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实验报告western
摘要
我们试验中对目的基因AKP进行了克隆和表达,并分析了表达产物的活性。
我们利用PCR方法扩增目的基因并提取大肠杆菌质粒,对扩增产物和质粒进行琼脂糖凝胶电泳分析,琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR扩增产物和质粒纯度符合实验要求;对质粒DNA和目的基因AKP进行双酶切后用琼脂糖凝胶电泳分析结果,并回收酶切产物以及连接载体和AKP,Ca2+诱导法将连接产物转化到感受态细胞;利用菌落特征和琼脂糖凝胶电泳分析结果筛选重组子;对确定正确的重组子用Ca2+诱导法转化,提取表达产物;对表达产物(AKP)进行酶活性检测,结果显示表达产物活性显著高于对照组;SDS-PAGE检测和蛋白印迹显示目的基因AKP成功表达。
关键词:
目的基因AKP,表达产物
ABSTRACT
Inourtest,weclonedandexpressedthegeneofAKP,andanalysistheactivityoftheproductofexpression,Wemakeuseofthepolymerasechainreaction(PCR)toproductpurposegeneandextracttheE·coliofplasmid,usingagarosegelelectrophoresisanalysistheproductofPCRandplasmid,theresultsshowthatthepurityoftheproductofPCRandplasmidcomplywiththerequirements;usingenzymecuttheplasmidDNAandpurposegene(AKP),then,analysistheresultsofenzymecutwithagarosegelelectrophoresisandrecyclingenzymeproducts,afterthat,weconnectthecarrierandtheAKP,usingCa2+puttheproductsofconnectintothefeelingstatecells;wescreeningreconwiththefeaturesofcoloniesandtheresultsofagarosegelelectrophoresis;wetransformtherightreconintothefeelingstatecellswithCa2+,then,wecollecttheproductsofexpression;wetesttheAKPontheactivityenzyme,theresultsshowusthattheactivityofenzymeissignificantlyhigherthanthecontrolgroup;thetestofSDS-PAGEandWestern-blotshowthatthegeneofAKPexpresssuccesses.
KEYWOEDS:
purposegeneofAKP,theproductsofexpression
一、引言
1PCR技术原理
1.1聚合酶链式反应(polymerasechainreaction):
简称PCR技术,是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。
它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点;能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。
PCR原理示意图如图一。
图一:
PCR原理示意图
1.2PCR反应参数
1)变性:
94℃下预变性2-10min,一般变性温度与时间为94℃1min。
对于富含GC的序列,可适当提高变性温度.但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。
2)退火:
引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成,引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度.实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5℃。
3)延伸:
