基因工程实验须知.docx
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基因工程实验须知.docx
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基因工程实验须知
基因工程实验须知
一、每次实验前必须预习实验内容,明白得实验的基来源差不多理、操作步调,禁止不预习就做实验。
二、每次实验必须做好实验记录,每次实验完成后,依照记录写出实验申报。
三、实验所得成果,如不再供下一次实验用,应交给指导教师,并注明名称、数量、组别、姓名等。
四、实验室应经常保持整洁、桌面上不要乱放与本次实验无关的书本、仪器、药品。
火柴头、废纸、废液等应放入废液桶中。
倒入水槽中的废液(无污染的)急速放水冲掉落。
五、爱护仪器、节约药品。
仪器破坏后应急速报损,并按规定补偿。
六、实验、药品、公用器具应用后应急速放回原处,留意不要调错试剂瓶塞或滴管,以免污染药品。
七、实验室必须安静,不得扫瞄与本次实验无关的书本:
禁止抽烟及吃食物。
八、依照实验记录,及时完成实验申报,不按时交申报者,不予记录实验成就。
九、实验完毕,值日生应将实验室清除洁净,关好水、电、门、窗,分开实验室时,检查一遍,以免产闹变乱,确保安稳。
实验一植物基因组DNA提取
目标:
明白得植物细胞的特点,操纵植物基因组DNA分别、纯化的道理。
道理:
用植物基因组DNA提取液处理研磨、收集后的样品,提取液中的乙二胺四乙酸二钠(EDTA)能螯合金属离子,以防止破裂细胞的脱氧核糖核酸酶对DNA的降解感化,而细胞破裂液中的蛋白酶K在37℃温浴过程中还能降解蛋白质,从而削减了蛋白质对DNA的污染。
然后用CTAB处理,在特定的盐浓度下,CTAB使基因组DNA处于消融状况,而蛋白质仍为沉淀。
经细胞破裂液获得的DNA粗提取液再用酚、氯仿、异戊醇处理,个中酚是高效的蛋白变性剂,可进一步将蛋白、脂类和细胞碎片去掉落,然后用氯仿、异戊醇处理,一方面可达到去蛋白的目标,另一方面还可去除残留的酚。
一、材料
植物的根、茎、叶。
二、设备
移液管,高速冷冻离心计心境,台式离心计心境,水浴锅。
三、试剂
1、CTAB或Nacl溶液:
4.1克NaCl消融于80ml水,迟缓参加10克CTAB,加水至100ml。
2、其它试剂:
氯仿、异戊醇(24:
1),酚:
氯仿:
异戊醇(25:
24:
1),异丙醇,TE,10%SDS,蛋白酶K(20mg/ml),5mol/LNaCl。
四、操作步调
1、选新奇无病虫害的叶片用自来水冲刷吸干,用蒸馏水洗两次,然后用超纯水洗一遍,吸干,剪碎称0.5-0.25克。
2、将所取材料放入预冷的研钵(研钵提早要灭菌),研成粉末后置于7ml离心管内(能够换为将样品放置到7ml离心管中800ulCTAB后用玻棒捣碎)。
3、参加2.4ml65℃预热的CTAB,充分混淆后65℃水浴90min以上,冷却到室温,参加等体积氯仿异戊醇(24:
1),轻轻倒置混匀4℃离心6000g×10min,取上清参加2/3体积的-20℃预冷的异丙醇轻轻混匀,-20℃度放置20min,4℃离心5000g×5min,去上清。
4、再沉淀中参加0.6ml的65℃CTAB温育30min,待沉淀充分消融,参加等体积氯仿异戊醇充分混匀,4℃离心6000g×5min,去上清参加2/3体积的-20℃预冷的异丙醇,轻轻混匀-20℃放置20min。
4℃离心5000g×5min,去上清。
5、用70%乙醇清洗沉淀两次,真空抽干,参加200μlTE消融DNA后置于4℃备用
6、提示:
酚、氯仿、异戊醇的感化:
酚与氯仿长短极性分子,水是极性分子,当蛋白水溶液与酚或氯仿混应时,蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去,使蛋白质掉去水合状况而变性。
变性蛋白质的密度比水的密度大年夜,经由离心与水相分别,沉淀在水相下面,从而与消融在水相中的DNA分开,而酚与氯仿有机溶剂比重大年夜,储存在最基层。
作为别处变性剂的酚与氯仿,在去除蛋白质的感化中,各有利弊。
