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电镜细胞化学
电镜细胞化学--ElectronMicroscopyCytochemistry
电子显微镜细胞化学(ElectronMicroscopyCytochemistry,简称:
电镜细胞化学),是光学显微镜组织化学、细胞化学基础上的延伸与发展,实际上也就是普通细胞化学技术在电镜水平上的发展和应用。
电镜细胞化学主要用于研究细胞内各种成分在细胞超微结构水平的分布状态,以及这些成分在细胞中的定性、定量及代谢变化情况,目的是阐明各种细胞成分在生理、病理情况下与细胞结构和功能等之间的关系。
电镜细胞化学与光学显微镜组织、细胞化学的根本区别在于:
光学显微镜细胞化学是利用特定的化学显色反应,将要研究的细胞成分以显色的方式在细胞原位凸现出来;而电镜细胞化学则利用特定的化学反应,形成高电子密度、不溶性的反应产物沉淀在细胞原位,借助电子显微镜进行超微结构的原位分析。
目前,常规的超薄切片技术已经比较成熟,非常容易观察到细胞内各种细微结构,当要用这种方法得知细胞内各种成分及其在细胞活动中的变化还无能为力。
用生化分析的方法可以测得细胞中各种组分的准确含量,当这种方法只有破坏细胞结构,把组织匀浆后才能实现,这对了解完整细胞中酶的分布和变化是不合适的。
利用电镜细胞化学技术研究细胞的结构与功能,无需对所要研究的成分进行提取和分离就能获得组织和细胞内该成分的定位、代谢等大量信息。
对分子生物学或生物化学的研究来说,电镜细胞化学既可先行指路,又可相互佐证,它可将分子生物学、生物化学和超微结构研究等多方面有机地联系起来,在尽量保持细胞内固有结构的基础上显示分子生物学研究对象及其生化反应在细胞器、膜系统、大分子复合体等上的情况。
这样也就将超微结构和机能反应紧密地结合起来。
电镜细胞化学的种类
电镜细胞化学技术种类繁多,包括:
酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、电子显微镜放射自显影技术、离子细胞化学技术、示踪细胞化学技术及电子显微镜特殊染色技术等。
根据细胞化学反应的原理,这些技术可以分为以下几类:
∙
用特异的处理方法使组织和细胞上的电子透明物质产生电子致密沉淀物的方法。
这种方法包括:
∙
o
依赖化学键作用力产生金属盐沉淀,从而进行电镜下观测研究的方法。
这种方法又被称为离子细胞化学技术。
∙
o
被检测物质作用于适当的底物而形成可见的电子致密的沉淀物。
许多酶的电镜细胞化学都是属于此类。
∙
o
标记的抗原抗体复合物:
组织和细胞内的抗原可借助电子密度高的标记物如铁、金等,从而得到显示。
免疫电镜技术、免疫细胞化学技术等都属此类。
∙特异酶消化或特异溶剂提取法使原本存在的电子致密物质消失的鉴别方法。
某些细胞器本身,本来具有电子密度较高或经常规染色能形成电子密度较高的结构,用特异的酶或特定的溶剂在组织固定或前处理时,预先进行反应,使其在以后的固定和染色过程中不产生电子密度较高的结构,以反证其存在。
例如:
在组织、细胞固定前,预先用RNA酶,DNA酶消化,然后再用特异染色,电镜下在相应的部位出现空白区域,以反证核酸的存在。
如要鉴别脂肪可用有机溶剂进行处理。
*被检测物本身是自然的电子密度较高的元素或化合物。
常见的天然电子密度高的物质有铁蛋白、血红蛋白等。
电镜细胞化学技术的关键
