项目总结报告终稿.docx
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项目总结报告终稿
项目总结报告(终稿)-
国家重点基础研究发展计划
(973计划)
项目中期总结报告
项目名称:
工业生物技术的过程科学基础研究项目编号:
XXXX年12月20日
一、项目组织落实情况
1、项目的总体思路和框架、主要研究内容和目标
(1)项目总体思路和框架
过程工程科学问题是我国生物技术产业化的关键。
本项目将以可再生生物质为原料进行大规模生物转化合成大宗化学品为主线,研究从细胞群出发放大到工业化生产的工业生物过程基础科学。
工业生物过程与传统化工过程的根本区别,在于工业微生物细胞具有生理活性及代谢的多样性。
因此工业生物反应过程面向的是复杂、多相的生物转化体系,工业生物分离过程面向的是组份多、结构类似物多的生物分离与纯化体系。
为此,本项目将从细胞群体、单元过程和系统优化三个层次进行工业生物过程的深入研究。
第一层次主要关注细胞群的群体效应现象、多相复杂生物体系的生化、生理特性分析及物质和能量传递规律,以及过程放大的基本原理和策略研究,着重进行新现象、新规律和新机理的发现和认识;第二层次主要进行基于生物生理特性和物质传递特性的直接放大、生物/化学方法级联的系统优化以及多产物联产目标的全局调控研究,着重进行反应器直接放大、生物/化学方法级联、多目标联产以及反应/分离单元耦合等新技术和新方法的创新研究;最终通过生物发酵过
程和生物分离过程的集成优化,实现整个工业生物过程的系统集成与全局优化。
(2)主要研究内容
①大规模细胞群体行为及过程放大原理
“细胞群体效应”是指大规模培养细胞作为一个群体,细胞与细胞之间以及细胞与环境之间存在信息交流,来感知和理解周围环境的变化,同时调整自身的生理行为和产物合成特性。
采用现代化学分子结构分析与鉴定方法以及工业生物技术,选择常见的工业模式微生物,进行细胞群体效应产生与调控的基本规律研究。
对具有细胞间信号转导功能的化学分子进行结构与功能鉴定和定量分析;了解细菌群体效应的临界阈值变化特性,掌握细胞群体行为从协同生长转向胁迫抑制的临界变化规律,揭示高密度培养过程中细胞群的群体行为和生产特性调控的关键要素;考察不同物理和化学环境条件下细胞群体效应与环境变化的互作关系;研究高密度/高粘度培养过程中物质和能量的传递特性与流场特性对细胞群体效应产生、细胞群体行为变化及目标产物生成的影响;研究大型生物反应器宏观操作参数对细胞群体效应的反馈控制方法,揭示大规模细胞培养过程中出现“放大效应”的分子机制及过程控制原理。
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②多相生化特性分析及生物过程模型化
采用现代测试技术,对搅拌式和气升式环流生物反应器内气-液-固三相复杂生物反应体系的微观瞬态流动、传热传质及其生物反应特性进行研究,考察反应器型式、操作条件、体系物性等对多相复杂生物反应体系传递特性及生物转化规律的影响,揭示多相复杂生物体系传递特性的动态变化规律。
运用模型化研究方法,从微观、瞬态角度对生物反应器内流动、传递与反应特性进行科学、定量、理性的分析与设计。
基于动量、质量及能量输运方程、本征生化反应动力学方程及大量实测数据,构建能够描述细胞群体效应的三维反应器模型,实现多相生物反应器动态反应过程模拟及优化设计,特别是高粘度、高密度体系中大型机械搅拌桨的流场计算,模拟预测操作条件、体系物性和反应器几何尺寸对复杂生物反应过程中的流动和质量、能量传递以及生化反应特性的影响,为新型高效生物反应器的设计与放大、强化能量输入、传递性能以及反应性能方法的研究和技术发展提供理论指导和依据。
针对生物分离体系,通过计算机分子模拟,进行新型分离介质的分子设计。
通过主客体分子间作用形式和配合物构像变化的数学描述,揭示新型分离介质分子对目标分子进行识别的机理,从而指导具有高吸附、高选择性的吸附介质的设计与应用。
进一步针对离子交换吸附、膜分离等典型的分离过程单元,进行系统的模型化研究,如多组份复杂生物体系吸附分离动力学模型和选择性透过膜分离机理模型的建立等,从而为生物分离过程单元放大的设计奠定基础。
③生化反应过程放大原理与方法
提出基于细胞生理特性的工业生物反应过程放大的原理与方法。
针对特定的生化反应过程,研究放大过程中细胞群体的生理特性和外界环境的相互关系,重点研究不同规模的发酵罐搅拌器形式、转速等对生理特性的影响,进而进行大规模培养发酵罐搅拌器形式、转速等生物反应过程的分析、设计与放大研究。
