配基结合或免疫学检测方法学验证指导原则LCWord格式.docx
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也要考虑到进行全面的分析方法的验证。
1.2部分验证
已经经过验证的分析方法变更时可考虑做部分分析方法的验证,部分验证的内容可以根据分析方法变更的程度从只进行日内精密度和准确度的考察到接近全面的分析方法的考察,实际操作中要结合实际情况,以达到客观、严谨的科研目的,确定部分方法学验证的内容。
部分方法学验证经常见于如检测方法的改变;
血浆样品采集中抗凝剂的改变;
同一种属的生物基质变化(例如人的血浆改变为人的尿液);
同一基质的不同种属变化(例如大鼠血浆到犬血浆);
相关线性浓度范围的变化;
分析仪器或分析软件工作站的改变;
样品采样量的限制而造成的分析方法过程中的变动(例如儿科中的药动学研究)等情况的分析方法。
1.3交叉验证
数据从相同或不同研究中的不同方法中获得,或数据从不同实验室的相同研究方法中获得,需要对这些数据进行比较,并进行交叉验证。
交叉验证中,相同的QC和样品需要用不同方法进行检测。
从不同方法获得的QC样品准确度相差?
15%内,经过校正可能更大。
至少67%的研究样品(studysample)的准确度相差?
20%以内。
交叉试验的结果决定了所得到的数据是否可靠,且是否具有可比性和可用性。
2、全面验证内容
2.1参考标准物(ReferenceStandards)
大分子是异构的,其效力和免疫反应可能会有所不同。
参考物质必须特征清楚和记录明确(例如分析和来源的考证)。
应选择当时最纯的参考标准物。
用于校准标准和QC样品准备的参考标准与非临床和临床研究使用的参考标准物为同一批。
在批次变化的情况下,首先要进行特征分析和生物分析评价,以确保该批次变化对试验的操作没有影响。
2.2特异性(Specificity)
结合试剂的特异性即试剂专一结合分析物的能力。
理想上的结合试剂是特异性的,与结构相关化合物(StructurallyRelated
Compounds)(内源性化合物、异构体、分析物的变体形式、或物理化学性质类似化合物)或者同时服用的其他药物没有交叉反应。
而在方法开发和验证过程中,却经常不提供这些“相关的分子”(RelatedMolecules)。
初始验证结束后,即表征分析物特点的的数据全部可用后,才进行结合试剂的特异性评估。
评估方式:
空白样品基质(从动物或者从没有接触过分析物的人中获得的基质)和分析物配制质控QC,并向QC中加入浓度逐渐上升的“相关分子”或者其他同时服用的药物,检测LLOQ和ULOQ中分析物浓度,准确度偏差应在?
25%以内。
2.3选择性(Selectivity)
在基质中存在不相关化合物(UnrelatedCompounds)的情况下,配基结合试验检测分析物的能力。
由于大分子固有的特异性,样品一
般是没有经过分离提取的。
基质中这些不相关的分子可能会影响分析物的配基结合检测。
选择性检测方式:
检测至少10个来源的样品基质配制的LLOQ或接近LLOQ浓度的样品。
样品基质必须包括脂血和haemolysed样品,建议还包括相关病人来源的基质。
选择性可在最容易出现问题的低端进行评估。
用高浓度分析物评估选择性系谨慎之举,但当干扰物有浓度依赖性时,更关键的是确定干扰物质干扰的最低浓度,并相应地校正LLOQ的浓度。
准确度偏差LLOQ在?
25%以内,其他应在?
20%以内,至少80%被检测基质满足上述要求。
2.4残留效应(Carry-overEffect)
在方法评价中,如果使用了仪器自动进样操作系统,在线性的最高浓度ULOQ被测试之后,必须测试试剂空白样品来评价残留效应(Carry-overEvaluation)。
其可允许接受的范围为空白样品的信号不大于LLOQ的20%,且不大于内标的5%。
2.5基质的选择(MatrixSelection)
由于复杂基质中高浓度的内源性结构相关化合物的过强干扰,导致有些未经过分离提纯的复杂基质中的大分子分析物无法准确检测。
尽管不建议使用提取基质(如用木炭或免疫吸附)或者其他替代基质(蛋白缓冲液或透析血清),但是在没有更好的方法定量分析物时,可以采取这些基质。
标准曲线需要用这些基质进行配制,QC样品应该用实际的样品基质进行配制,检测准确度以证明不存在基质效应。
2.6最小稀释倍数(MinimumRequiredDilution)
因为基质可能会出现一个高背景信号,因此有必要确定所需的最低稀释。
所需的最小稀释是指利用缓冲液稀释样品优化准确度和精密度所需要的最低稀释倍数,即能消除基质效应的样品最小稀释倍数。
检测时使用的基质与确定最小稀释倍数时使用的基质相同。
2.7标准曲线(CalibrationCurve)
标准曲线的响应是间接测定的,一般为非线性,呈现S型。
至少有6个非零浓度点构建标准曲线,每个样品至少2个重复。
浓度间隔大约均匀分布在对数刻度的预期范围之内。
除了校准标准之外,还需要有在定量范围之外的锚点,有助于曲线的拟合。
方法验证过程中,只要有6次独立批次的标准曲线,并用表格形式总结,确定标准曲线回归模型的整体稳固性。
由于制备过程中的技术性错误(如移液错误),某个标准点可能从曲线上被排除。
标准曲线上各浓度点的反算浓度的准确度偏差在?