电镜细胞化学方法的关键在于找到能与组织和细胞内物质进行特异反应的试剂,这种特异的反应及其试剂应满足以下要求:
∙反应试剂与组织或细胞内被检测物质发生的反应必须具有特异性;*
反应不损伤或破坏组织或细胞本身的超微结构;
∙反应的最终产物为电镜能观察的电子致密物,一般为微细的、颜色很深的沉淀物,而且在
所研究物质的原位沉淀,在所有的制样和观察过程中不会改变位置;*反应具有可重复性。
由于电镜的分辨率比光学显微镜要高得多,反应最终产物的任何微细变化在光学显微镜观察时不易发现,但在超微结构上的变化就非常明显。
因此,对电镜标本的制备方法也有一些特别严格的要求,每个步骤都要十分精心的操作和控制,以避免在超微结构水平上出现假象。
电镜细胞化学的一般步骤
传统的光镜组织化学方法须经固定、脱水、石蜡包埋、切片等一系列步骤后才能进行孵育,这样对酶等物质的活性损伤较大。
为了保存活性,减少所研究物质的流失,目前光镜组织化学采用的方法是:
将组织块固定后直接用冰冻切片机或组化切片机切成薄片,接着进行孵育,不经过包埋等步骤。
这样处理使酶等的定位明显改善,所研究物质的活性检出率液显著提高。
电镜细胞化学技术是在后一种方法基础上改进的,孵育前的步骤大致与光镜组织化学方法相同。
但孵育后,还需经后固定、脱水、包埋、超薄切片和染色等步骤。
电镜细胞化学与纯形态学方法颇为相似,不同点在于前、后固定间加入了厚切片和孵育等步骤。
一般来说,电镜细胞化学技术包括以下几个步骤。
取材
取材的方法和要求基本与形态学相同。
在电镜细胞化学技术中,用灌注固定后再取材的方法,对保存酶等物质的活性及定位较为理想。
固定
由于组织和细胞内的化学物质,如酶等,都是十分敏感的物质,在样品制备期间容易丢失、扩散或失去活性,因而必须采用适当的方法将它们的位置和活性进行固定。
固定的作用,除立即杀死细胞并把它的超微结构真实地保存下来外,还有另外一些作用,如改变细胞膜的通透性,促进孵育液种的各种成分顺利进入细胞内部,与所研究的物质成分发生化学反应,从而使该成分保存在原来的位置而不扩散或被洗去等。
可见,固定的好坏将直接影响到细胞超微结构的保存和细胞内化学成分的定位等。
但在制样过程中保存好酶等物质的活性和细胞超微结构之间常存在矛盾。
若向保存好结构,则需充分固定,但固定越彻底,酶等物质失活越严重。
就理论上讲,细胞化学保存酶活性最好的方法是不经固定的新鲜组织。
可将新鲜组织先孵育后再做固定,必然导致出现反应产物不均匀、扩散、吸附、流失等现象。
这就导致"错误定位"等假象。
严格地说,在制样过程中酶等物质的流失和活性的损失是不可避免的,但应尽量减少这种损失。
应用于电镜细胞化学技术中的良好的固定必须满足以下条件:
结构保存:
不清晰的结构不仅难于鉴别正常与异常,而且给细胞化学反应产物的定位带来困难。
因此,要求组织块要新鲜,固定及时。
机能保存:
除了保存良好的结构外,还需保存研究物质的活性。
有些物质,如酶等,在常规的固定、脱水等步骤中,其活性容易受到破坏,因此适当的固定方法和固定剂的选择很重要。
*定位保存:
细胞化学的最终反应在细胞特定的区域内以不溶性的颗粒沉淀定位。
有些细胞内成分使用常规固定方法后,在脱水、包埋等操作中容易扩散和流失,造成假象。
良好的固定应避免这些物质的扩散。
化学固定方法仍广泛应用于电镜细胞化学技术中。