在此基础上,针对不同反应器型式内多相生物反应过程中相间传递行为的复杂性、细胞群生长的生命周期多样性及复杂生物反应,提出基于生物生理特性和传递特性的直接放大新方法,并结合丁醇、1,3丙二醇、丙烯酸等生物产品大规模发酵过程,进行基于细胞生理特性与反应器流场特性相结合的生物反应过程的直接放大设计,突破传统“实验室-小试-中试-工业”逐级放大的思路与方法,实现工业发酵与分离过程的定量设计与直接放大,大大缩短放大周期,提高放大成功率。
④生物/化学方法级联设计与调控
面向工业生物过程的资源利用最大化及环境污染最小化目标,将专一性强的生物转化方法与反应快速的化学催化方法进行整体级联设计与调控研究。
探索级联反应在工业生物过程中的催化转化新规律,实现级联反应对天然可再生资源的
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专一性利用、反应起始的促进、反应进程的加速、以及反应产品的纯度、分子量及其它性能强化的新功能。
进一步面向工业生物过程的多产物联产目标,对细胞群进行全局转录调控研究,实现多维目标产物的优化合成以及微生物细胞群对有机溶剂、酸、碱、表面活性剂等苛刻环境的耐受性的全面强化。
根据物质和能量守恒原理,研究多目标产物生物转化过程中碳源和氮源物质流、能量流以及氧化还原辅因子等在多目标产物分支合成途径上的竞争利用和再生循环机制,实现最佳优化匹配,最终实现工业生物过程从底物到多产物合成的高效清洁生产。
⑤工业生物过程单元耦合与集成
典型的工业生物过程通常涉及手性物(如L-乳酸和D-乳酸)、结构类似物(如1,3丙二醇和1,2丙二醇)等的分离纯化。
以乳酸、1,3丙二醇、丁醇等发酵过程为研究对象,研究不同相界面和不同尺度生物产物的积累、反应和传递行为,实现多步分离工序的集成。
首先,探索新型分离介质的设计与制备;设计新型适合于生化手性异构体、同系物及结构类似物分离的高效介质;研究分离放大过程中非均相再分配等问题对分离机制的影响。
进一步构建集成化分离新系统;分析多个子系统之间相互适配与协同作用机制;研究新型扩张床集成技术和结晶/过滤/干燥一体化技术,阐明物质流和能量流的传递机理和规律。
实现多种分离流程分布的合理布局。
最后,进行反应/分离耦合过程的设计与构建;进行有机醇、有机酸等发酵过程与膜分离、膨胀床吸附等高效分离过程的耦合设计与调控;分析反应/分离耦合过程对物质流和能量流传递及转化效率的促进作用机制及其对代谢功能的调节作用和产品质量的影响;实现发酵过程与分离过程的耦合调控。
⑥工业生物过程的系统控制与优化
把体现生物过程特性(如细胞的生长代谢特性、发酵液的氧传递特性、细胞本身的微观结构和传递性质、高密度和高粘度特性等)与优化控制原理和方法(如自适应控制理论、代谢网络模型、人工智能模型、粒子群和蚂蚁群优化算法等)相结合,并考虑微生物反应培养环境、微生物反应动力学、代谢通量分析(MFA)、微生物代谢调控、辅因子调控和目标代谢产物的代谢途径及分支途径最优配比等,在典型生物过程(如1,3-丙二醇、丙酮酸等的微生物发酵过程)中,研究生物过程的优化控制方法。
研究系统工程优化方法(如动态规划法、模糊多目标遗传算法等)在典型生物过程(1,3-丙二醇、乳酸、丁醇、丙烯酸)中的应用,以“原料-转化-分离-废物资源化利用”的一体化为优化主导思想,研究原料利用、转化反应、产物分离和废物资源化的相互作用和影响,考虑碳源和氮源的转化、废渣废水的综合利用、物质流和能量流在工业生物过程中的合理分配等;研究将上游生物转化与下游产物分离有机结合的优化策略;研究废物流分流处理和综合利用;研究体现工业生物过程特征的系统综合优化方法。
通过优先优化与整体优
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化相统一、局部优化与全局优化相结合、目标产物和副产物相互调控等研究策略,研究代谢副产物的高效综合利用以及两个或多个生物过程相匹配的优化技术。
(3)研究目标
实现工业生物过程关键科学问题的重大突破,揭示生物加工过程的能量和物质传递规律,系统地优化调控机制,实质性地提高生物加工过程的创新能力,重组优化重要产品的代谢途径,形成细胞工厂模型,奠定平台化合物高效生物合成的基础,促进重大先进生物加工技术的形成。
为我国的新型工业化道路做出积极的贡献。