延伸反应通常为72℃,接近于TaqDNA聚合酶的最适反应温度75℃.实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为TaqDNA聚合酶的作用温度范围可从20℃-85℃.延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度.在一般反应体系中,TaqDNA聚合酶每分钟约可合成1kb长的DNA。
延伸时间过长会导致产物非特异性增加.但对很低浓度的目的序列,则可适当增加延伸反应的时间。
一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物,这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。
4)循环次数:
当其它参数确定之后,循环次数主要取决于DNA浓度。
一般而言25-30轮循环已经足够。
循环次数过多,会使PCR产物中非特异性产物大量增加,在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。
1.3扩增条件的优化
1)优化反应参数:
退火温度和时间、变性温度和时间
2)优化Mg2+浓度
3)模板的纯度,优化模板浓度(含有污染物等)
4)优化dNTP的浓度
5)优化引物浓度(一般是10pmol/L)
6)PCR仪:
热盖、升降温速度、精度
7)PCR管的质量等
2核酸的凝胶电泳
1)电泳:
带电粒子在电场中的涌动现象
a)丙烯酰胺凝胶电泳,5bp—500bp(分辨率高,1bp)
b)琼脂糖凝胶电泳,200bp—50kb(分离范围广、方便)
2)琼脂糖介质结构均一,含水量大(98-99%),可通过调整琼脂糖的浓度改变孔径的大小,起到分子筛的作用。
3)空隙大小决定其分辨分子大小的能力。
a)空隙小,分辨率高:
小分子较易通过,大分子难通过
b)空隙大,分辨率低:
大小分子几乎以同等速率通过
4)核酸为两性分子,在pH3.5时,碱基上的氨基解离而磷酸基团中只有第一个磷酸解离,整个分子带正电;pH=8左右时,碱基几乎不解离,而磷酸全部解离,整个分子带负电
5)在碱性环境下,不同的核酸分子由于具有相同的磷酸戊糖结构,几乎具有相同的电荷密度,其电泳行为与SDS-PAGE类似,线性分子在凝胶中的迁移率与其所含碱基对数目的对数值成反比。
可以近似用于估算分子的大小。
6)胶浓度与适用线性DNA分离范围,见表一。
胶浓度(%)
线性DNA分离范围(kb)
0.3
5-60
0.6
1-20
0.7
0.8-10
0.9
0.5-7
1.2
0.4-6
1.5
0.2-4
2.0
0.1-3
表一:
胶浓度与适用线性DNA分离范围
7)常用电泳缓冲液:
1×TAE
8)上样缓冲液:
增加样品密度、使样品带颜色,起指示作用、本身有一定迁移率,指示相对位置
9)常用染料:
a)SYBR:
新型低毒,高灵敏度荧光染料,可直接加入样品中,价格较昂贵,对DNA的迁移率有一定的影响
b)GoldViewTM:
无明显的致癌作用灵敏度与EB相当,加入胶中5uL/100mL胶,紫外灯下双链DNA呈现绿色荧光而单链DNA呈现红色荧光。
对皮肤、眼睛有刺激,操作时带手套。
3载体(vector)
1)基因工程中,携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具称为载体。
2)载体的特点:
a)自我复制:
复制子,是一段特殊结构的DNA序列,载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖。
b)筛选标记:
有一个或多个利于检测的遗传表型,如抗药性、显性表性反应。
c)合适的限制酶切位点,便于外源基因插入
d)适当的拷贝数,以便于载体的制备和克隆基因的剂量增加
3)目前载体主要有:
a)大肠杆菌中的质粒:
pUC19、pBR322、pETBlue-2等
b)噬菌体载体:
λ噬菌体、M13噬菌体
c)酵母人工染色体载体
d)动、植物病毒载体
4质粒pETblue-2(3653bp)
4.1质粒pETblue-2图谱如图二。
图二:
质粒pETblue-2(3653bp)图谱(lacoperator,T7promoter,E.colipromoter,lacZα-peptideORF,multiplecloningregion,His•Tag®codingsequence,HSV•Tag®codingsequence,f1origin,pUCorigin,blacodingsequence)
4.2pETBlue-2系统的优点:
1)在E.coli中克隆目的基因:
Ori、MCS、lacZα-peptideORF、ApR
2)在E.coli中表达重组蛋白:
受噬菌体T7强转录及翻译信号控制;表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。
