GSH标准液(μL)
0
200
200
200
200
200
注意事项
样品要最后加,加完样品后,在第0min,2min,4min时充分振荡。
参考文献
Tietze,F.,1969.Enzymaticmethodforquantitativedeterminationofmonogramamountsoftotalandoxidizedglutathione:
applicationtomammalianbloodandothertissue.Anal.Biochem.29,502-522.
S-腺苷蛋氨酸(SAM)检测方法
原理
HPLC法,利用C18色谱柱对SAM进行分离,分离后的SAM在254nm处有最大吸收峰,SAM的浓度与峰面积成正比关系。
试剂
流动相配制(一级水配制):
Ⅰ.0.5mol/L的甲酸铵(化学纯,用甲酸溶液调pH至4.0)溶液1L。
Ⅱ.10%的甲醇(HPLC级)溶液200mL
操作步骤
1.制样,10mL发酵液离心取细胞沉淀,向沉淀中加10mL0.35M稀硫酸,4℃静置萃取2h,3500r/min离心3min,上清液经0.22μm膜过滤即得样品(约需1mL)
2.抽滤装置清洗:
洗衣粉清洗一次→一级水润洗两次→烘干备用
3.准确配置流动相,并进行抽滤(0.45μm),同时抽滤一瓶一级水
4.对流动相进行超声(10-20min),除去空气
5.慢调流速至0.8mL/min,待压力稳定后,平衡基线约1h
6.进样
7.待全部样品检测完,清洗液相系统和色谱柱(先一级水冲洗约0.5h-1h,用10%甲醇冲洗0.5h-1h,最后用纯甲醇冲洗约1h)
HPLC检测条件
色谱柱:
C18柱(4.6nm×250nm),
检测器:
紫外检测器
流动相:
0.5mol/L的甲酸铵溶液
流速:
0.8mL/min
柱温:
25℃
检测池温度:
30℃
检测浓度的线性范围:
0-0.5g/L
标准曲线
HPLC分析SAM浓度的外标曲线
SAM发酵液样品的HPLC图谱
注意事项
1.在静置萃取的过程中要适时摇晃样品,使萃取更充分
2.样品和流动相一定要经过微膜过滤,且流动相要经过超声处理
3.操作过程中要留意系统压力变化
参考文献
李东阳,于健,田露,等.利用重组Pichiapastoris生产腺苷甲硫氨酸[J].生物工程学报,2002,18(3):
295-299.
ATP和ADP检测方法
原理
HPLC法,ATP和ADP在固定相和流动相中分配系数不同,利用C18色谱柱可以实现二者的分离,进一步利用紫外检测器对分离后的二者的信号进行收集,在254nm处有最大吸收峰,在一定范围内二者的浓度与峰面积成正比关系。
试剂
流动相配制(一级水配制):
Ⅰ.PBS溶液(1.36gKH2PO4加0.1mol·L-1NaOH溶液15.2mL,用水稀释至100mL,pH6.5)
Ⅱ.10%的甲醇(HPLC级)溶液200mL
操作步骤
1.制样,取5mL发酵液,经4℃,8000r·min-1冷冻离心10min得到酵母泥,将湿细胞重新悬浮在5mL0.2mol·L-1磷酸缓冲液(pH7.0)中,超声波破碎10min(功率22%,破碎10s,间隔10s),离心后得到的上清液经0.22μm膜过滤即得样品(约需1mL)
2.抽滤装置清洗:
洗衣粉清洗一次→一级水润洗两次→烘干备用
3.准确配置流动相,并进行抽滤(0.45μm),同时抽滤一瓶一级水
4.对流动相进行超声(10-20min),除去空气
5.用一级水以0.8mL/min流速冲洗柱子0.5h,然后利用流动相平衡系统约1h
6.进样
7.待全部样品检测完,清洗液相系统和色谱柱(先一级水冲洗约0.5h-1h,用10%甲醇冲洗0.5h-1h,最后用纯甲醇冲洗约1h)
HPLC检测条件
色谱柱:
C18柱(4.6nm×250nm),
检测器:
紫外检测器
流动相:
0.01MPBS溶液
流速:
0.8mL/min
柱温:
35℃
检测浓度的线性范围:
0-50mg/L
标准曲线
