英文文献讲解.ppt
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FunctionalanalysisofPsG6PDH,acytosolicglucose-6-phosphatedehydrogenasegenefromPopulussuaveolens,anditscontributiontocoldtoleranceimprovementintobaccoplants,PublishedbyBiotechnologyletters:
21,May,2013Factor:
1.853,报告人:
专业:
生物学基地年级:
2011级日期:
2014年5月11号,背景介绍,2.实验方法,3.结果与讨论,主要内容,4.实验结论,5.前景展望,低温是限制植物生长,发育和分布的重要环境因素之一,低温不但降低植物的生命合成活性,抑制正常的生理代谢过程,而且严重时还会导致植物死亡。
低温寒害是农业、林业生产的主要自然灾害之一。
背景介绍,低温的危害:
常规育种存在的不足:
育种周期长,杂交方式单一,杂交难度大等局限性,杂交工序复杂费时,易受季节、气候、地域及水分等多种环境因素限制。
甜杨(Populussuaveolens):
属杨柳科(Salicacae),主要分布于大兴安岭北部及漠河一带,是研究木本植物抗冻性及有关抗冻基因克隆的理想材料。
G6PDH(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶):
磷酸戊糖途径的关键性调控限速酶,其主要功能是为脂肪酸合成、氮还原和谷胱甘肽等生物分子合成提供还原力NADPH,也为核酸合成提供戊糖;此外,还参加非生物逆境胁迫应答反应。
因此,G6PDH对植物的生长发育起着非常重要的作用。
背景介绍,背景介绍,甜杨中分离G6PDH基因,生物学分析,PsG6PDH的原核表达,该基因可能编码胞质PsG6PDH而且与基因胁迫有关,验证了其编码框的完整性,导入烟草进行表达和分析,对其功能进行进一步鉴定,实验部分,实验部分,甜杨,高效稳定的离体培养体系的建立,总RNA的提取,基因组DNA的制备,G6PDH基因的分离和克隆,植物表达载体的构建和遗传转化,转PsG6PDH基因烟草材料的获得,低温抗性实验,电导率的测定,超氧化物歧化酶SOD活性的测定,过氧化物岐化酶POD活性的测定,丙二醛MDA含量的测定,PsG6PDH在转基因烟草耐低温中的可能作用,ThepredictedtertiarystructureofPsG6PDHprotein,结果与讨论,含有NADP结合区(红色)和G6P结合区(蓝色)两个保守功能域,具有多个磷酸化位点和跨膜区域,表明PsG6PDH可能作为膜受体而起作用,系统发生树,结果与讨论,实验部分,甜杨,高效稳定的离体培养体系的建立,总RNA的提取,基因组DNA的制备,G6PDH基因的分离和克隆,植物表达载体的构建和遗传转化,转PsG6PDH基因烟草材料的获得,低温抗性实验,电导率的测定,超氧化物歧化酶SOD活性的测定,过氧化物岐化酶POD活性的测定,丙二醛MDA含量的测定,PsG6PDH在转基因烟草耐低温中的可能作用,实验部分,植物表达载体的构建:
PsG6PDH,烟草的遗传转化:
实验部分,利用经典的的叶盘转化法把甜杨G6PDH基因转入烟草,经过含Kan和Cef培养基的筛选、继代和生根培养,得到一批转基因烟草。
30daysold,将植株转入土壤,在植物培养箱中under15%,a16/8hlight/darkphotoperiodfor1month。
Usedforcoldtoleranceassaysand,geneexpressionanalyses,实验部分,甜杨,高效稳定的离体培养体系的建立,总RNA的提取,基因组DNA的制备,G6PDH基因的分离和克隆,植物表达载体的构建和遗传转化,转PsG6PDH基因烟草材料的获得,低温抗性实验,电导率的测定,超氧化物歧化酶SOD活性的测定,过氧化物岐化酶POD活性的测定,丙二醛MDA含量的测定,PsG6PDH在转基因烟草耐低温中的可能作用,低温抗性试验:
实验部分,
(1)未经15低温驯化:
培养温度直接从25下降到4,每隔12h观察烟草的表型变化(结果如图Fig.4.a)
(2)经15低温驯化:
培养温度先降至15后缓慢下降到-4,按0.5/h逐步降低温度,在每处理温度下24h,观察烟草的表型变化(结果如图Fig.4.b),取生长性状一致的野生型和转基因烟草,(a).Withoutcold-acclimation,结果与讨论,低温抗性试验:
实验部分,
(1)未经15低温驯化:
培养温度直接从25下降到4,每隔12h观察烟草的表型变化(结果如图Fig.4.a)
(2)经15低温驯化:
培养温度先降至15后缓慢下降到-4,按0.5/h逐步降低温度,在每处理温度下24h,观察烟草的表型变化(结果如图Fig.4.b),取生长性状一致的野生型和转基因烟草,(b).Withclod-acclimation,结果与讨论,结果与讨论,TransgenictobaccolinescarryingpoplarPsG6PDHexhibitedagreatercoldtolerancethanWTplants,Results,实验部分,电导率的测定:
取生长性状一致的野生型和转基因烟草,在25、4、0、-2、-4五个不同温度下分别处理两小时,选择相同位置的叶片,用0.5mm的打孔器打孔,选择10个小圆片置于试管中,加入5ml去离子水,抽真空20min后,静置一小时,用电导仪测定电导值S1。
将样品沸水浴30min,静置一小时,测定电导值S2.,电解质渗透率(EL)=S1/S2,结果与讨论,WT:
5%to90%,TG:
5%to40%,Blow0,ELofbothtransgeniclineswassignificantlowerthanthatofWT,A.variationofelectricalconductivityoftobaccoleaveaafterserialtreatmentsat25,4,0,-2,-4,respectively,实验部分,SOD活性的测定:
NBT光化学还原法,G6PDH活性的测定:
荧光光学法,POD活性的测定:
愈创木酚法,MDA含量的测定:
TBA(硫代巴比妥酸)反应法,结果与讨论,MDA,POD,SOD,G6PDH,over-expressing,结果与讨论,IncreasedcytosolicG6PDHactivityisinvolvedinPODandSODactivityandinductionoffrezzingresistanceinpoplarcuttings.,甜杨G6PDH基因在烟草中的表达,有助于膜保护性酶POD和SOD活性的提高及细胞膜的稳定,进而提高了转基因烟草的耐低温能力。
Results,实验部分,Increasedtranscriptionofcold-stressrelatedgenesintobaccoplantsover-expressingPsG6PDH,Up-regulated,结论,甜杨PsG6PDH的组成性表达,不会影响烟草的表型生长,而且在低温胁迫下可以提高烟草的抗寒能力。
因此,可作为植物抗寒冻遗传改良的新的外源基因。
Results,前景展望,1.由于植物抗寒冻性状受多基因控制,因此有必要从多基因的作用层次上来探讨植物抗寒冻的作用机制。
2.采用生物信息学技术设计甜杨G6PDH基因的突变体,研究G6PDH突变体及其活性,以及在转基因植物中的抗性作用。
经过改造可能会获得活性更强的G6PDH。
End,感谢大家的聆听!
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