20%以内,LLOQ和ULOQ准确度偏差在?
25%以内,至少75%浓度点满足该条件。
锚定校准不需要符合上述验证标准,因为超过了曲线的定量范围。
2.8精密度和准确度(PrecisionandAccuracy)
用于评估精密度和准确度的QC样品应新鲜配制,但需要经过冷冻处理,以保持和分析的样品保持统一。
至少有5个QC样品浓度点(LLOQ、3倍以内LLOQ、中浓度、高浓度和ULOQ),以评估准确度、精密度和总体误差。
验证必须模仿样本分析的操作,如果样品检测时测2次(用2个孔),那么验证时QC也应该测2次(用2个孔)。
在几天内进行至少6次独立测定,以确定批间精密度和准确度。
批内和批间准确度在各浓度点,平均浓度的准确度偏差在标称值的?
20%以内,LLOQ和ULOQ在?
批内和批间的各浓度点的精密度在20%以内,LLOQ和ULOQ在25%以内。
另外,每个浓度点的总体误差,即相对误差,(RE%)和变异系数%(CV%)的绝对值的总和不超过30%((,RE,%+CV%)>
30%),LLOQ和ULOQ不超过40%。
2.9稀释线性(DilutionalLinarity)
由于校准标准曲线的范围狭窄,当样品分析物的浓度超过了定量范围(超过ULOQ),用空白基质对其进行稀释使其浓度在定量范围之内,以至于可以准确测定样品中分析物的浓度。
这种稀释需要利用QC进行验证。
另外一个原因是避免Hook效应,即高浓度分析物造成的信号抑制。
不同稀释度的反算浓度乘以稀释度以后,偏差在标称值的?
20%以内,所有稀释的最后反算浓度之间的精密度20%以内。
2.10平行性试验(Parallelism)
如果研究样本允许,校正标准曲线和供试样品的系列稀释可以做平行测试,以评估可能存在的基质效应或代谢物的亲和差异性。
高浓度样本(接近Cmax)用空白基质至少稀释3个浓度梯度。
稀释系列的样品间CV%不高于30%。
2.11稳定性检测(StabilityoftheSamples)
稳定性的评价应保证在样品的制备、分析以及保存过程中,对分析物的浓度没有影响,主要包括基质、抗凝血剂、容器材料、储存和分析条件等。
基质稳定性:
应采用低QC和高QC样品在制备好之后立即分析进行评价,根据新制备的标准曲线计算,得到的平均浓度结果偏差不超过20%。
冻融稳定性:
QC样品在期望的冷冻温度下保存,然后再室温下或操作温度下融解,完全融解后,再在相同条件下冷冻。
每一个过程中,冷冻至少12个小时。
冻融次数应不低于实际测量是对样品的冻融次数。
长期稳定性(基质中冷冻):
QC样品应在与研究中样品相同的冷冻条件下,放置更长的时间进行评价。
对于大分子物质(肽或蛋白质等),需在每一个温度点进行分析确定稳定性。
储存液和工作液稳定性:
不必测定每个浓度的稳定性,确定一个较高和较低的样品的稳定性后,即可认为之间浓度的样品稳定。
准确度偏差应在?