HPLC分析ATP、ADP浓度的外标曲线
注意事项
检测ATP和ADP浓度的流动相为缓冲盐,因缓冲盐与有机溶剂混合易形成细小沉淀,造成系统或者柱子的堵塞,因而在检测前和检测后必须用一级水对整个系统进行彻底的冲洗。
参考文献
SatoK,YoshidaY,HiraharaT,OhbaT.On-linemeasurementofintracellularATPofSaccharomycescerevisiaeandpyruvateduringsakemashing[J].J.Biosci.Bioeng.,2000,90(3):
294-301
NADH和NAD+检测方法
原理
HPLC法,NADH和NAD+在固定相和流动相中分配系数不同,利用C18色谱柱可以实现二者的分离,进一步利用紫外检测器对分离后的二者的信号进行收集,在254nm处有最大吸收峰,在一定范围内二者的浓度与峰面积成正比关系。
试剂
流动相配制(一级水配制):
Ⅰ.10.93gNaH2PO4和3.04gNa2HPO4溶于水中,加入四丁基溴化铵3.22g,调节pH为6.5,真空抽滤后定容至1L,按86:
14(v·v-1)比例和乙腈混合
Ⅱ.10%的甲醇(HPLC级)溶液200mL
操作步骤
1.制样,取5mL发酵液,经4℃,8000r·min-1冷冻离心10min得到酵母泥,将湿细胞重新悬浮在5mL0.2mol·L-1磷酸缓冲液(pH7.0)中,超声波破碎10min,离心后得到的上清液经0.22μm膜过滤即得样品(约需1mL)
2.抽滤装置清洗:
洗衣粉清洗一次→一级水润洗两次→烘干备用
3.准确配置流动相,并进行抽滤(0.45μm),同时抽滤一瓶一级水
4.对流动相进行超声(10-20min),除去空气
5.用一级水以0.8mL/min流速冲洗柱子0.5h,然后利用流动相平衡系统约1h
6.进样
7.待全部样品检测完,清洗液相系统和色谱柱(先一级水冲洗约0.5h-1h,用10%甲醇冲洗0.5h-1h,最后用纯甲醇冲洗约1h)
HPLC检测条件
色谱柱:
C18柱(4.6nm×250nm),
检测器:
紫外检测器
流动相:
见试剂
流速:
0.8mL/min
柱温:
35℃
检测浓度的线性范围:
0-50mg/L
标准曲线
HPLC分析NADH、NAD+浓度的外标曲线
参考文献
MisetaA,Tökés-FüzesiM,AielloDP,BedwellDM.ASaccharomycescerevisiaemutantunabletoconvertglucosetoglucose-6-phosphateaccumulatesexcessiveglucoseinendoplasmicreticulumduetocoreoligosaccharidetrimming[J].Eukaryot.Cell,2003,2(3):
534-541
葡萄糖检测方法
原理
DNS与还原性糖在共沸条件下,生成的物质在520nm处有最大吸收峰,且在一定范围内吸收峰的强度(OD值)与还原糖浓度成线性关系。
试剂
DNS:
甲液:
溶解6.9g苯酚于15.2mL10%NaOH中,并稀释至69mL,在此溶液中加入6.9gNaHSO3。
乙液:
称取255g酒石酸钾钠,加到300mL10%NaOH中,再加入880mL1%的3,5-二硝基水杨酸。
甲、乙液混合得黄色试剂,贮存于棕色瓶中,室温放置7-10天后备用。
操作步骤
0.04mL样品+1.96mL水+1.5mLDNS+→沸水浴五分钟,冷却至室温并定容至25mL→520nm处检测OD值
浓度范围0-0.5g/L
标准曲线
葡萄糖母液1g/L:
称取0.1160g葡萄糖,溶于100mL去离子水。
反应体系
试管号项目
0
1(0.1g/L)
2(0.2g/L)
3(0.3g/L)
4(0.4g/L)
5(0.5g/L)
DNS(mL)
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