①突破生物加工过程规模化的关键科学问题,包括生物加工过程中的细胞群体效应,细胞群体和环境之间的自适应原理、能量和物质传递规律,建立新的生物加工过程单元分析方法,在线分析技术,CFD流体传质和传热研究方法,新的单元耦合规律,为进一步优化奠定基础。
②研究生物/化学过程级联和集成优化的新方法,包括基于分子设计的生物分离新方法、新介质和过程的集成,如反应和分离技术的集成,分离和分离过程的集成等。
形成一批拥有自主知识产权的核心技术和方法。
③奠定先进生物加工过程技术的基础:
在典型的生物过程技术如乙醇、乳酸、1,3丙二醇、丙烯酸等大宗化学品的生物合成生产中,通过过程优化和集成、多产物的联产等,能量消耗降低20%以上,原料转化率提高20%以上,三废总量减少50%以上,生产生物化学品、生物材料及生物能源的基础研究方面达到国际先进水平。
④发表论文400篇以上(SCI>200篇),影响因子>5的文章3-5篇。
申请发明专利40-50项(国际专利6-10项)。
⑤培养40-50名博士研究生,200名左右硕士研究生,形成一支在国际工业生物过程领域得到同行认可、在国际工业生物过程领域产生重要影响研究团队。
2、课题设置的思路,课题之间的相互关系
(1)课题设置思路
围绕工业生物过程中生物质高效转化与系统优化的关键科学问题,以对国民经济具有重要影响的大宗生物化学品为研究对象,以工业生物过程中的发现认识
创新为主线,从细胞群体效应及过程放大原理
生物/化学耦联调控
生化、生理特性分析
生化过程放大原理
生物反应/分离单元集成原理
系统控制与优化等角度分段设置6个研究课题:
课题1.大规模培养细胞群体效应
课题2.多相生化特性分析及生物过程模型化
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课题3.生化反应过程放大原理与方法课题4.生物/化学方法耦联设计与调控课题5.工业生物过程单元耦合与集成课题6.工业生物过程的系统控制与优化
(2)课题之间的相互关系
各课题相互之间的关系及课题与所需解决科学问题之间的关系如图1所示。
各课题通过解决的科学问题实现有机关联,各课题的研究组成了项目研究的循环网络,通过实现各自课题的目标及其关联来实现总体项目目标。
其中,课题1为其它课题提供基本原理,课题2和课题3为其它课题提供研究模型和放大方法,课题1-3中产生的理论知识在课题4-6中实现整合。
工业生物过程的工程科学问题课题1:
大规模培养细胞群体效应科学问题之一科学问题之二细胞群体效应及过程放大原理原理课题3:
生化反应过程放大原理与方法多相复杂体系物质和能量传递与生物转化规律方法和技术科学问题之三课题6:
工业生物过程系统控制与优化生物过程单元耦合与过程优化原理过程和优化课题2:
多相生化特性分析及生物过程模型化课题4:
生物/化学方法级联设计与调控课题5:
工业生物过程单元耦合与集成图1.各课题相互关系及各课题对解决科学问题的贡献
3、研究队伍的组织与落实情况
本项目组织了国内微生物学、生物化工、发酵工程等工业生物技术领域的主要优势单位:
北京化工大学、清华大学、中科院过程所、天津大学、华东理工大学、江南大学等。
集中了工业生物过程领域具有丰富研究经验和研究成就
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的一批学者,专业涉及生物化工、化学工程、发酵工程、分子生物学、生物分离工程、微生物学、生物反应工程、生物化学等,各单位人员在研究过程中密切合作,实现了优势互补。
主要参加人员共49人。
其中国家杰出青年基金获得者5人,长江学者1人,中科院百人计划4人,全国百篇优秀论文获得者3人及提名1人。
正高级研究人员29人,包括:
谭天伟(教授)、苏志国(研究员)、元英进(教授)、程易(教授)、陈坚(教授)、庄英萍(教授)、华兆哲(教授)、张嗣良(教授)、江正强(教授)、应汉杰(教授)、万印华(研究员)、刘春朝(研究员)、李寅(研究员)、修志龙(教授)、许平(教授)、岑沛霖(教授)、闻见平(教授)、堵国成(教授)、史仲平(教授)、徐虹(教授)、李振江(教授)、苏海佳(教授)、黄雄斌(教授)、储炬(教授)、郑裕国(教授)、朱勍(教授)、梅乐和(教授)、杨虹(教授)、陈树林(研究员)等。
副高级研究人员14人,包括:
于慧敏(副教授)、赵广荣(副教授)、王玉军(副教授)、杜伟(副教授)、刘立明(副教授)、雷建都(副研究员)、常志东(副研究员)、洪厚胜(副研究员)、冯嵬(副教授)、钱江潮(副教授)、卢文玉(副教授)、王永红(副教授)、刘袖洞(副研究员)等。