电镜细胞化学技术中使用化学固定方法时,固定试剂的种类、缓冲液种类和条件、固定的时间和固定方式等方面都将严重影响最后的结果。
普通超薄切片技术常使用戊二醛-锇酸双固定的方法,这两种固定剂配合使用可较好地保存细胞的超微结构。
但有些物质如一些酶,用戊二醛和锇酸固定时能破坏它们的活性。
如用锇酸固定大鼠肝组织时可保存清晰的细胞结构,但酸性磷酸酶的活性仅能保持1-2%。
最早用于电镜细胞化学的固定剂如:
高锰酸钾、甲醛等能较好地保存某些诸如酶等物质的活性,但它们又不能良好的保存细胞的超微结构。
如甲醛、多聚甲醛固定能较好的保存酶的活性,但保存细胞超微结构的完整性却较差。
因此,选择电镜细胞化学的固定剂时经常面临很大的矛盾。
现在用于电镜细胞化学技术的固定剂常用多聚甲醛和戊二醛的混合液进行固定。
如0.5%~2%戊二醛加2%~4%多聚甲醛。
其实,有时单用多聚甲醛也可以,在细胞超微结构保存方面并无多大问题,关键是取材后的标本应迅速得到固定。
作为固定剂的醛类溶液必须很纯,否则会影响实验结果,一般要求1%的戊二醛水溶液在紫外分光光度计上测得的235nm与280nm的吸收比(A235/A280)在0.2以下,pH值大于4。
否则应对戊二醛进行提纯处理。
用于电镜细胞化学技术的缓冲液种类很多,常用的有醋酸盐缓冲液、磷酸缓冲液、Tris缓冲液和二甲胂酸钠缓冲液。
通常用缓冲液配制固定液、漂洗液和孵育液。
固定液和漂洗液的pH值要求7.2~7.4,而孵育液的pH则随所研究的物质的不同而变化较大。
电镜细胞化学对缓冲液的成分要求较高,选用缓冲液时,应根据所研究的物质来决定。
如研究的成分或孵育液中含钙,则一般不用磷酸缓冲液,因其常常和孵育液中的成分产生沉淀,此时应选用二甲胂酸钠缓冲液时,要注意胂酸盐有毒。
又如钠离子对K^+依赖性磷酸酶有抑制作用,因此,所有液体都应除去钠离子。
Tris属于氨基的缓冲液,由于氨基和醛基能发生化学反应,所以二类试剂不能在一起使用。
有时需要在固定液中加入蔗糖或葡萄糖(或聚乙烯吡啶烷酮,即PVP)等调节固定液的渗透压。
在实际应用中,常常使用略高于体液的渗透压,以减少研究物质的扩散,但高渗溶液容易造成细胞收缩,因此必须控制好浓度。
此外,在电镜酶细胞化学中,有时为了保护酶的活性和提高酶对固定剂的耐受性,有时还会在固定液或缓冲液中加入少量的底物(1~2mmol/L)。
例如,当测定G-6-P酶时,通常在戊二醛固定液中加入1~2mmol/L的葡萄糖-6-磷酸底物。
但要注意,若添加的底物的量若不合适会导致反应产物的非特异性扩散,影响最后结果。
在某些情况下,可在固定液或缓冲液中加入少量的赋活剂以保护酶等的活性。
如非特异性碱性磷酸酶,在缓冲液中加入少量的镁,可获得更好的效果。
但在实际应用中,一般很少添加底物和赋活剂。
对于电镜细胞化学技术来说,固定的时间应以尽可能少地减弱研究物质如酶的活性同时又尽可能多地保存超微结构为原则。
有些对固定剂很敏感的物质更应尽可能采用短时间的固定。
如:
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PDH)仅能固定2分钟。
游离细胞可直接加到固定剂或离心后加入固定剂;实性组织通常需切成小块后再放到固定剂中。
一般来说用灌流的方式能更好地固定样品,但固定时间不宜过长。
灌注固定的固定效果应明显优于浸泡固定,即将样品直接取材,切割成合适大小的样品块后,将样品块浸泡于固定液中。
