胰蛋白酶的分离纯化.pptx
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胰蛋白酶的分离纯化.pptx
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胰蛋白酶的分离纯化,主要内容,胰蛋白酶的结构、理化性质胰蛋白酶功效分离纯化路线,胰蛋白酶结构及理化性质,胰蛋白酶是从牛、猪、羊的胰脏提取,纯化获得的结晶,再制成的冻干制剂。
易溶于水,不溶于三氯甲烷、乙醇、乙醚等有机溶剂。
在pH1.8时,短时间煮沸几乎不失活;在碱溶液中加热则变性沉淀,Ca2+有保护和激活作用,胰蛋白酶的等电点为pH10.1。
牛胰蛋白酶原有229个氨基酸组成,含6对二硫键,其氨基酸排列顺序和晶体结构已被阐明。
在肠激酶活自身催化下,酶原的N末端赖氨酸与异亮氨酸残基之间的肽键被水解,释放出来缬-天-天-天-天-赖6肽,生成有活性的胰蛋白酶。
牛的胰蛋白酶氨基酸残基223个,分子量23800。
猪胰蛋白酶的化学结构与牛胰蛋白酶十分相似,在氨基酸残基排列顺序中,只有41个氨基酸残基不同,但分子构型有很大区别。
沉降系数S20W为2.77SpI=10.8,热稳定性较牛胰蛋白酶稳定,Ca2+对酶的保护作用不及牛羊的明显,无螯合Ca2+的中心部位。
有6对二硫键,断裂12个键,均不至于破坏酶分子的完整结构而保护了酶的活性。
酶的活力分别相当于牛的72%及羊的61%。
羊胰蛋白酶与牛、猪的相似,但其活力略高于牛和猪的。
胰蛋白酶的功效,为蛋白质水解酶,能选择地水解蛋白质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链,能消化溶解变性蛋质,对未变性的蛋白质无作用,因此,能使脓、痰液、血凝块等分解、变稀,易于引流排除,加速创面净化,促进肉芽组织新生,此外还有抗炎症作用。
临床上用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等。
喷雾吸入,用于呼吸道疾病。
也可用于治疗毒蛇咬伤。
还常用于动物细胞培养前对组织的处理。
胰蛋白酶分离纯化路线,胰蛋白酶粗提液的获取,1.将胰脏绞碎成胰浆,在510存放24h以上,使胰酶自身活化。
2.3500r/min下离心20min,取上清液用二层纱布过滤,然后根据等电点沉淀的原理用稀硫酸将提取液的pH值调至酸性(pH3.0左右),使大量的酸性蛋白沉淀出来。
3.采用透析袋透析,然后用硫酸铵盐析法将胰蛋白酶从粗提液中沉淀出来,使其得到浓缩,并除去部分杂质(透析袋透析原理:
由于膜两侧的溶质浓度不同,在浓度差的作用下,高分子溶液中的小分子溶质透向透析液一侧,同时透析液中的缓冲液渗入蛋白溶液一侧,经过透析液反复换液后,即可达到脱盐和置换缓冲液的目的。
),胰蛋白酶分离纯化路线,胰蛋白酶纯化,采用离子交换层析原理:
蛋白质在其等电点以下时带正电荷,可以被阳离子交换树脂所吸附;而蛋白质在等电点以上,带负电荷,可以被阴离子交换树脂所吸附。
因为胰蛋白酶等电点为10.1且在酸性条件下稳定,所以功能基团考虑使用阳离子此外,遵循大分子物质分离一般采用弱性,因此使用弱酸性阳离子,骨架材料选择凝胶,因为其孔度大,亲水性好。
离子交换剂的离子形式考虑用盐型。
恒流泵,部分收集器,离子交换柱,离子交换流程简图,离子交换层析法纯化胰蛋白酶,胰蛋白酶分离纯化路线,胰蛋白酶分离纯化路线,工艺流程:
粗提液的获取,胰蛋白酶分离纯化路线,工艺流程:
纯化,
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