多基因共表达载体的构建策略.ppt
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多基因共表达载体的构建策略.ppt
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多基因共表达载体的构建策略,曹慧青,丁金凤国外医学(分子生物学分册)2002Vol.24No.1,多基因共表达载体的应用,表达异源多聚体蛋白的亚单位,如免疫球蛋白、细胞受体、白细胞介素、转录因子等同时表达针对同一靶细胞的几种异源蛋白以取得联合或协同的作用,如原癌基因、抗血管生成基因、自杀基因等。
策略一:
多启动子表达载体,原理:
带有各自独立启动子的多个表达盒构建于一个载体上,转录出多种不同的mRNA,并翻译出不同的蛋白。
优点:
简便缺点:
内部启动子占据载体上有限的克隆空间启动子间相互干扰,造成不同基因的表达水平不一致,策略二:
剪切载体,原理:
利用一个启动子,在外源基因两侧提供剪切供体/受体位点,通过剪切初始转录本,形成不同的mRNA,分别表达两个基因缺点:
可变剪切机制未明,双基因表达效率很不稳定,策略三:
表达融合基因,原理:
两基因用linker(多选择中性疏水氨基酸)或直接相连,使用同一开放阅读框,翻译产生嵌合的一个双功能融合蛋白分子优点:
翻译水平等量表达,常用于阳性/阴性双选择标记载体、筛选标记/报告基因载体的构建缺点:
可能由于构像的改变使其中一个或两个基因的功能受到影响若两基因产物有不同的细胞定位,也会影响基因的正常功能。
也就是说表达平衡,而功能并不平衡,策略四:
基因之间以IRES序列连接,原理:
内部核糖体进入位点(IRES)序列来源于某些病毒和细胞的mRNA5端的一段非翻译区。
在上游启动子的控制下,该序列及与之相连的基因可同时转录,并以不依赖帽的方式启动远端mRNA的翻译,从而在同一转录本上翻译出不同的蛋白优点:
克服了双启动子之间相互抑制的现象简化了传统的双启动子表达盒模式繁琐的阳性克隆筛选过程可以拓展到构建双IRES序列三表达基因载体不足:
转录等量,翻译独立。
以IRES启动的翻译效率较帽依赖的翻译效率低。
置于IRES下游外源基因的表达量是其上游帽启动翻译基因的20%-50%。
不同来源的IRES序列组成不同,长度各异,在不同细胞类型中的作用也各异,来源于闹心肌炎病毒EMCV的该序列又称为不依赖帽的翻译增强子,在大部分细胞中可直接招募核糖体起始其下游顺反子的翻译。
但对其实密码的位置要求严格,只有该序列中的第11个可作为起始密码。
来源于脊髓灰质炎或口蹄疫病毒的IRES序列对其后的任一个符合KOZAK序列的AUG均可有效的起始翻译,因而得到更为广泛的应用。
IRES序列置于两个顺反子之间时,它与第一个顺反子的终止密码的最佳距离为80bp。
少于40或多于300-400bp会大大的降低IRES序列的翻译效率。
策略五:
基因之间以Furin的切割靶点序列连接,原理:
Furin是一种广泛存在的胞内蛋白酶,定位于高尔基复合体,在真核生物高度保守,可识别各种分泌型蛋白前体的精-X-精/赖-精氨酸共有序列并在此位点对其进行切割。
利用这一点,将编码切割位点的连接子置于分泌蛋白或膜结合蛋白的cDNA序列间,转录时可以得到一条单顺反子,翻译成嵌合的融合蛋白,在加工过程中Furin切割成各个分离的蛋白产物,进而进行分泌性表达。
特点:
可以多基因表达。
表达蛋白的摩尔比由载体上的编码序列数决定细胞选择性:
COS细胞中Furin含量少,融合基因的各蛋白表达量低;CHO细胞中,精-X-赖-精介导的切割效率为50%,而精-X-精-精只有30%。
策略六:
基因之间以2A序列连接,原理:
2A是一种具有自我加工能力的蛋白酶,在不同病毒中它的长度、作用位点各不相同。
在口蹄疫病毒中的2A序列有长短两种类型,长型有201bp,编码39个氨基酸,短型有96bp,编码17个氨基酸。
两者作用相似,均可独立的用于构建多基因载体。
将两基因分别克隆到2A序列的两侧,去除上游基因的终止密码形成单一的开放阅读框,翻译出的多聚蛋白可在编码2A区域的C末端被切割为两个蛋白,上游蛋白融合了2A的C端多肽,并释放出完整的下游蛋白。
2A与Furin的不同之处:
2A的切割位点在自身C端最末位的两个氨基酸之间(甘-脯)切割作用伴随翻译过程完成切割活性高达85%-99%但是具体的切割机制不明可用于与IRES序列一起构建多顺反子载体。
研究表明两个近邻的IRES序列会降低基因的表达。
因此,2A序列在构建多顺反子时是IRES序列的有益补充。
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