然而,灌注固定远不如浸泡固定那样应用广泛,其原因有两方面:
一是使用范围受到一定限制,如人体组织的固定(活检)、植物材料以及各种培养细胞等;二是这种方法需要比较高的技术,一般不易掌握。
而对于浸泡固定来说,样品块的体积也是应该特别注意的。
研究表明,人肝在室温和冷溶液中用4%的戊二醛固定24小时,其渗透深度分别为4.5毫米和2.5毫米。
因此,为了能迅速对细胞内各组分及时进行固定,一般用于电镜细胞化学研究的样品块体积应小于0.5立方毫米。
对于植物材料及一些具有致密结构的材料,组织块体积更应小些。
固定后,样品需充分漂洗,漂洗不干净往往会影响后面的反应。
厚切片
最早用于电镜细胞化学的样品常将组织块直接进行孵育,但因组织块太厚,一般孵育液只能渗透组织表面40μm左右,因此在固定漂洗后,常需将组织块在组织切片机上进行切片,制备成40μm左右厚的切片。
分离的细胞器、培养的细胞等不需进行厚切片。
冷冻固定的组织用冷冻切片机切片
孵育
让组织和细胞与某种试剂在特定的条件下充分作用的过程叫孵育。
细胞化学反应在孵育中进行。
孵育是电镜细胞化学技术的关键步骤。
因而对孵育液的成分、选择合适的底物、良好的缓冲系统、最佳的pH、适当的温度以及孵育时间等都必须加以充分的考虑。
∙孵育液各种成分的要求:
各种孵育液的成分比例都有严格的范围,不能随便变更,
以免扰乱溶液浓度;所使用的各种化学试剂都必须保证质量,起码应是分析纯(AR)级,特别是底物的要求更为严格;底物试剂最好放置于干燥器内,并置低温保存;对吸水的化学试剂和药品必须密封,并保存于干燥器内。
∙孵育液的配制:
多数孵育液必须使用前新鲜配制,按配方顺序逐一加入各种试剂并随时
不停搅拌(最好使用搅拌器),特别是电镜酶细胞化学更应在用前现配;所使用的器皿要特别干净,避免使用、接触金属;加入含铅试剂等时,需缓慢滴加,同时不停搅拌,否则反应速率和效果都将不好;孵育液配制完毕后最好再次调整pH。
∙孵育时间和温度:
虽然在0~4℃下孵育有利于保存超微结构,防止反应物的扩散,但有
的物质如酶在此温度下无活性。
因此一般孵育温度为37℃,主要根据细胞化学反应要求而定。
孵育时间可因组织、细胞和所研究的物质种类而差异很大。
如大鼠肝脏的Ca2+-ATPase要求37℃30分钟即可,而显示ACP则需25分钟,心肌SDH仅需10分钟即可。
总之,孵育时间最短,又能达到满意的反应结果为最好。
若孵育时间过长,则易引起反应产物的弥散而产生假象;为了把握好孵育时间和效果,最好在孵育过程中不同时间取出部分切片进行检查,以确定孵育时间。
∙
孵育的方法,对于冷冻切片来说可以将切片贴附于载玻片上再放到孵育液中进行孵育,一般的厚切片可直接放到孵育液中进行孵育。
∙在孵育时,常要根据拟测定的物质设置对照实验。
孵育后处理
一般在孵育后仍要用1%的锇酸进行30~60分钟的后固定,也有人在孵育完成后再用亚铁氰化钾还原锇酸代替锇酸作后固定,以提高最后结果的反差。
后固定后一般可按常规处理。
由于组织较薄,后固定、脱水、渗透与包埋时间可缩短。
另外必须注意超薄切片染色时,有时可能会模糊细胞化学反应的细节。
对照实验
对照实验是任何细胞化学常规实验的重要组成部分。
电镜细胞化学除扩散、吸附等原因可造成假象外,有时不可避免地出现伴随反应。
如,进行葡萄糖-6-磷酸酶反应时,由于葡萄糖-6-磷酸盐作为底物,而这底物常可和碱性磷酸酶、ATP酶等磷酸酶系列发生反应,从而造成假象。
