张宣琪 土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选与鉴定.docx
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张宣琪土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选与鉴定
土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及鉴定
广州大学
生命科学学院
姓名:
张宣琪
班级:
生技121班
学号:
1214300094
同组组员:
徐婷婷刘海伦
张黎明崔仁洪叶毅航
一、摘要
本实验从土壤中分离出能产淀粉酶的芽孢杆菌并对其进行鉴定、保存,实验中涉及菌株的分离纯化、菌株的形态学鉴定和生理生化鉴定,根据伯杰式细菌学手册鉴定其种属。
实验中通过80℃水浴20min预处理,杀死无芽孢菌体,筛选出芽孢杆菌;再用稀释涂布平板法对芽孢杆菌进行初步筛选;又通过分区划线法对初筛菌株进一步分离纯化;最后用选择性淀粉培养基进行筛选,得到纯培养的产淀粉的芽孢杆菌。
最后并通过耐盐试验、明胶试验、糖发酵试验、VP试验、吲哚试验等多项生理生化实验对筛选出来的菌种进行鉴定,鉴定结果为蜂房芽孢杆菌。
二、关键词:
淀粉酶芽孢杆菌生化鉴定
三、实验材料与方法
1、实验材料
1.1土样的采集
选取广大梅苑公寓楼下花园、广大生化楼前小河附近两处的土壤,五点法采集,边长15cm。
铲去表层土,取10cm深土壤,每一个土样约25g左右(每个点5g)。
将土样放入无菌的纸袋中,并记录采集的时间、地点、植被类型,4℃冰箱中保存备用。
分别记做A土样、B土样。
1.2培养基
淀粉筛选培养基
淀粉20g,蛋白胨10g,NaCl2.5g,琼脂10g,自来水1000ml,pH自然。
斜面种子培养基
牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl5g,琼脂15~20g,自来水1000ml,pH7.2~7.4;
蛋白胨液体培养基(作吲哚实验用)
蛋白胨10g,NaCl5g,自来水1000ml,pH7.2~7.4,121℃灭菌20min;
葡萄糖蛋白胨培养基(VP和MR试验用)
蛋白胨5g,葡萄糖5g,NaCl5g,自来水1000ml,pH7.2~7.4,121℃灭菌20min;
糖发酵培养基(作糖酵解试验用)
蛋白胨2g,NaCl5g,K2HPO40.2g,1%溴麝香草酚蓝水溶液3ml,待试糖10g(一般糖或醇按1%量加入,而半乳糖、乳糖按1.5%的量加入),自来水1000ml,pH7.2~7.4;
酪氨酸平板(作酪氨酸水解试验用)
L-酪氨酸0.5g悬浮于10mL蒸馏水中,20分钟灭菌,然后于100mL无菌的营养琼脂混合,即成酪氨酸水解平板;
酪素平板(作酪素水解试验用)
取5g脱脂奶粉加入50mL蒸馏水中(或用50mL脱脂牛奶),另称1.5g琼脂溶于50mL蒸馏水中,将两液分开灭菌。
待冷至45-50℃时,将两液混匀倒平板,即成牛奶平板;
西蒙斯氏柠檬酸盐培养液(作柠檬酸盐利用试验用)
柠檬酸钠2g,NaCl5g,MgSO4·7H200.2g,K2HPO4·3H201g,(NH4)2HPO41g,1%溴麝香草酚蓝水溶液10ml,琼脂15~20g,自来水1000ml,pH7.0,121℃灭菌20min;
淀粉牛肉膏蛋白胨琼脂培养基
可溶性淀粉2g,牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl5g,琼脂15~20g,蒸馏水1000mL,pH7.2~7.4;
(2%、5%、7%)高盐培养基(做耐盐试验用)
牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl(2g、5g、7g),琼脂15~20g,蒸馏水1000mL,pH7.2~7.4;
明胶培养基(做明胶液化试验用)
牛肉膏3g,蛋白胨10g,明胶12g,蒸馏水1000mL,pH7.0;
半固体培养基(作运动性实验用)
琼脂含量0.5%,其他组分比例按牛肉膏蛋白胨培养基配制;
1.3试剂和仪器
1.3.1试剂
耐盐性试验:
NaCl粉末。
糖酵解实验:
葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇。
革兰氏染色:
草酸铵结晶紫染色液,卢戈氏碘液,95%乙醇,0.5%沙黄染色液。
芽孢染色:
5%孔雀绿染色液,0.5%沙黄染色液。
V.P试验(MR试验):
40%NaOH溶液,ɑ-奈酚。
吲哚试验:
乙醚,吲哚试剂。
碘原液:
碘1lg,碘化钾22g,加水定容至50OmL。
单染色:
草酸铵结晶紫或石炭酸复红。
硝酸盐试验:
甲液(对氨基苯磺酸0.8g+5mol/L醋酸100mL;乙液(α-奈胺0.5g+5mol/醋酸100mL);
酪素水解:
脱脂奶粉。
酪氨酸水解:
L-酪氨酸。
溶菌酶抗性实验:
溶菌酶。
卵黄反应:
新鲜鸡蛋。
硝酸盐试验:
硝酸盐
明胶液化试验:
明胶
柠檬酸盐利用试验:
西蒙斯氏柠檬酸盐
1.3.2仪器:
无菌培养皿,接种环,土样,三角瓶,烧杯,试管,酒精灯,无菌吸管,载玻片,吸水纸,涂布器,显微镜,移液管,移液枪等。
恒温摇床,恒温培养箱,高压蒸汽灭菌箱,超净工作台,恒温水浴箱,磁力搅拌器等。
2、试验方法
2.1土壤样品悬液制备
2.1.1土壤悬液制备
各称取5g土壤样品于装有45ml无菌水的100ml锥形瓶中,加入玻璃珠与土壤悬液一起振荡,制成土壤悬液。
置100℃沸水浴10min,以杀死非芽孢杆菌。
静置5min。
2.1.2土壤悬液稀释
吸取上清液0.5ml加到含有49.5ml无菌水的三角瓶中,配成10-2g/ml的土壤悬液,并进一步稀释至10-3g/ml、10-4g/ml和10-5g/ml,共四个浓度梯度。
2.2分离纯化
2.2.1芽孢杆菌属的纯培养
分别吸取不同稀释度的土壤悬液0.2ml于牛肉膏蛋白胨琼脂平板上,用无菌玻璃涂棒涂布均匀。
每个稀释度3个重复,37℃倒置培养24h。
每个土样挑取形态特征不同的单菌落,在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上划线纯化。
菌落的形状、颜色、质地、透明度一致,菌体形态为直杆状,长度均一、宽度一致,并能产生芽孢时,确认为芽孢杆菌属的纯培养物。
2.2.2产淀粉酶菌株的筛选
淀粉水解实验
挑取菌种,划线接种于可溶性淀粉培养基中,每种菌株做一个平板,将接种完成的平板置于37℃恒温箱中倒置培养24h。
2.2.3单染色镜检步骤:
涂片、干燥及固定;
染色:
在涂有菌种的载玻片上滴加适量的草酸铵结晶紫染色液或石炭酸复红液,染1min,倾去染液,用水冲洗至无染色液颜色为止。
镜检:
用油镜观察染色结果;
2.2.4芽孢染色镜检步骤:
·取37℃培养18~24h的枯草芽孢杆菌涂片,干燥,固定。
·于涂片上滴人3~5滴5%孔雀绿水溶液。
·用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热,自载玻片上出现蒸汽时,开始计算时间约4-5min。
加热过程中切勿使染料蒸干,必要时可添加少许染料。
·倾去染液,待玻片冷却后,水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。
·用石炭酸复红液复染lmin,水洗。
·制片干燥后用油镜观察。
芽孢呈绿色,菌体红色。
观察芽孢的形状和位置.