在非诱导条件下,目的基因处于沉默状态而不转录。
4.3NovaBlue宿主菌
1)Genopyte:
endA1hsdR17(rK12–mK12+)supE44thi-1recA1gyrA96relA1lacF′[proA+B+lacIqZΔM15:
:
Tn10(TetR)
2)非表达宿主菌,常规克隆,制备质粒
3)NovaBlue适合用作初始克隆宿主菌的K-12菌株,具有高转化效率、蓝/白斑筛选能力(与合适质粒)和导致优质质粒DNA高产的recAendA突变。
由于存在F附加体编码的lacIq阻遏蛋白,NovaBlue的DE3溶原菌是一个非常有用的严紧型宿主菌。
5DNA重组
1)外源DNA分子与载体的连接就是DNA重组,这样重新组合的DNA称为重组体或重组子。
重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经酶切的载体分子和外源DNA分子进行连接。
DNA连接酶有两种:
T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。
两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能,而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌连接酶没有的特性,即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来的功能。
但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低,一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
2)影响重组效率的因素
a)酶切效果
b)载体和目的基因的比例(1:
3-10)
c)细菌的生长状态(5x107个/mL)
d)感受态细胞的质量
e)试剂的质量
f)外源DNA的质量与数量
g)污染—尽量所有打开器皿盖的操作都在超净台中进行
h)器皿的洁净度
6连接产物转化克隆菌株
1)细菌处于0度,二价阳离子CaCl2存在的低渗溶液中,细菌膨胀成球形,处于感受态。
2)此时转化混合物中的外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面。
重组DNA加热在42度的短时间的热冲击下吸附在细胞表面,进入细胞。
3)在丰富培养基中生长数小时后,球状细胞恢复原状并繁殖。
4)转化的确切机制还不清楚。
5)优点:
简单、稳定、可重复性高。
转化效率为105~106/ugDNA
6)缺点:
转化效率稍低,而且不能转化大质粒(>15Kb)。
7)转化过程见图三。
图三:
转化示意图
7表达产物(AKP)的酶活性检测
1)碱性磷酸酶简介:
大肠杆菌碱性磷酸酶(E.colialkalinephosphatase)也称大肠杆菌碱性磷酸酯酶,简称AKP/ALP,EC.3.1.3.1)在碱性环境下能水解多种磷酸单酯化合物的酶,需要镁和锰离子为激活剂。
2)对硝基酚磷酸(pNPP)为含磷化合物,能被AKP水解为对硝基酚(pNP)和游离的磷酸基团。
对硝基酚磷酸在碱性条件下为无色化合物而对硝基酚则为黄色化合物,在410nm处有光吸收值,利用此反应的颜色变化可以测定AKP的酶活性。
3)AKP测活原理如图四。
图四:
AKP测活原理示意图
4)比尔-朗伯定律:
ODλ=єLC【Єpnp=17500Lmol-1cm-1;C:
光吸收物质的浓度(mol·L-1);L:
光路长度(cm)】
8变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
1)SDS在溶液中能破坏蛋白质分子内和分子间的非共价键,β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)的作用使蛋白质分子中的二硫键打开,二者的作用使蛋白质变成单亚基并结合上SDS形成蛋白质-SDS复合物,由于SDS带有大量的负电荷,掩盖了蛋白质原有的电荷
2)SDS与蛋白质的结合,改变了蛋白质原有的构象,变成了近似于雪茄烟形的长椭圆棒,其短轴长度一样,而长轴与分子量大小成正比
3)SDS-PAGE中,SDS-蛋白复合物的迁移率不再受蛋白的电荷和形状的影响,而只与蛋白质的分子量正相关
4)用途:
亚基分子量的测定,变性蛋白的分离,蛋白纯化中的质量控制等
9蛋白质免疫印迹(Westernblotting)
1)印迹(blotting)是70年代中后期出现的一种生化技术,类似于吸墨迹的过程
2)常需要和各种凝胶电泳、转移、固定化、分子杂交及许多灵敏的检测技术相匹配而进行
3)广泛应用于DNA、RNA、蛋白质、抗原、受体糖蛋白等多种生物大分子的研究