2.12试剂(Reagents)
关键性试剂包括结合试剂(如结合蛋白,适体,抗体或标记的抗体)和那些含有酶基团,对检测结果有直接影响,因此必须保证其质量。
因此,在验证或样品分析过程中试剂批次改变时,必须先核实,以确保该批次与原批次或前一批次得到的结果一致。
因为试验条件保证了非关键试剂(如缓冲区,稀释剂或酸化试剂)的稳定性和关键试剂的稳定性,因此试验条件需要有记录,以确保操作方法不会随着时间而受影响。
2.13商业试剂盒(CommercialKits)
商业试剂盒已经不局限于药代动力学的研究了。
因此,商业试剂盒需要重新验证,以确保LLOQ和QC在实际浓度范围内用于样品分析的准确性和精确性。
上面列出的验证原则适用。
3、样品检测(AnalysisofStudySamples)3.1分析运行(AnalyticalRun)
配基结合试验用的最多的是微孔板。
每个分析批次可能包括几块板,但是每个板中必须包括独立的标准曲线和质控样品,用来权衡板与板之间的差异性。
在有些板上可承载的样品数量是有限的。
可以将同一套标准曲线分别放在第一块和最后一块板上,QC样品每个板上都有。
建议每个研究样品有重复,即一个样品用2个以上的复孔。
3.2分析的接受标准(AcceptanceCriteriaforStudySampleAnalysis)
一个目标的所有样品在一次分析中完成。
标准曲线各浓度点准确度偏差在?
25%以内,至少75%浓度点满足上述要求。
一次测定中至少包括3个质控样品浓度点(低、中、高)双样本,准确度偏差在?
20%以内,至少67%的质控样品满足该条件,同一浓度点至少50%满足条件。
质控QC检测孔数目模仿研究样品的数目。
3.3样品复测(ReanalysisiofStudySample)
可能需要复测样品的原因可能有:
某批次检测的标准曲线或者质控QC样品的准确度不能满足可接受的标准;
检测得到的样品浓度高于ULOQ或低于LLOQ;
仪器故障等。
对于生物等效性研究,通常是由于药代动力学的原因重复分析样
本是不能接受的,因为这可能会影响研究结果和使结果发生偏见。
在这种情况下,复测可能会被当作实验室调查的一部分,用于调查异常结果发生的原因,并防止今后类似问题再次发生。
复测样品、原始数据、复测的原因、复测的数据、最后采用的数据和采用的原因都必须详细注明。
4、已测样品抽测(IncurredSampleReanalysis)
在方法验证过程中使用的校准标准物和QC样品可能无法模仿实际的研究样品。
蛋白结合物质的差异、已知和未知代谢物的反算、样品的不均匀性或同时使用的药物都可能会影响处理和储存过程这些样品中分析物的准确性和精确度。
因此,建议在不同天独立再分析已测样品的准确度,以说明检测的可重复性。
若样品数少于1000,则10%样品需再测定,若样品数多于1000,则5%样品再测定。
建议重复测定的样品中需要有C附近和消除期max的样品。
原测值和新测值与两者平均值的偏差在?
30%以内,至少67%符合上述要求。
如果已测样品再分析发生巨大偏离,应该进行调查。
出现以下情况之一,需要进行已测定后再分析:
每个物种只进行一次毒代动力学;
所有重要的生物等效性试验,第一次在受试者上进行的临床试验;
第一次在患者上的试验;
第一次在肝脏或肾脏受损患者身上的试验。
动物研究中,已测样本再分析只需在早期研究工作中做,如果这些试验在剂量和浓度等关键试验中具有代表性。
样品不能来源太集中,否则可能会检不出异常情况。
5、FDA(2001)方法学验证及其与EMEA(2011)的比较
FDA是食品和药物管理局(FoodandDrugAdministration)的简称,在中国,因为其标准比较高,因此多以美国FDA为最高准则。
另外,EMEA研究制定一系列药事法规通过欧盟国家的实施,形成欧洲很重要的法律章程,而欧盟各国又根据EMEA的法规制定本国相应的药事法。
以下对EMEA和FDA在配基结合或免疫学检测方法学验证的内容、方法和接受标准进行了比较,见表1。
表1EMEA与FDA在方法学验证上的比较
EMEAFDA
选择性在基质中存在不相关化合物分析物非相关物质的基质效应:
(unrelatedcompounds)的情况下,
(1)分别用生物源溶液和缓冲液
配基结合试验检测分析物的能力。
配制标准曲线检测基质效应。
检测至少10个来源的样品基质配制
(2)平行稀释样品和标准品检测
的LLOQ或接近LLOQ浓度的样品。
基质效应。
25%以内,其(3)确定非特异性结合。
他应在?
20%以内,至少80%被检测生化性质相似物质的干扰:
基质满足上述要求。
(1)代谢产物、同时服用的药物,特异性结构相关化合物或者同时服用的其或内源性化合物的交叉反应的需
他药物没有交叉反应。
要结合分析物单独评价。
用空白基质和分析物配制质控QC,
(2)如果可能的话可以有评价标
并向QC中加入浓度递增的“相关分准。
子”或者其他同时服用的药物,检测(3)利用研究样品评价参考标准
LLOQ和ULOQ中分析物浓度,准物的稀释线性。
确度偏差?