酚的变形感化大年夜,但酚与水能有必定程度的互溶,因而损掉了这部分水相中的DNA。
氯仿的变形感化不如酚后果好,但氯仿不与水相容,可不能带走DNA,因此在抽提过程中,混淆应用酚与氯仿后果最好。
经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚,因为酚与氯仿是互溶的,可用氯仿第二次变性蛋白质,现在一路将酚带去。
也能够在第二次抽提时将氯仿与酚混淆(1:
1)应用。
异戊醇能降低分子别处的张力,能够削减抽提过程中的泡沫产生,同时异戊醇有助于分相,使离心后的上层水相,中层变性蛋白相及基层有机溶剂相保持稳固。
实验二基因的PCR扩曾反响(聚合酶链式反响)
目标:
进修PCR反响的基来源差不多理及相干实验技巧
道理:
聚合酶链式反响(PCR,polymerasechainreaction)本质是体内DNA复制的体外仿照。
当双链DNA变性为单链今后,DNA聚合酶以单链DNA为模版,并应用反响混淆物中的四种dNTP,以与模板互补的寡聚核苷酸链为引物,合成新的DNA互补链。
新合成的DNA链的起点,由参加在反响混淆物中的一对寡聚核苷酸引物在模板DNA链两端的结合点决定,经由PCR的轮回即模板DNA变性为单链、引物与模板退火(杂交)、DNA合成三步调的反复反复,最后,两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数在理论上可扩增达2n,使特定的DNA区段获得灵敏、大年夜量的扩增。
经由30~35个轮回,可将2kb的DNA从1pg扩增到0.5-1μg,能够或许经由过程琼脂糖凝胶电泳检测出来。
转基因植物因为含有目标基因,当用针对目标基因来说为特异的一对寡聚核苷酸链作为引物,对其总DNA作PCR时,能够获得特异性产品(目标基因),而非转基因植物的总DNA可不能扩增出特异性产品。
一、材料
待扩增的基因样品
二、设备
基因扩增仪(PCR仪),台式离心计心境,电泳仪,紫外监测仪
三、器皿
微量移液器,微量离心管(0.5ml),微量吸头(Tip头),电泳槽
四、试剂
Taq酶,dNPT,10×Taq酶buffer,特异寡聚核苷酸引物(primer),模板DNA,无菌去离子水,无菌矿物质油,琼脂糖,溴酚兰指导剂。
五、方法
1、在0.5ml无菌Eppendorf管中,分别以被检测植物的总DNA、阴性对比、阳性对比DNA为模板,进行PCR扩增反响,并设置两个空白对比:
没有DNA和没有引物的。
向各管中依次参加下列试剂(总的反响体积为50μl):
无菌去离子水33~32μl
1xTaq缓冲液5μl
dNTP(各2.5mmol/μl)5μl
引物R(20pmol/μl)2.5μl
引物F(20pmol/μl)2.5μl
模板DNA1~2μl(含质粒DNA0.01~0.1μg或含植物总DNA0.05~0.5μg)
将以上各试剂(Taq酶除外)混匀后于94℃变性10min,掏出离心管,快速离心几秒钟,使冷凝于管盖上的液体回到管底部,再参加1μlTaqDNA聚合酶(约2~3U),混匀后汲取少量灭菌的矿物质油覆盖于页面上。
应用待加热帽的PCR仪时不必家矿物油。
2、设置PCR的轮回法度榜样,以下轮回参数可作为参考:
98℃预变性2min;94℃变性30~60s;53~57℃退火1min;72℃延长1~2min,轮回25~35次后,72℃延长10min(以包管扩增出来的片段差不多上全长的),扩增反响完全后,取样品反响液5~50μl,用合适的琼脂糖凝胶电泳检测扩增的成果并拍照。
提示:
1、防止污染:
因为PCR反响的高灵敏性,因此在操作中要防备情形DNA污染,全部器皿均要求灭菌,最好戴一次性手套进行操作,矿物油要分装,一次用一支。
为防止交叉污染,最好所有PCR试剂都事先分装成小份备用。
装有PCR试剂的微量离心管打开之前,应先在离心计心境上作瞬时离心,如许可削减污染机会。
一样最后加模板DNA,且加样时忌形成喷雾,所有非即用管都应盖严。
只要有可能,就应设置阳性对比(即由少量恰当的靶序列介入的PCR)和一个空白对比(不含模板DNA的PCR),以检测PCR反响体系是否正常。
2、反响体系构成