因此,使用电镜细胞化学反应方法进行研究时必须进行对照实验。
冷冻电镜细胞化学技术
前面已谈到由于组织和细胞内的化学物质,在样品制备期间容易丢失、扩散或失去活性。
常规的制样过程中保存好酶等物质的活性和细胞超微结构之间常存在矛盾。
所以,用于电镜细胞化学标本的较好的固定方法当属快速冷冻固定方法。
快速冷冻样品可在极短的时间内,将样品迅速冷却至液氮温度。
这种方法可以将样品的自然生活状态尽快地保存下来,同时又极大地保存了所要研究物质的活性。
基本满足了前面讲到的电镜细胞化学技术中的良好的固定必须满足的条件,较好地做到了结构保存、机能保存和定位保存,很好地解决了常规样品制备过程中遇到的矛盾。
冷冻电镜细胞化学技术的具体步骤与常规的基本一致,也需要取材,固定,厚切片,孵育以及孵育后处理等步骤。
样品快速冷冻固定的方法有多种,详细技术见第七章。
冷冻固定后的组织用冷冻切片机进行厚切片和超薄切片。
对于冷冻切片来说,可以将切片贴附于载玻片上再放到孵育液中进行孵育,也可应用冷冻超薄切片方法进行冷冻超薄切片,而后进行孵育、染色等步骤,这样不影响组织成分,但技术要求复杂。
现很常用的是用快速冷冻的方法进行样品的快速固定,而后用冷冻置换的方法在常温下进行厚切片以及其它的步骤。
随着样品快速冷冻装置的不断改善,用于细胞、组织标本的快速冷冻设备已日益完善,冷冻电镜细胞化学技术的应用也越来越广泛,这对于电镜细胞化学技术的发展,无疑具有很重要的作用。
电镜酶细胞化学技术
电镜细胞化学方法有很多,但最常用的是电镜酶细胞化学和免疫电镜方法。
本章将重点介绍电镜酶细胞化学技术,免疫电镜技术将在第九章中介绍。
通常使用显微镜能正确描述生物细胞的形态结构,但不能直接证实酶等生物大分子的功能,而只能从结构推测功能;生物化学则从功能方面推测结构。
然而细胞内部的大分子物质,用常规的方法都很难获得其形态上的结构特征,所以细胞内的酶等大分子的鉴定,常需依赖于将显微学和生物化学结合起来的技术--酶细胞化学技术。
酶组织细胞化学是20世纪20年代出现的,40年代后迅速发展起来的一门学科。
它是用组织化学的方法来证明酶的存在的方法。
20世纪60年代后电镜应用到酶细胞化学的研究,形成了电镜酶细胞化学技术。
每一种细胞都有特定的酶,而每一种类的酶常存在于细胞的特定部位,细胞内酶的定位因酶的种类而异,每种酶都有自己固定的位置,完成其特定的生物功能。
酶本身用常规的方法是不可直接观察到的,利用酶的特异组织细胞化学反应可将酶的位置等显示出来。
酶的特异组织化学反应指酶具有只作用于该酶底物的反应(也有两种或两种以上的酶具有同种底物的情况)。
利用酶的这种特性,在一定条件下,使细胞内的酶作用于酶的底物,将底物分解产物作为反应物质,在作用部位进行捕捉,形成可在电镜中进行观察的电子致密物,从而间接证明酶的定位。
这种酶促反应被称为酶组织细胞化学反应。
酶组织细胞化学反应越特异,对该酶在细胞内的定位也就越精确。
酶的种类很多,目前已知有1000多种,其中能用光学显微镜组织化学方法显示出来的大约只有100多种。
由于光学显微镜分辨率低,放大倍数小,定位不精确。
电镜酶细胞化学技术虽然发展较快,但由于该技术对样品制备要求较高,影响因素很多,同时又不能象光学显微镜组织化学那样看到颜色效果,因此到目前为止,能通过电子显微镜显示出来的酶还不是太多,其数量大约不到100种,而且多为水解酶和氧化还原酶类。