-残留空白样品的信号不大于样品LLOQ
效应的20%,并不大于内标的5%
最小稀能消除基质效应的样品最小稀释倍见选择性。
未说明操作内容和具释倍数数体标准。
标准至少6个非零浓度点。
锚点。
至少6个非零浓度点。
4阶或5曲线6次独立批次。
准确度?
20%,LLOQ阶模型。
包括LLOQ在内
和ULOQ?
25%。
至少75%浓度点满至少6-8个非零样品。
LLOQ偏
足要求。
差?
20%,其他?
15%,至少67%
浓度点满足要求。
精密度QC冷冻处理;
至少5个QC浓度点;
3个QC样品浓度点,每浓度5准确度每浓度5重复。
几天内至少6次独重复。
至少67%样品满足准确度
立批次;
平均浓度的准确度?
20%,偏差在?
15%以内,同一浓度至少
LLOQ和ULOQ?
批内和批间一个样品满足条件。
在建立方法
的精密度?
20%,LLOQ和ULOQ试验中采用在数天至少进行6次
在?
各浓度点的独立批次验证,每一批4个QC
(RE%+CV%)>
30%,LLOQ和浓度:
LLOQ,低QC、中QC和
ULOQ不超过40%。
高QC。
稀释不同稀释度的反算浓度乘以稀释度见“选择性”。
未说明操作内容和线性以后,偏差在标称值的?
20%以内,具体标准。
所有稀释的最后反算浓度直接的精
密度?
平行高浓度样本(接近Cmax)用空白基见“选择性”。
未说明操作内容和试验质至少稀释3个浓度梯度。
稀释系具体标准。
列的样品间CV%不高于30%。
稳定性低QC(3*LLOQ)和高QC(接近至少3个等体积(每个体积适合
ULOQ)准确度偏差?
20%。
3次试验)的低浓度和高浓度。
冻融稳定:
冷冻至少12h。
冻融循环冻融稳定:
冷冻12-24h,冻融3
不低于研究样品冻融次数。
个循环后分析;
短期稳定:
在室温或者操作温度下短期稳定:
室温下4-24h后分析。
稳定性。
长期冷冻稳定:
冷冻超过样品储
长期冷冻稳定:
每个温度都必须验存时间。
证稳定性。
存储稳定:
样品至少在室温中保
存储液稳定性和工作于稳定性。
持6h后分析。
-回收率考察低、中、高3个浓度的提取
回收率。
虽然回收率不能达到
100%,但是需要保持一致性、精
确性和可重复性。
试剂关键性试剂(包括结合试剂和含有关键试剂,如抗体,示踪,参考
酶基团),对检测结果有直接影响,标准物,和基质必须性征明确,
因此必须保证其质量。
试剂批次改并在规定条件下储存。
变时,必须先验证核实。
非关键试剂(如缓冲区,稀释剂或
酸化试剂)储存条件需要有记录,
以确保操作方法不会随着时间而受
影响。
样品标准曲线各浓度点准确度偏差标准曲线样品至少75%浓度点准检测?
20%,LLOQ和ULOQ在?
25%,确度偏差?
15%以内(包括
至少75%浓度点满足要求。
ULOQ),LLOQ为?
一次测定中至少包括3个QC浓度一次测定中至少包括3个QC浓
点(低、中、高),或者不小于总样度点(低、中、高),或者不小于
品数目的5%。
准确度偏差?
20%,总样品数目的5%。
至少67%QC
至少67%QC满足该条件,同一浓度满足偏差?
15%,不符合点不能是
点至少50%满足条件。
同一浓度的。
-已测样原测值和新测值与两者平均值的偏
品抽测差在?
30%以内,至少67%符合上述
要求。
6、报告(Reports)
6.1方法学验证报告(ValidationReport)
验证报告至少包括以下内容:
方法验证总结,分析方法来源(参
考文献),方法操作细节(分析物、内标、样品预处理、提取和分析),标准样品信息,标准曲线样品和质控样品(基质、抗凝剂、制备、制备日期和储存条件),可接受范围,分析(测定时间、是否通过和失败原因,标准曲线数据,质控数据,稳定性数据,选择性数据,LLOQ数据,残留数据,基质效应数据,稀释完整性数据)。
6.2分析报告(AnalyticalReport)
报告至少包括以下内容:
标准样品信息,标准曲线和质控样品储存条件,可接受范围,操作步骤,样品跟踪,样品分析(每次检测样品、日期和结果表格,每次检测标曲结果表格,每次检测QC样品结果表格,失败的检测,与验证方法的差别,重复测定)。
提交20%受试者样品测试的色谱图复印件,包括相应分析批的标准曲线和QC样品的色谱图复印件。
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- 结合 免疫学 检测 方法 验证 指导 原则 LC