(1)引物在PCR中的浓度常是1μmol/L,这一浓度足以完成30个轮回的扩增反响,更高浓度可能导致显现不测的非靶序列的的扩增。
假如引物的浓度不足,则PCR的效力极低。
(2)TaqDNA聚合酶催化以典范的PCR反响所需酶量约为2U。
酶量少,扩增效力低;酶过量,则可能导致非靶序列的扩增。
(3)dDNA系在饱和浓度(每种dDNA20μmol/L)下应用。
(4)靶序列:
含有靶序列的DNA以单链或双链情势参加到PCR混淆液中。
闭环靶序列DNA的扩增效力略低于线状DNA,是以用质粒作反响模板时最好先将其线状化。
模板DNA中靶序列的浓度因情形而异,可按已知靶序列量递减(1ng,0.1ng,0.01ng等)的方法设置一组对比反响,以检测扩增反响的灵敏度是否相符要求。
3、一样来说,模板的感化量越多,PCR的效力相对也高一些,但有必定的限制,专门是在模板DNA质量不太好,杂质含量比较多时,模板增多反而会阻碍PCR的成果。
4、若PCR产品呈降解片段起首削减模板DNA用量。
5、PCR产品非特异性条带较多应起首进步退火温度,其次削减引物的用量。
有时能够用初次PCR的产品为模板进行再次PCR以获得专一的特异性条带。
实验三碱法小量制备重组质粒
目标:
操纵最常用的提取重组质粒的方法。
道理:
从大年夜肠杆菌细胞平分别质粒DNA的方法专门多。
其分别可依照分子大年夜小不合、碱基构成的差别以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状构造的特点来进行。
今朝常用的有碱变性提取法,羧基磷灰石柱层析法、质粒DNA开释法、两相法等。
个中碱变性法提取后果优胜,既经济且收得率较高,提取到的质粒DNA可用于酶切、连接与转化。
碱变性抽取质粒DNA是基于染色体DNA于质粒DNA的变形与复性的差别而达到分别的目标。
在pH高达12.6的碱性前提下,染色体的氢键断裂,双螺旋结够解开而变性。
质粒DNA的大年夜部分液断裂,但超螺旋共价闭合环状构造的两条互补链可不能完全分别,当以pH4.8的NaAC高盐缓冲液调剂其pH值至中性时,变性的质粒DNA又复原到本来的构型,储存在溶液中,而染色体DNA不克不及复性而形成的缠连得网状构造。
经由过程离心,染色体DNA与不稳固的大年夜分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一路沉淀下来而被除去。
一、材料
LB培养基上进展的菌落
二、设备
振荡培养箱、微量离心管、台式高速离心计心境、恒温高速离心计心境、冰箱、微型电泳槽
三、试剂预备
1、溶液Ⅰ:
50mM葡萄糖,25mMTris-HCl(pH8.0),10mMEDTA(pH8.0)。
1MTris-HCl(pH8.0)12.5ml,0.5MEDTA(pH8.0)10ml,葡萄糖4.730g,加ddH2O至500ml。
高温高压灭菌15min,贮存于4℃。
2、溶液Ⅱ:
0.2NNaOH1ml,10%SDS1ml,加ddH2O至10ml。
应用前临时设备。
3、溶液Ⅲ:
醋酸钾(KAc)缓冲液(pH4.8)。
5MKac300ml,冰醋酸57.5ml,加ddH2O至500ml、4℃储存备用。
4、TE:
10mMTris-HCl(pH8.0),1mMEDTA(pH8.0)。
1MTris-HCl(pH8.0)1ml,0.5MEDTA(pH8.0)0.2ml,加ddH2O至100ml。
高压湿热灭菌20min,4℃储存备用。
5、苯酚/氯仿/异戊醇(25:
24:
1)
6、乙醇(无水乙醇、70%乙醇)
7、5×TBE:
Tris碱54g,硼酸27.5g,EDTA-Na2·2H2O4.65g,加ddH2O至1000ml。
高压湿热灭菌20min,4℃储存备用。
8、溴化乙锭(EB):
10mg/ml
9、RnaseA(RNA酶A):
不含DNA酶(Dnase-free)RnaseA的10mg/ml,TE设备,沸水加热15min,分装后贮存于-20℃。
10、6×loadingbuffer(上样缓冲液):
0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青FF,40%(W/V)蔗糖水溶液。