2.2.5菌株保藏
将筛选出的菌株接种于肉汤琼脂斜面,4℃下保存待用。
2.3初步鉴定
2.3.1形态学鉴定
将所得的斜面菌种接种到新的平板上培养以观察筛选出的产淀粉酶芽孢杆菌菌落的大小、颜色、干湿情况、形态、高度、透明程度、边缘、是否易被挑起、气味等。
然后进行一系列的镜检——革兰氏染色、芽孢染色(具体步骤同上)观察是否符合芽孢杆菌的指标。
2.3.2生理生化鉴定
温度对微生物生长的影响
将牛肉膏蛋白胨培养基融化倒平板(培养基厚度为15-20cm)。
使用牛肉膏蛋白胨培养基,将菌株十字接种到平板,分别在5℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃条件下培养24h,观察细菌是否生长。
糖类发酵试验(葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇)
取斜面培养菌种接种于37℃温箱中培养24h,观察培养基是否由紫变黄,杜氏小管中是否有气泡,以证实菌株是否产酸产气。
VP试验
取葡萄糖蛋白胨培养基,接种37℃培养两天,取出以上试管,每管分别加入40%NaOH溶液10-20滴,并加等量α-奈酚,振荡试管,以使空气中的氧溶入,置37℃恒温箱中保温15-30min后,若培养液呈红色,记为阳性(+)反应,若不呈红色,记为阴性(-)。
MR试验
取葡萄糖蛋白胨培养基,接种37℃培养两天,取出以上试管,每管分别加入甲基红2滴,震荡,若培养液呈红色,记为阳性(+)反应,若不呈红色,记为阴性(-)。
吲哚试验
取蛋白胨水培养基,接种,37度培养2天,在培养基中加入乙醚1~2ml,经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中,静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面,此时沿管壁缓慢加入5~10滴吲哚试剂,如有吲哚存在,乙醚层呈现玫瑰红色,为吲哚试验阳性(+),否则为阴性(-)。
柠檬酸盐利用实验
取装有西蒙斯氏柠檬酸盐培养基斜面的试管,分别将少量菌苔接种于各支相应的管中,然后置于37℃恒温箱中培养24h。
观察结果,若培养基变蓝色,则表明该菌能利用柠檬酸盐作为碳源而生长,即为阳性(+),若培养基无变色,则为阴性(-)。
耐盐性试验
将分离获得的细菌分别接种在NaCl浓度为2%,5%,7%,10%,的牛肉膏蛋白胨液体培养基中,置37℃下培养,观察生长情况,并做记录。
硝酸盐还原实验
被检菌接种于硝酸盐培养基中,于35℃培养l~4d.将甲、乙液等量混合后(约0.1mL)加入培养基内,立即观察结果。
明胶液化试验
穿刺接种,深度至明胶层2/3处,于37℃温箱培养24h.。
取出静置冰箱中待其凝固后,再观察其是否被细菌液化,如被液化,则为阳性,能产生蛋白酶。
运动性试验
使用半固体营养琼脂试管,将接种针从直立柱培养基中央自上而下直刺到离管底1~1.5cm处,沿原穿刺线拔出接种针。
于37℃温箱培养24h,观察是否产生树根状生长,若有,则菌株有鞭毛,若直立生长,则菌株无鞭毛。
酪素水解试验(酪蛋白水解)
牛奶平板的制备:
取5g脱脂奶粉加入50mL蒸馏水中(或用50mL脱脂牛奶),另称1.5g琼脂溶于50mL蒸馏水中,将两液分开灭菌。
待冷至45-50℃时,将两液混匀倒平板,即成牛奶平板。
将平板倒置过夜,使表面水分干燥,然后将菌种点接在平板上,每皿可点接3-5株菌。
37℃培养,记录菌落周围和下面酪素是否已被分解而呈透明。
酪氨酸水解实验
将营养琼脂融化,冷却至温热,与L-酪氨酸混匀,分别将菌种点接在平板上,37℃培养24h。
记录菌落周围是否有透明圈,若有,则菌株能够水解酪氨酸。
卵黄反应试验
步骤:
取18-24h的斜面或培养液中的菌体点种在上述平板上,点的直径约为2-3mm。