4)Westernblotting,免疫印迹,与Northern杂交与Southern杂交类似,但Western采用的是PAGE电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。
5)Western印迹技术的基本过程:
a)蛋白质的凝胶电泳分离:
蛋白质印记的第一步,一般是将蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,使待测蛋白质按分子大小在胶上排列。
b)蛋白区带的电转移和固定:
第二步是将凝胶电泳分离的蛋白质区带用电转移法或其它方法转移到特殊的固相载体上,并牢固地结合于固相载体上形成并保持与相应的抗原或抗体特异性结合的特性,经得起各种处理的稳定的蛋白条带。
现在固相载体用的较多的是NC膜和一种尼龙衬底的膜(ZB膜),它们和生物大分子都是非共价形式吸附结合。
c)免疫印迹显色:
通过抗原抗体的特异性结合检测转移到载体上的蛋白质区带。
将印迹有蛋白质区带的固相载体与特异性的抗体或单克隆抗体温育,再与酶、荧光素或同位素标记的特异抗体的二抗反应,最后通过底物的显色反应、荧光检测、放射自显影等方法显示目的蛋白的存在和相对分子大小。
d)转移:
虹吸作用转移、真空转移、电转移。
半干式转移装置见图五。
图五:
转膜示意图
e)检测:
印迹在载体膜上的特异抗原的检出依赖于抗原抗体亲和反应。
一般经过封闭、一抗结合、二抗结合、显色等步骤。
一抗对抗原是特异的。
酶标二抗是商品化的,对某种动物的一抗都可以反应,这是因为Ig的恒定区在同一种动物Ig同一型轻链和重链中是比较恒定的具有相同的抗源性。
二抗常用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素、同位素等标记。
辣根过氧化物酶的底物有DAB(二氨基联苯氨),OPD(邻苯二氨)等。
示意图如图六。
图六:
检测过程示意图
二、实验材料、试剂及仪器设备
1实验材料
大肠杆菌、NovaBlue菌、氯仿、异戊醇、酚、葡萄糖、Tris-HCl、EDTA、NaOH、乙酸钾、冰醋酸、水、胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、乙醇、生理盐水、甘油、甘氨酸、甲醇、R-250、K2HPO4、脱脂奶粉、DAB、H2O2、柠檬酸钠
2主要试剂
LB液体培养基、LB固体培养基、表达培养基、SDS储液、组织匀浆液、酶解液、5x电泳缓冲液(pH8.3)、印迹缓冲液(pH8.3)、R-250染色液、封闭液、显色底物、变性溶液、中和缓冲液、马来酸(顺丁烯二酸)缓冲液、洗涤液、检测缓冲液
3部分试剂的配制
试剂
配方
LB液体培养基40mL
胰蛋白胨(tryptone)0.4g
酵母提取物(yeastextract)0.2g
NaCl0.4g
(加入40mL水溶解后加8μL5mol/LNaOH,混匀)
组织匀浆液pH8.0
10mmol/LTris.HCl
25mmol/LEDTA
100mmol/LNaCl
酶解液pH8.0
20mmol/LTris.HCl
50mmol/LEDTA
200mmol/LNaCl
200ug/mL蛋白酶K
1%SDS
表达培养基200mL
胰蛋白胨2.4g
酵母提取物4.8g
氯化钠2.0g
葡萄糖2.0g
甘油1.2mL
5x电泳缓冲液(pH8.3)600mL
Tris9.0g
Gly43.2g
SDS3.0g
(室温存放)
溶液Ⅰ(pH8.0)
50mmol/L葡萄糖
25mmol/LTris-HCl
10mmol/LEDTA
溶液Ⅱ(必须新鲜配制)
0.4mol/LNaOH和2%SDS用前等体积混合
溶液Ⅲ100ml
5mol/L乙酸钾60ml
冰醋酸11.5ml
水28.5ml
印迹缓冲液(pH8.3)2000mL
Tris6.06g
Gly28.8g
甲醇400mL
(使用时现加甲醇)
R-250染色液200mL
(棕色瓶保存)
R-2500.2g
95%乙醇84mL
冰醋酸20mL
双蒸水96mL
10xPBS
0.2mol/LK2HPO4
1.5mol/LNaCl
用HCl调节pH至7.4
封闭液
5%脱脂奶粉(用1xPBS配制)
显色底物150mL
1xPBS150mL
DAB200mg
H2O2300uL
(用时加入)
20×SSC
3mol/LNaCl
0.3mol/L柠檬酸钠
用2mol/LHCl调pH7.0
变性溶液
0.4mol/LNaOH
2mol/LNaCl
中和缓冲液
0.5mol/LTris-HClpH7.2
1mol/LNaCl
马来酸(顺丁烯二酸)缓冲液
0.1mol/L马来酸-NaOHpH7.5(20℃)
0.1mol/LNaCl
检测缓冲液