11、1%琼脂糖凝胶:
称取0.2g琼脂糖于三角烧瓶中,加20ml1×TAE,微波炉加热至完全熔解,冷却至60℃阁下,加EB母液(10mg/ml)至终浓度0.5μg/ml(留意:
EB为强诱变剂,操作时带手套),轻轻摇匀。
慢慢倒入架有梳子的电泳胶板中,勿使有气泡,静置冷却30min以上,轻轻拔出梳子,放入电泳槽中(电泳缓冲液1×TAE),即可上样。
四、操作步调
1、挑取LB固体培养基上进展的单菌落,接种于2.0mlLB(含响应抗生素)液体培养基中,37℃、250rpm振荡培养住宿(约12~14hr)。
2、取1.5ml培养物放入微量离心管中,室温离心8000g×1min,弃上清,将离心管倒置,将液体尽可能流尽。
3、将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中,猛烈振荡,使菌体分散平均。
4、加200μl新奇配制的溶液Ⅱ,倒置数次混匀(不要猛烈振荡),并将离心管放置于冰上2~3min,使细胞膜裂解(溶液Ⅱ为裂解液,故离心管中菌液逐步变清)。
5、参加150μl预冷的溶液Ⅲ,将管平和倒置数次混匀,见白色絮状沉淀,可在冰上放置3~5min。
溶液Ⅲ为中和溶液,现在K+使SDS-蛋白复合物沉淀。
6、参加450μl的苯酚/氯仿/异戊醇,振荡平均,4℃离心12000g×10min。
7、当心移出上清于一新微量离心管中,参加2.5倍体积预冷的无水乙醇,混匀,室温放置2~5min,4℃离心12000g×15min。
8、1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1~2次,4℃离心8000g×7min,弃上清,将沉淀在室温下晾干。
9、沉淀溶于20μlTE(含RNaseA20μg/ml),37℃水浴30min以降解RNA分子,-20℃储存备用。
提示:
1、实验安排:
碱变性法抽提质粒DNA,除了菌体培养、质粒扩增金额和收集菌体外,其提取过程大年夜致可分为三个步调:
从染色体DNA平分别质粒DNA,这是提取过程中最关键的操作步调;去除质粒DNA中的RNA;进一步纯化质粒DNA,去除蛋白质等杂质。
2、一些试剂的生化感化道理
(1)溶液Ⅰ
溶霉菌:
水解菌体细胞壁的重要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键,因而具有溶菌感化。
葡萄糖:
增长溶液的粘度,防止DNA受机械剪切力感化而降解。
EDTA:
金属离子螯合剂,螯合Mg2+,Ca2+等金属离子,克制脱氧核糖核酸酶(DNase)对DNA的降解感化(DNase感化时须要必定的金属离子强度作辅基),同时EDTA的存在,有利于溶霉菌的感化。
因为溶霉菌的反响要求有较低的离子强度情形。
(2)溶液Ⅱ-NaOH-SDS液
NaOH:
核酸在pH值为5~9的溶液中是最稳固的,但pH大年夜于12或小于3时,就会引起双键之间氢键的解离而变性。
在溶液Ⅱ中的NaOH浓度为0.2N,参加提取液时,该体系的pH就会高达12.6,因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。
SDS:
为阴离子别处活性剂,重要功能有:
消融细胞膜上的脂肪与蛋白,从而破坏细胞膜;解聚细胞中的核蛋白SDS蛋白质结合为复合物,使蛋白变性沉淀下来,但SDS能克制核糖核酸没的感化,因此在今后的提取过程中,必须把它去除洁净,以防用RNase去除RNA时受到干扰。
(3)溶液Ⅲ-3MKAc(pH4.8)溶液:
KAc的水溶液呈碱性,为了调剂pH至4.8,必须参加大年夜量的冰醋酸,因此该溶液实际上是KAc-HAc的缓冲液。
用pH4.8的KAc溶液是为了把pH12.6的抽取液pH调回到中性,使变性的质粒DNA能够或许复性,并能稳固存在。
而高盐的3mol∕LKAc有利于变性的大年夜分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白质复合物凝集而沉淀之。
前者是因为中和核酸上的电荷。