每个平板可分散点5-7株菌,以不影响观察为宜,适温培养18-24h观察。
如菌落四周和下面有不透明的区出现,表示卵磷脂分解生成脂肪,说明有卵磷脂酶。
淀粉水解试验
用18-24h的纯培养物,涂布接种于淀粉琼脂平板(一个平板可分区划“+“字接种,),于37℃培养24-48h。
然后将碘试剂完全浸于培养表面。
立即检视结果,阳性反应(淀粉被分解)为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或菌苔周围出现无色透明环。
阴性反应则无透明环。
0.001%溶菌酶试验
将菌种制成菌悬液,用无菌玻璃涂棒涂布在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上,然后用在溶菌酶试剂中浸湿的滤纸片贴在平板上,培养24h后观察有无抑菌圈的出现,若有为阳性反应,否则为阴性反应。
2.4菌种鉴定
根据从伯杰式细菌学手册芽孢杆菌属中检索到的芽孢杆菌的生理生化特点,选取能从土壤中分离到的芽孢杆菌种为标准菌种,其生理生化指标如下表:
通过对目的菌种进行多项生理生化实验,对比伯杰式手册的实验结果,从而鉴定出目的菌的种别;
四、实验结果分析
1、分离纯化
1.1菌株的初筛
1.1.1通过80℃水浴20min分别对AB土样进行预处理,杀死无芽孢菌体。
1.1.2把处理过的菌悬液离心取上清液,稀释到不同梯度,每个梯度分别涂布到营养琼脂培养基,27℃保温箱培养24h,获得长有不同菌落的培养基。
用接种环挑取8个菌落形态不同的单菌落于筛选培养基中进行分区划线,划线结束后,置于在37 ℃下恒温培养12~24h,每过12~24h重复此操作共3次。
分别通过3次分区划线,分离纯化初筛所得到的8株菌,把这些菌进行编为1~8号。
1.1.3把这8株菌接种到淀粉培养基中,筛选出能产淀粉酶的菌株,结果只有1、2、3、4号株菌有透明圈;5号菌有一个平板没有接种到,为了实验准确性,放弃5号;6、7、8号菌均未产生透明圈,即不产淀粉酶,不符合目标菌株要求,放弃。
1.2菌株的复筛
1.2.1单染色
经单染色镜鉴,2号菌株不是纯培养,有杂菌,不符要求;1、3、4菌株鉴定为纯培养,符合要求。
(3号菌株单染色)
1.2.2芽孢染色
经芽孢染色镜鉴,观察到1、4号菌株无芽孢,3号菌株有芽孢,芽孢中生,菌株比较年轻,是芽孢杆菌。
(3号菌株芽孢染色)
1.2.3革兰氏染色
对3号菌株进行革兰氏染色,被染成红色,是革兰氏阴性菌。
最终得到能产淀粉酶的芽孢杆菌,把菌株接种到斜面培养,保存菌株。
2初步鉴定
2.1形态学鉴定
3号菌的形态特征:
乳白色,湿润,不透明,菌落较厚,整体突起,表面粗糙,菌落边缘不整齐凹凸不平,菌落较粘稠,像鼻涕一样不容易被挑起。
2.2生理生化鉴定
温度对微生物生长的影响
5℃、50℃、55℃、60℃、65℃不长菌,15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃长菌,且20-40长势较好。
3号菌比较适宜的生长温度大概是20-45℃的范围。
(3号菌株不同温度下的生长情况)
糖类发酵试验(葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇)
木糖、阿拉伯糖、甘露醇均为阴性,葡萄糖:
24h,阴性;48h,变成黄色,布氏小管无气泡,记作“+”。
3号菌能利用葡萄糖,且反应产酸不产气。
(3号菌株葡萄糖发酵试验)
(3号菌株木糖发酵试验)
(3号菌株甘露醇发酵试验)
(3号菌株阿拉伯糖发酵试验)
VP试验
37℃培养12h之后,每管分别加入40%NaOH溶液15滴,并加等量α-奈酚,振荡试管,置37℃恒温箱中保温30min后,培养液呈红色,记为阳性(+)反应,说明3号细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸。
