荧光定量实验报告.doc
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荧光定量实验报告.doc
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RT-qPCR比较不同样本中miR-21的相对表达差异
一、实验目的
1、掌握实时荧光定量PCR的实验原理。
2、掌握实时荧光定量PCR相对定量的分析方法。
二、实验原理
实时荧光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。
通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。
荧光定量PCR最常用的方法是DNA结合染料SYBRGreenⅠ的非特异性方法和Taqman水解探针的特异性方法。
本实验中采用非特异性SYBRGreenI染料法,SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料,在游离状态下会发出微弱的荧光,但一旦与双链DNA结合后,荧光大大增强。
因此,SYBRGreenI的荧光信号强度与双链DNA的数量相关,可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。
三、实验仪器、材料和试剂
实验仪器:
PCR仪、荧光定量PCR仪
实验材料:
MCF7细胞
实验试剂:
逆转录试剂盒、SYBRGREEN试剂盒
四、实验步骤
MCF7细胞RNA提取(RNAisoPlus)
1)将生长至80%的MCF细胞消化为单细胞悬液,准备提取RNA;
2)9000g,2min离心,弃掉培养基,加1mlRNAisoPlus用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀,室温(15-30℃)静置5分钟;
3)加入氯仿(RNAisoPlus的1/5体积量),盖紧离心管盖,混合至溶液乳化呈乳白色,室温静置5min;
4)12,000g4℃离心15分钟。
从离心机中小心取出离心管,此时匀浆液分为三层,即:
无色的上清液(含RNA)、中间的白色蛋白层(大部分为DNA)及带有颜色的下层有机相。
5)吸取上清液转移至另一新的离心管中(切勿吸出白色中间层)。
6)向上清中加入倍RNAisoPlus体积的异丙醇,上下颠倒离心管充分混匀后,室温下静置10分钟。
7)12,000g4℃离心10分钟。
一般在离心后,试管底部会出现RNA沉淀。
8)弃上清,加入1mlDEPC水配制的75%乙醇,充分洗涤管盖和管壁,并轻弹管底,让沉淀浮起来,并静置3-5min;
9)打开离心管盖,室温干燥沉淀几分钟。
沉淀干燥后,加入适量(可以根据沉淀的多少确定)的RNase-free水溶解沉淀。
测浓度,记录A260/280。
1%琼脂糖凝胶电泳(取少部分进行跑电泳,留足够的量做反转录)
反转录
试剂
体积(10μl)
RNA
500ng
Genespecificprimers(2μM)RTprimer
1μl
5×ReverseTranscriptaseM-MLVBuffer
2μl
dNTP(10mM)
μl
ReverseTranscriptaseM-MLV
μl
Inhibitor(40U/μl)
μl
RNase-FreeWater
Upto10μl
反应条件:
温度:
42℃,45min;70℃,15min.
qPCR
试剂
体积(20μl)
2×SYBRGreen
10μl
FP(10μl)
μl
RP(10μl)
μl
cDNATemplate
1μl
RNase-freeWater
8μl
反应程序:
1)stage1:
预变性,95℃,3min;
2)Stage2:
循环反应:
40个循环
95℃,10s;
60℃,30s
3)溶解曲线:
95℃,15s;60℃,1min;95℃,15s.
五.实验结果及分析
RNA的质量检测结果
ng/ul
260/280
260/230
扩增曲线:
溶解曲线:
如图,为单一的峰,说明无非特异性产物,定量准确。
实验结果及数据处理
PCR反应结束后,得到如下数据:
SampleName
TargetName
Reporter
Cт
CтMean
MCF7
miR21
SYBR
16.
16.
MCF7
miR21
SYBR
16.
MCF7
miR21
SYBR
MCF7
miR-130b
SYBR
22.
22.
MCF7
miR-130b
SYBR
MCF7
miR-130b
SYBR
22.
MCF7
GAPDH
SYBR
13.
MCF7
GAPDH
SYBR
13.
MCF7
GAPDH
SYBR
13.
注:
平行样的Ct值之间的差<时表示重复性较好
计算如下:
ΔCT(miR21)=
ΔCT(miR130b)=
ΔΔCT=ΔCT(miR21)-ΔCT(miR130b)
=
miR21的表达量是miR130b的倍
六.问题与思考
1.设计本次实验miR-21和miR-130b的RT-qPCR引物?
miR21:
TAGCTTATCAGACTGATGTTGA
茎环引物:
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAACA
FPrimer:
AGCGTAGCTTATCAGACTGATGTTG
RPrimer:
CGCAGGGTCCGAGGTATTC(通用引物)
引物Blast结果:
miR130b:
CAGTGCAATGATGAAAGGGCAT
茎环引物:
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATGCCC
FPrimer:
CAGTGCAATGATGAAAGGGCA
RPrimer:
CGCAGGGTCCGAGGTATTC(通用引物)
引物Blast结果:
2.荧光定量PCR与普通PCR有什么异同点?
原理不同:
荧光定量PCR实时监测与DNA结合的荧光染料激发的荧光;普通PCR通过检测插入DNA中核酸染料的量来测定PCR最终产物量,一般是紫外光。
反应要求不同:
荧光定量对扩增片段有较高的要求,一般为100-300bp;普通定量可以扩增长点的片段。
如果不需要检测产物分子量大小,荧光定量可以不进行电泳就对产物进行定量分析,普通PCR必须电泳。
结果不同:
荧光定量可以实现精确定量,普通PCR则不行。
荧光定量体现可以看到整个扩增过程,可以看到扩增效率,溶解温度,直接得到的标准曲线等,这些是普通PCR无法实现的。
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