削减相斥力而互相聚合,后者是因为钠盐与SDS-蛋白质复合物感化后,能形成消融度较小的钠盐情势复合物,使沉淀完全。
(4)什么缘故用无水乙醇沉淀DNA:
此为实验中最常用的沉淀方法。
乙醇的长处是低度极性,能够以随便率性比例和水相混容,乙醇与核酸可不能起任何化学反响,对DNA专门安稳,是以是幻想的沉淀剂。
DNA溶液时以水合状况稳固存在的DNA,当参加乙醇时,乙醇会夺去DNA四周的水分子,使DNA掉水而易于聚合。
一样实验中,是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混淆。
其乙醇的最终含量占67%阁下。
因而也可改用95%乙醇来代替无水乙醇(因无水乙醇价格更贵),但加95%乙醇使总体积增大年夜,而DNA在溶液中总有必定程度的消融,因而DNA损掉也增大年夜,专门用多次乙醇沉淀时,会阻碍收得率。
调和的做法是初次沉淀DNA是可用95%乙醇代替无水乙醇,最后的沉淀步调要应用无水乙醇。
也能够用异丙醇选择性沉淀DNA,一样在室温下放置15~30min即可。
应用乙醇在低温前提下沉淀DNA,分子活动大年夜大年夜削减,DNA易于聚合而沉淀,且温度越低,DNA沉淀得越快。
(5)RNase处理核糖核酸后,再次沉淀DNA时什么缘故必定要加NaAc至最浓度达0.1~0.25M。
在pH8阁下的DNA溶液中,DNA分子是带负电荷的,加必定浓度的NaAc,使Na+中和DNA分子上的负电荷,削减DNA分子之间的同性电荷相斥力,易于互相聚合而形成DNA纳盐沉淀。
当参加大年夜量盐溶液浓度太低时,只有部分DNA形成DNA钠盐聚合,如许就造成DNA沉淀不完全。
当参加的盐溶液浓度太高时,其后果也不太好,在沉淀的DNA中,因为过多的盐杂质存在,阻碍DNA的酶切等反响,必须要进行洗涤或重沉淀。
(6)什么缘故将DNA储存于TE缓冲液中?
在基因操作实验中,选择缓冲液的重要原则是推敲DNA的稳固性及缓冲液成分不产生干扰感化。
磷酸盐缓冲体系(pKa2=7.2)、硼酸体系(pKal=9.24)等因此也都相符细胞内幕况的心理范畴(pH),能够作为DNA的储存液,但在转化实验时,磷酸根将与Ca2+产生沉淀;在DNA酶反响时,不合的煤对关心因子的种类及数量要求不合,有的要求高盐离子浓度,有哦则要求低盐离子浓度,采取Tris-HCL(pKa=8.0)的缓冲体系,因为缓冲对时Tris+/Tris,不存在金属离子的干扰感化,故在提取或储存DNA时,大年夜都采取Tris-HCL体系,而TE缓冲液中的EDTA更能稳固DNA的活性。
操作方法:
1、该实验成功的标记是把染色体DNA,蛋白质与RNA去除洁净。
获得必定收得率的质粒DNA。
去掉落染色体DNA最为重要,也较困难。
因为在全部提取过程中,只有一次机会去除染色体DNA,其关键步调是参加溶液Ⅱ与溶液Ⅲ时,操纵变性与复性操作机会,既要使试剂与染色体DNA充分感化使之变性;又要使染色体DNA赓续裂成小片段而能与质粒DNA相分别。
这就要求试剂与溶菌液充分摇匀。
坚决时用力恰当。
一样参加SDS后要留意不克不及过分用力振荡,但又必须让它反响充分。
2、当参加溶液Ⅱ5min后,若没有看到溶液变稠时,实验不克不及再连续做下去了。
3、设备试剂时,要用重蒸水设备外,其器皿必须严格清洗,最后要用重蒸水冲刷三次,凡能够进行灭菌的试剂与器具都要经由高压蒸汽灭菌,防止其他杂质或酶对DNA的降解,对Ep管、Tip头与非玻璃离心管等只能湿热灭菌,然后放置在50℃温箱中烘干应用。
4、用乙醇沉淀DNA时,要不雅察水相与乙醇之间没有分层现象之后,才可放在冰箱中去沉淀DNA。
实验四DNA的重组连接
目标:
明白得T4DNA连接酶的几种生物学功能及用处;进修在T4DNA连接酶的感化下,载体与目标基因的几种不合的连接方法以及在标准的连接反响体系中,质粒载体和插入的外源DNA的比率关系和各自的用量;操纵用Pmd18-Tvector与PCR产品进行T-A克隆的机理及其应用。
道理:
外源DNA片段和线状质粒载体的连接,也确实是在双链DNA5′-磷酸可生成4个新的磷酸二酯键。
但假如质粒DNA已去磷酸化,则吸能形成2个新的磷酸二酯键。
在这种情形下产生的两个杂交分子带有2个单链瘦语,当杂交体导入感触感染态细胞后可被修复。