其它酶类的电镜细胞化学技术也有一些报道,但数量不多,技术也不够稳定,特别是重现性较差。
尽管有着这些不足,电镜酶细胞化学技术对研究细胞生理功能和病理过程仍有着重要意义,而且由于很多酶可作为细胞器或某些结构的标志酶,这种技术可为进一步研究细胞器的结构和功能及一些临床病理诊断提供有利的条件,因而电镜酶细胞化学技术仍在相关领域发挥着不可替代的重要作用。
电镜酶细胞化学的基本原理
酶是一种具有生物催化作用的特殊蛋白,大量存在于有机体细胞和组织中。
但它们在细胞中并不随意分布,而往往分成一定的组群,定位在细胞内特定的结构中。
例如线粒体内有生物氧化所需的各种酶等。
这些酶与非生物催化剂有明显的不同,有其自身的特点。
首先它们具有高度的专一性,一种酶只能催化一种固定的反应,并在确定的部位发生。
它们的这种专一性可表现在对立体异构体的专一性、对底物的专一性等。
其次是催化的高效性,也就是酶能大大地加速反应的速率。
与相应的非生物催化剂相比,酶催化的反应速率要高好几个数量级(107~109倍)。
酶分子中存在某些特殊的活性部位,这些部位结构的保存对酶分子发挥作用起着重要的作用。
酶的催化能力受到温度、pH、金属离子和其它化合物存在的影响。
酶的催化能力常因某些物质的存在而升高,这就是酶催化的激活现象。
可以激活酶催化作用的金属离子有许多,如Co2+,Mn2+,Mg2+,Zn2+,K+,Na+,Fe2+等。
因此,在电镜细胞化学过程中都应注意这些离子的存在条件。
酶的活性也可由于加入某些物质而降低,甚至完全消失,这就是酶的抑制作用。
酶的抑制作用可分为两大类:
(1)竞争性抑制,加入某些空间结构和底物分子类似的物质,让它占据酶的活性部位,使酶分子不能与底物结合,这种抑制是可逆的;
(2)非竞争性抑制,这种抑制是不可逆的。
抑制剂一旦与酶分子结合,就能使酶永远失去活性。
抑制酶的活性还可通过其它激活剂等来实现。
电镜酶细胞化学技术正是利用酶的上述这些性质,通过电子显微镜、超薄切片技术等确定各种酶在细胞内的分布及其在细胞活动中的变化等。
在设计电镜酶细胞化学实验时,对所研究的酶的各个性质进行充分的了解,对整个实验的成功将是非常必要的。
酶细胞化学反应过程可分两步,首先,在一定条件下使细胞内的酶作用于底物,形成初级产物(酶反应),再应用化学物质(通常称为捕捉剂)与初级产物反应,形成电镜下可见的物质(捕捉反应)\ref{fig-Enzyme-Fanyingshi}:
Image:
.jpg[h]\centering\includegraphics[totalheight=1.3cm]{fig-Enzyme-Fanyingshi}\caption{酶细胞化学反应过程}\label{fig-Enzyme-Fanyingshi}\end{figure}
底物
常用的底物有两种:
∙自然存在的底物:
自然存在的底物能产生不溶性的电子致密物,主要应用于金属盐类以及
检查单、二及三磷酸钠,也可用于高铁氰化物还原法检查特异的脱氢酶等。
∙嗜锇性的产物。
理想的底物要求具备以下的特点:
水溶性,并在水中比较稳定;能与参与反应的其它混合物"相容",并对作用酶没有抑制作用。
反应产物
电镜细胞化学反应应当在标本的特异部位最终出现具有高度反差的产物,因此初级反应产物经捕捉反应后生成的最终反应产物应具有高反差性能。
它们可以是金属,也可以是酶反应产生的沉淀。
理想的最终反应产物应具备以下的性能:
均质、高电子密度、不被树脂和水及其它有机溶剂所溶解、不与组织或细胞相结合,不溶于脂肪,较少生成结晶,而且不易扩散等。
*捕捉反应//这是电镜细胞化学中常用的反应,它的作用是使初级反应产物经捕捉反应而变成最终反应产物以便进行电镜观察。
由于捕捉反应很快,在100毫秒即可使初级反应产物与蛋白相结合,因此不至于造成明显的扩散。
对照实验
对照实验的要求是:
∙对照实验的取材必须与实验组的材料为同一组织、同一部位的材料;
∙对照组与实验组所使用的缓冲液、孵育液(除缺乏底物外)等溶液均应一致;
∙对照组应不加底物。
把组织切片孵育在缺乏底物的孵育液中,细胞不出现反应或反
应程度明显下降。
如果组织存在内因性底物,即使不加底物,也会在某种程度上呈现阳性反应。
所以孵育前必须充分漂洗,尽可能使内因性底物洗净;
∙在进行酶细胞化学反应时,应进行加热或添加抑制剂等处理,使酶失活;酶抑制剂有
可逆性和非可逆性两种,可逆性酶抑制剂经漂洗、孵育后酶可重新活化。
因此必须选择非可逆性的酶抑制剂;
∙可将被测定物质用酶先进行消化、酰化或甲基化,使细胞不再起细胞化学反应。
∙可用已知阳性或阴性反应标本来检查未知标本进行对比观察。
如有可能,应同时采
用多种方法检查同一种物质,以增加实验的准确性。
电镜酶细胞化学的种类
从最终产物获得的反应方法可将电镜酶细胞化学分成:
金属沉淀法、锇黑法和嗜锇性多聚体生成法等几种。
金属沉淀法
此法早在1939年由美国人Gomrori和日本人Takamatsu建立,开创了光镜组织化学技术。
1955年Scheldon利用金属沉淀法第一个在电镜下证实了酸性磷酸酶(ACP酶)的存在。
%\cite{张景强-1993}金属沉淀法的原理及生成的最终产物是金属沉淀,这种产物溶解度越低越理想。
因此常以Pb2+,Cu2+,Ba2+等金属元素作为酶的捕捉剂,由它们形成最终反应产物,如:
磷酸铅、亚铁氰化铜、硫化钡等具有溶解度低、粒细、电子密度高等特点。
其中铅盐是较理想的捕捉剂,其优点是:
被检出的酶种类多(各种磷酸酶、酯酶和转移酶等);在酸性、中性和碱性条件下均可使用;反应一次完成,不需置换反应;生成的产物颗粒小,不易流失。
但铅盐也有缺点,如反应产物有时扩散,捕捉的量过高,可能与底物相结合,对酶活性有抑制作用,在反应液中促进底物的自然分解等。
色素法与锇黑法
光镜细胞化学反应最常用的方法是色素法,包括偶氮色素法:
即用α-醋酸萘酚、萘酚As-β-葡萄糖苷酸,β-萘酚磷酸钙等萘酚系列衍生物作为底物,这些底物与酯酶、磷酸酶、糖苷酶等酶发生反应,游离出萘酚并与重氮盐相结合(偶联),以偶氮色素沉淀于酶所在的部位。
以碱性磷酸酶为例说明其反应过程如图\ref{fig-Enzyme-Oudansesufa}。
其它的色素法包括四唑盐法和二氨基联苯胺法(DAB)法。
四唑盐法主要是底物中游离出来的氢原子与四唑盐结合生成红色或蓝色的色素。
这些色素法用于电镜酶细胞化学时,由于色素本身电子反差弱给观察带来困难,因此需要在最后一步用锇酸处理,使反应产物锇化形成锇黑。
这种方法叫锇黑法。
形成的锇黑反差强,图像清晰。
电镜酶细胞化学常规操作中,切片经色素法孵育后用锇酸进行后固定,此时,锇酸不仅仅起固定细胞结构的作用,还使四氧化锇还原成锇黑。
因此,对
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- 细胞 化学