0.1mol/LTris-HClpH9.5(20℃)
0.1mol/LNaCl
表二:
试剂配方
4仪器
PCR仪、离心机、分光光度计、恒温水浴箱、稳压稳流电泳仪、水平电泳槽、垂直电泳槽、蛋白转移槽、数字化凝胶成像分析仪、超声细胞破碎仪、灭菌锅、恒温培养箱、摇床、PH计、电子天平
三:
实验步骤
1目的基因PCR扩增及扩增产物的回收
1.1PCR扩增目的基因AKP
1.1.1在0.2mlPCR管内配制50uL反应体系
双蒸水35.7uL
2.5mmol/LdNTP4uL
10xbuffer5uL
引物sense(10umol/mL)2uL
Antisense2uL
模板DNA1uL
Ex-TaqE0.3uL(1.5U)
1.1.2按下述程序进行扩增
1)94℃预变性5min
2)94℃变性1min
3)55℃退火1min
4)72℃延伸1min
5)重负步骤2)—4)30次
6)72℃补齐10min
1.2琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果
配制0.8%琼脂糖凝胶电泳(1×TAE),50uLPCR扩增产物+6uL10×loading-buffer,10uLmarker,恒压80v。
凝胶成像仪观察记录电泳结果。
1.3扩增产物的回收
1)切胶、称胶重(减重法)
2)每100mg胶加入500uL溶胶液,55℃溶胶
3)将溶解的胶液体转移至吸附柱,12000rpm离心30秒,去除废液
4)漂洗:
向吸附柱的正中央加入500uL漂洗液,12000rpm离心30秒,去除废液
5)重复漂洗一次去除废液。
6)空柱12000rpm离心2min,以彻底去除废液
7)将吸附柱置于一新的干净无菌的1.5mLEP管中,向吸附柱的正中央加40uL洗脱buffer,室温放置5分钟。
12000rpm离心30秒,以洗脱DNA。
8)再次向柱子的正中央加10uL无菌水,室温放置5分钟;12000rpm离心2分钟。
合并回收液。
9)SYBR检测回收产物
10)﹣20℃保存产物
2质粒DNA的提取及其定性定量分析
2.1质粒DNA的提取
1)先在3mlLB液体培养基中加入3uL羧苄(终浓度是50ug/mL)、10uL四环素(终浓度是12.5ug/mL),然后接入一个含pETBlue2质粒的大肠杆菌单菌落,37℃震荡培养过夜。
2)将过夜培养的菌液加入1.5ml小指管中,4000rpm、离心1min,吸取培养液,收集所有菌体于一个小指管中。
3)加入100uL溶液I于含菌体细胞的小指管中,漩涡震荡将细菌沉淀悬浮,室温放置10min。
4)加入200uL溶液II(冰上预冷),室温静置菌液裂解变清(不要超过5min)。
5)加入200uL溶液III冰上静置15min,使质粒DNA复性。
6)12000rpm,离心10min,将上清转移至另一1.5ml小指管。
7)向上清加等体积的酚:
氯仿:
异戊醇,漩涡混匀,12000rpm,离心5min,将上清转移至另一1.5ml小指管。
8)向上清加等体积的氯仿:
异戊醇,漩涡混匀,12000rpm,离心5min,将上清转移至另一1.5ml小指管。
9)上清加2倍体积的无水乙醇,漩涡混匀后,室温放置30min,充分沉淀质粒DNA。
12000rpm,离心10min,吸去上清液。
10)沉淀用75%乙醇1mL洗涤2次(每次12000rpm,离心5min),吸去上清液,沉淀于超净台中风干。
11)沉淀加入30uLRTE,60℃水浴30min溶解。
12)-20℃保存。
2.2质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分析
1)用1xTAE配制1%琼脂糖凝胶,以及电泳缓冲液。
2)上样:
4uL质粒DNA+0.5uL10xloadingbuffer
3)Marker5ul
4)80伏恒压电泳
5)用凝胶成像仪分析照相
3质粒DNA和目的DNA(AKP)的双酶切
3.1酶切
1)在灭菌的1.5ml小指管中按表三准备双酶切反应体系:
酶切反应体系
管号
核酸
10xbufferK
ddH2O
BamHI
HandIII
tube1
目的基因AKP
24uL
3uL
0uL
2uL
1uL
tube2
pETBlue-2
10uL
2uL
5uL
2uL
1uL
表三:
酶切反应体系
2)37℃酶切3小时
3.2酶切产物的凝胶电泳分析
1)用1xTAE配制1%琼脂糖凝胶,以及电泳缓冲液。
2)上样:
a)2uLpETBlue-2+1uL10xloadingbuffer
b)2uL目的基因AKP+1uL10xloadingbuffer
c)全部管1酶切产物+1uL10xloadingbuffer
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