(3号菌株VP试验)
MR试验
37℃培养12h,取出试管,每管分别加入甲基红2滴,震荡,培养液不呈红色,记为阴性(-)。
(3号菌株MR试验)
吲哚试验
37℃培养12h,加入乙醚1ml,经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中,静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面,此时沿管壁缓慢加入10滴吲哚试剂,乙醚层呈现玫瑰红色,为吲哚试验阳性(+),即有吲哚存在。
(3号菌株吲哚试验)
淀粉水解试验
37℃培养12,然后将碘试剂完全浸于培养表面。
立即检视结果,琼脂培养基呈深蓝色、菌落或菌苔周围出现无色透明环,是阳性反应(+)即淀粉被分解,3号菌能产淀粉酶。
(3号菌株淀粉水解试验)
耐盐性试验
置37℃下培养12h,四个浓度梯度的高盐培养基都长菌了,其情况可表示为:
2+++,5+++,7++,10+(+表示菌落数目、大小)说明3号菌耐盐能力较高。
(3号菌株耐盐试验)
运动性试验
于37℃温箱培养12h,观察到没有产生树根状生长,是直立生长,说明该菌株无鞭毛。
酪素水解试验(酪蛋白水解)
37℃培养12h,记录菌落周围和下面酪素已被分解而呈透明,说明该菌株能水解酪素。
其透明圈的大小分别如下表:
编号
1
2
3
4
透明圈大小(cm)
2.5
2.6
1.7
1.9
透明圈大小(cm)
2.4
2.4
2.2
2.1
(3号菌株酪素水解试验)
酪氨酸水解实验
37℃培养12h,两个实验培养基,长满了成片的菌;空白对照培养基也长菌。
培养基被污染。
污染原因是酪素灭菌时报纸破了一点点,受到轻微污染。
卵黄反应试验
适温培养24h观察菌落四周和下面没有不透明的区出现,反应为阴性(—),表示卵磷脂没有分解生成脂肪,没有卵磷脂酶。
柠檬酸盐利用实验
置于37℃恒温箱中培养24h,培养基变蓝色,为阳性(+),表明该菌能利用柠檬酸盐作为碳源而生长。
硝酸盐还原实验
37℃培养l~4d,将A(磺胺酸冰醋酸溶液)和B(α-萘胺乙醇溶液)液等量混合后(约0.1mL)加入培养基内,无明显变化,为阴性(—)。
说明3号细菌不具有还原硝酸盐的能力。
明胶液化试验
穿刺接种,深度至明胶层2/3处,于37℃温箱培养12h.。
取出静置冰箱中待其凝固后,观察到被细菌液化,为阳性(+),说明3号菌能产生蛋白酶。
0.001%溶菌酶试验
培养12h后观察无抑菌圈的出现,为阴性反应。
3菌种鉴定
通过形态学鉴定,革兰氏染色、运动性试验、耐盐试验、温度试验、柠檬酸盐试验、硝酸盐还原试验、酪氨酸水解试验、酪素水解试验、糖发酵试验、VP试验、吲哚试验、明胶水解试验、0.001%溶菌酶试验等生理生化实验,对筛选得到的菌种各项生化指标进行测定,对照伯杰式细菌学手册的检索样式,对实验原始数据进行分析,3号菌株生化鉴定结果与芽孢杆菌属,蜂房芽孢杆菌的各项生理生化指标相同。
最终初步鉴定结果为:
3号菌株最有可能为蜂房芽孢杆菌。
本实验在菌株鉴定方面不够全面,除了形态学鉴定、生理生化鉴定,应该再做分子生物学(DNA)方面的相关鉴定才可以确定菌株的种属。
五、实验讨论
1、分离纯化
本次实验的分离纯化,进行了涂布、划线培养、淀粉培养基筛选培养、单染色、革兰氏染色、芽孢染色等步骤,耗时较长,但还是比较顺利的。
1.1涂布,不同稀释倍数的菌悬液含菌量有较大差异,10-2g/ml菌过多,难得得到易取的菌落,10-5g/ml几乎没有菌,10-3g/ml、10-4g/ml比较合适。
可作为实验经验用于以后的实验操作中。
1.2划线培养,一共进行了3次划线,每次培养时间均为12h,得到的菌落从后期的实验检验结果来看,得到的但菌落情况比较理想。
划线过程中,我的操作由生疏到熟练有了很大的进步,无菌操作也越来越好。