葡萄糖母液(mL)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
水(mL)
2
1.8
1.6
1.4
1.2
1
体系共3.5mL,沸水浴五分钟,迅速冷却,定容至25mL,测520处的OD值。
参考文献
MillerG.Useof3,5-dinitrosalicylicacidreagentfordeterminationofreducingsugars[J].Anal.Chem.,1959,31:
426-428
尿素检测方法
原理
二乙酰一肟显色法
试剂
酸性试剂:
在三角烧瓶中加蒸馏水约100ml,然后加入浓硫酸44ml及85%磷酸66ml,冷却至室温,加入硫氨脲50mg及硫酸镉(CdSO4.8H2O)2g,溶解后用蒸馏水稀释至1L,置棕色瓶放冰箱保存,可稳定半年;
二乙酰一肟溶液:
称取二乙酰一肟20g,加蒸馏水约900ml,溶解后,再用蒸馏水稀释至1L,置棕色瓶中,贮放冰箱内可保存半年不变;
尿素标准贮存液(100mmol/L):
称取干燥纯尿素(MW=60.06)0.6g,溶解于水,并稀释至100ml,现配现用。
尿素标准应用液(5mmol/L):
取5.0ml贮存液用去氨蒸馏水稀释至100ml。
操作步骤
空白管:
蒸馏水0.02ml+二乙酰一肟0.5ml+酸性试剂5ml;
检测管:
样品0.02ml+二乙酰一肟0.5ml+酸性试剂5ml;
混匀后,置沸水浴中加热12min,取出,置冷水中冷却5min后,用分光光度计波长540nm,比色杯光径1.0cm,以空白管调零,读取测定管吸光度。
浓度范围
1-10mmol/L
标准曲线
尿素浓(mmol/L)
0
2
4
6
8
10
尿素(ml)
0
0.02
0.02
0.02
0.02
0.02
蒸馏水(ml)
0.02
0
0
0
0
0
二乙酰一肟(ml)
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
酸性试剂(ml)
5
5
5
5
5
5
参考文献
叶应妩,王毓三.全国临床检验操作规程(第二版)[M].南京:
东南大学出版社,1997,260-261.
无机硒检测
原理:
Se能够催化氯酸钾氧化苯肼生成偶氮离子,继而与变色酸偶合成红色偶氮染料,生成的红色偶氮染料的吸光度与一定浓度范围的硒成正比,因而可利用催化吸光光度法测定硒酵母中的硒含量。
试剂:
变色酸:
0.03mol/L,称取变色酸1.0930g,定容至l00ml。
盐酸苯肼:
0.03mol/L,称取0.4400g盐酸苯肼,定容至100ml。
EDTA:
0.02mol/L,称取EDTA钠盐0.7450g定容至100ml。
氯酸钾:
0.6mol/L,称取7.3500g氯酸钾.定容至100ml。
HCI—KC1缓冲液:
0.2mol/L,取浓盐酸2.50ml稀释至150ml;再取氯化钾2.2500g,定容至150ml,两者混匀。
亚硒酸钠标液:
称取亚硒酸钠0.08167g,定容至500ml,然后再稀释500倍
操作步骤:
取10mL发酵液,3500r/min离心10min收集菌体,蒸馏水离心洗涤3次。
将湿菌体悬浮于5mL去离子水中,沸水浴30min,离心,测定上清液中硒的浓度。
向25mL比色管中依次加入乙二氨四乙酸二钠(EDTA-2Na)溶液1mL、HCl-KCl缓冲液2mL、氯酸钾2mL、变色酸2mL、盐酸苯肼1mL和待测样品2mL,混匀,在沸水浴中加热20min,于冷水中迅速冷却后,利用酶标仪测定520nm下吸光值。
标准曲线:
反应体系10ml标准样2ml试剂8ml母液2µg/ml
梯度µg/ml
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
Se含量µg
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
所需标准样浓度