相邻的5′-磷酸和3′-羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不合的DNA连接酶催化,这两种酶确实是大年夜肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。
实际上在有克隆用处中,T4噬菌体DNA连接酶差不多上首选的用酶。
这是因为鄙人述反响前提下,它就能有效地将平端DNA片段连接起来。
DNA一端与另一端的连接可认为是双分子反响,在标准前提下,其反响速度完全由互相匹配的DNA末尾的浓度决定。
不论末尾位于同一DNA分子(分子内连接)照样位于不合分子(分子间连接),差不多上如斯。
现推敲一种简单的情形,即连接混淆物中只含有一种DNA,也确实是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体DNA,再加感化的底物。
假如反响中DNA浓度低,则配对的两个末尾同一DNA分子的机会较大年夜(因为DNA分子的一个末尾找到同一分子的另一末尾的概率要高于找到不合DNA分子的末尾的概率)。
如许,在DNA浓度低时,质粒DNA从新环化将卓有成就。
假如连接反响中DNA浓度有所增高,则在分子内连接反响产生往常,某一个DNA分子的末尾碰着另一DNA分子末尾的可能性也有所增大年夜。
是以在DNA浓度高时,连接后的初产品将是质粒二聚体和更大年夜一些的寡聚体。
一、材料
载体DNA
二、仪器
离心计心境、离心管、恒温水浴箱等
三、试剂
10×Buffer、无水乙醇、3mol/LNaAc、75%的乙醇、1×TE溶液、T4连接酶
四、方法
1、酶切反响
对证粒DNA的剖断,只只是是质粒DNA换为载体DNA。
若大年夜量酶切,则成比例增长。
A、在0.5mlEppendorf管中加重蒸水6µl10×Buffer1µl酶1µl混匀,37°C水浴1h以上。
B、取反响物点样,不雅察酶切后果。
C、酶切完全后,70°C5min终止反响。
2、加2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的3mol/LNaAc混匀,-20°C2h以上。
3、离心15000rpm×15min,弃上清。
4、参加75%乙醇洗涤2次,离心弃上清,真空抽干。
5、参加适量1×TE消融。
如斯可得线性化载体DNA。
6、测定DNA的含量。
7、参加线性载体DNA和含量3~4倍于载体的待插入DNA片段,连接缓冲液及T4连接酶适量至总体积为20µ1,在12~14°C反响12~16h。
8、连接反响液可置-20°C储存,供转化用。
提示:
1、设立两个对比反响:
1)只有质粒载体
2)只有外源DNA片段
假如外源DNA不足,每个反响可用50~100ng质粒DNA,并尽可能多加外源DNA,同时保持连接反响体积不跨过10ū1.可用至少3种不合方法来测定T4噬菌体DNA连接酶的活性。
大年夜多半制造厂商(除NewEnglandBiolabs公司外)现在都用单位(Weiss等,1968)对该酶进行标化。
1个Weiss单位相当于0.2个用外切核酸酶耐受实验来定义的单位(Modrich和Lehman,1970)或者60个粘端单位(如NewEnglandBiolabs公司所定义)。
是以,0.015Weiss单位的T4噬菌体DNA连接酶均为浓溶液(1~5单位/µl,可用20mmol/LTris·ClPh7.6)、60mmol/L、5mmol/L二硫苏糖醇、500µg/ml牛血清白蛋白、50%甘稀释成100单位、ml的浓度置存。
处于这种浓度并在这种缓冲液中的T4噬体DNA连接酶于-20°C储存3个月可保持稳固。
2、相对而言,平端连接是低效反响,它要求以下4个前提:
1)低浓度(0.5mmol/L)的ATP(Ferretti和Sgaranekka,1981)。
2)不存在亚精胺一类的多胺。
3)极高浓度的连接酶(50Weiss单位.Ml)。
4)高浓度的平端。
在反响混
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