1.3淀粉培养基筛选培养,本组方案设计中,先进行“产淀粉酶”的菌株筛选,很大程度上减轻了实验压力。
实验结束之后,顿悟我们可以先筛选产淀粉酶的菌株再获得纯培养,按照我们组的实验情况(有二分之一的菌株能产淀粉酶)估计,我们可以极大程度上提高实验效率。
我们组分离纯化的过程,与同学对比,实验操作中的失误很少,污染控制很好,配合好,效率高效果好。
2、生化鉴定
本次实验对菌株进行了多项生理生化实验,其中像糖酵解、VP、MR等鉴定项目,以前的实验中接触过,所以比较了解,操作顺利,结果也很理想;但是像卵黄试验、溶菌酶试验等第一次接触,因为对培养基制备、反应原理等方面的不熟悉,所以真的花了很多功夫在这上面:
酪氨酸实验被污染,因为是50ML的锥形瓶,报纸包的比较少、比较薄,灭菌之后报纸破了一点点,实验后培养基全部被污染,真的实验当中一点点污染都不能存在;溶菌酶实验操作是出现问题,直接吧溶菌酶加到培养基中,比例不符,并不能看到抑菌圈现象。
实验过程中源于我们的合理分工和互相配合,效率很高,是两个班中最快完成所有实验的。
3、实验心得
本次微生物大实验真的和原来的任何一次实验都不一样,从实验设计到实验操作,从实验准备到试验后的清理工作,每个步骤完完全全都是由我们自己完成,虽然很辛苦,但是也正是因为每个步骤都要我们独立完成,真的学习到很多东西,各方面有了较大提升。
在微生物理论方面:
一方面,用实验的方法对自己所学的理论知识做一个巩固,加深了印象,有了更深入的理解;另一方面,每次遇到不懂的东西,自己都会独立的运用课本、文献去探究,强化了自主学习能力,而且现在也不会排斥文献了,反而觉得查文献是个好方法。
在实验操作方面,强化了自己科学高效的设计、开展实验的能力,提高了自身的实验技能。
当拿到一个课题的时候,实验设计无疑是一个难题,要查阅很多资料,尽可能优化简化实验;要考虑平行、对照等实验原则;甚至要注意什么时候用平板什么斜面这样的问题,面面俱到,细心谨慎。
进行实验的时候,无菌操作是绝对的重点,由于实验条件的限制,对我们操作的要求就更高了,一个不经意的动作很有可能带来污染,甚至导致前期的很多工作前功尽弃。
对于实验技能,我觉得没有大量的操作练习真的很难做好,刚开始实验的时候,单是一个接种就能状况百出,无菌室中一会打烂平板、一会烫到手、一会又是烧到棉塞,所以现在不管是配制培养基、倒平板,还是划线接种,甚至刷试管、洗平板,能够做到很熟练很顺畅的进行这些操作,真的我自己也会觉得很骄傲,付出了很多。
原来会觉得实验室里面的很多东西都很恐怖,像干热灭菌箱、湿热灭菌锅平时都会离得远远的,但现在掌握了它的实验方法之后,只要自己规范操作,又有什么好怕的呢?
在团队的交流与合作方面,这个真的是最值得骄傲的,我们组能够最快完成实验离不开队友的认真负责、甘愿付出。
虽然之前没有合作过,但是大家都很积极,晚上在食堂讨论实验方案,实验过程中主动承担实验任务,配合的真的很默契,各自发挥自己的特长,共同努力。
在这里,要特别感谢我们组的男生,主动承担培养皿灭菌这样的工作,一次两个小时,真的很不容易。
整个实验过程中,我们虽然牺牲一些休息、娱乐的时间,但是我们收获到的友谊、学习到的知识、掌握的实验技能,这些东西才是更宝贵的。
最后,特别想感谢一下我们的老师,在实验过程中,真的是随时在“骚扰”我们的老师,每次有问题就马上“陈老师,是不是这样的”“林老师,这个怎么处理?
”诸如此类的对话真的是数不胜数,我们组甚至在下班时间也会打电话给老师,真的特别谢谢老师的耐心指正和帮助,老师们辛苦了!
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- 张宣琪 土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选与鉴定 土壤 中产 淀粉酶 芽孢 杆菌 筛选 鉴定