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
从母液中取µl
0
100
200
300
400
500
水(ml)
2.0
1.9
1.8
1.7
1.6
1.5
管号
方法
1
2
3
4
5
6
标准样(mL)
2
2
2
2
2
2
EDTA(mL)
1
1
1
1
1
1
HCl---KCl缓冲液(mL)
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
氯酸钾(mL)
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
变色酸(mL)
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
盐酸苯肼(mL)
1
1
1
1
1
1
沸水浴20min,于冷水中冷却,于520nm测OD
有机硒检测
原理:
Se2-+2H+H2Se将H2Se通过载气(氩气)导入石英炉进行测定。
操作步骤:
Ⅰ.样品的消化
取5mL发酵液,在3500r/min下离心10min,蒸馏水离心洗涤3次,收集湿菌体。
将湿菌体置于小烧杯中并加入混合酸(浓HNO3:
浓HClO4=4:
1)10mL,加热直到溶液上面有滚滚白烟时停止加热,此时溶液变成无色,冷却后,定容至100mL待测。
Ⅱ.样品检测
采用氢化物原子荧光光谱法。
称取0.5g~2g(精确至0.001g)试样,液体试样吸取1.00mL~10.00mL,置于消化瓶中,加10.0mL混合酸及几粒玻璃珠,盖上表面皿冷消化过夜。
次日于电热板上加热,并及时补加硝酸。
当溶液变为清亮无色并伴有白烟时,再继续加热至剩余体积2mL左右,切不可蒸干。
冷却,再加5.0mL盐酸,继续加热至溶液变为清亮无色并伴有白烟出现,将六价硒还原成四价硒。
冷却,转移至50mL容量瓶中定容,混匀备用。
同时做空白试验。
吸取10.0mL试样消化液于15mL离心管中,加盐酸2.0mL,铁氰化钾溶液1.0mL,混匀用原子荧光光谱仪检测。
氧化性有关酶的酶活(GPx、CAT、SOD、MDA等)检测
原理
GPx:
谷胱甘肽过氧化物酶可以促进过氧化氢(H2O2)与还原型谷胱甘肽(GSH)反应生成H2O及氧化型谷胱甘肽(GSSG),谷胱甘肽过氧化物酶的活力可以利用其酶促反应的速度来表示,测定此酶促反应中还原型谷胱甘肽的消耗,则可求出酶的活力。
CAT:
过氧化氢酶(CAT)分解H2O2的反应可通过加入钼酸铵而迅速终止,剩余的H2O2与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物,在405nm处测定其生成量,可计算出CAT的活力。
SOD:
采用经典的氮蓝四唑(NBT)显色法。
通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子,将氮蓝四唑还原为蓝色的甲臜,后者在560nm处有强吸收。
而SOD可清除超氧阴离子,从而抑制了甲臜的形成。
反应液蓝色愈深,说明超氧化物歧化酶活性愈低,反之则酶活性愈高。
据此通过比色分析就可以计算出超氧化物歧化酶活性水平。
MDA:
丙二醛在较高的温度下可与硫代巴比妥酸(TBA)发生反应,形成红色的MDA-TBA加合物,该加合物在535nm处有最大吸收峰,据此可以通过比色法进行MDA的检测。
相关操作步骤及其它,请详见各检测试剂盒。
己糖激酶测定方法
原理D-葡萄糖+ATP→6-磷酸葡萄糖+ADP
6-磷酸葡萄糖+NADP+→6-磷酸葡萄糖酸盐+NADPH
反应体系:
100mMTris-buffer(pH7.6)1.0ml
500mMD-葡萄糖0.4ml
250mMMgCl20.12ml
36mMATP0.8ml
10mMNADP0.3ml
H2O0.08ml
细胞破碎液0.1ml
酶活测定在3
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