高级人员中45岁以下的占79%,实验技术人员站总人数的10%。
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二、研究工作的主要进展
1、项目前两年主要研究内容和目标
研究内容预期目标
第一年
【1】选择常见的工业模式微生物,进行细胞群体效应的产生机制研究。
对具有细胞间信号转导功能的化学分子进行结构与功能确认和定量分析。
【2】采用现代先进测试仪器,研究生物反应器内非均相体系的微观瞬态流动、传热、传质特性。
【3】针对特定的生化反应过程,研究放大过程中细胞群体生理特性和细胞代谢及外界环境的相互关系。
重点研究不同规模的发酵罐搅拌器形式、转速等对生理特性的影响。
【4】以生物高分子材料合成为研究对象,对生物-化学方法两步级联策略进行集成设计与实践。
重要生物基化学品如丙烯酸的生物合成新路线探索。
【5】研究生物代谢过程与膜分离、吸附等高效分离过程的耦合途径。
【6】研究典型生物过程(如1,3-丙二醇、乳酸、丁醇的发酵等)的优化控制方法
(1)完成几种常见的工业模式微生物
产生细胞群体效应的检测技术和研究体系建立。
(2)针对不同反应器型式内多相复杂
体系,建立基于微观瞬态流动、传热、传质特性的测定与分析方法。
(3)建立用于工业过程放大的流场特
性与细胞生理特性研究方法及其相关分析。
(4)构建1-2种生物/化学集成新工
艺或重要化学品的生物合成路线。
(5)构建1-2种反应/分离耦合新方
法。
(6)提出1-2种典型工业过程的发酵
过程优化控制策略。
(7)培养博士生10名,硕士生50名。
(8)发表SCI论文10-XXXX年
2、计划任务完成情况
前二年计划中的各项研究任务和指标均已顺利完成。
获得国家发明二等奖2项(已公示),国际合作金奖1项,省部科技进步一等奖1项,省部技术发明一等奖1项。
累计在国内外申请发明专利82项,其中PCT国际专利4项。
累计在国内、外发表论文130篇,其中SCI收录102篇。
科技成果鉴定7项。
举办国际会议4次,国际学术大会特邀报告18次,国际重要学术组织任职4人次。
有1人
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入选XXXX年度北京市科技新星计划,1人获江苏省十大女杰,并入选江苏省“333高层次人才培养工程”中青年科技领军人才,1人获全国百篇优秀博士论文。
超额完成了前二年项目的指标和任务。
2.1大规模培养细胞群体效应
2.1.1大规模培养过程中群体行为及细胞群体效应的基本规律
(1)用比较脂组学的方法分析了工业乙醇发酵过程中群体酵母细胞的磷脂组成和含量变化,应用高效液相色谱-质谱联用技术,对连续发酵过程中酵母细胞中的94种磷脂进行定性定量分析。
并用多元统计分析比较了考察了连续发酵过程不同阶段的细胞胞内磷脂的变化情况。
结果表明在连续发酵过程中不同阶段的磷脂代谢明显不同。
通过聚类分析,磷脂的代谢变化情况能准确的描述连续发酵的三个主要过程,即:
种子发酵、主发酵和末发酵期。
进一步分析表明,在描述大规模连续工业过程中,主要变化的磷脂种类是phosphatidylinositol(PI)、phosphatidylserine(PS)和phosphatidylethanolamine(PE)。
并找到了8个潜在的生物标记物,即:
PI(16:
1/18:
0,16:
1/18:
1,18:
1/18:
0,18:
1/18:
1,18:
2/18:
1,18:
2/18:
2),PS(16:
1/18:
1)和PE(16:
1/18:
1)。
(2)用基于气相色谱联合质谱(GC-TOF-MS)的代谢组学方法对工业生产中酿酒酵母的细胞内代谢物进行分析,研究发现在连续发酵和分批发酵过程中的酿酒酵母细胞中,分别检测到143及128种胞内代谢物。
主成分分析的结果进一步表明,两种发酵模式中的胞内代谢物均被分成三个阶段,即种子培养、主发酵及发酵后期,这与实际生产过程十分吻合。
另外,一些与中心碳代谢相关的代谢物如甘油、磷酸、柠檬酸等对三个发酵阶段的区分贡献较大,为潜在的生物标记物。
这些结果进一步揭示了工业生产过程中群体细胞内代谢物对工业乙醇发酵过程的重要性及必要性,从而为从代谢物组水平上揭示两种发酵过程中的酵母群体行为对环境压力的响应在代谢物水平是不同的。
(3)运用2-DE结合MADLI-TOFMS相结合的蛋白组学方法研究工业乙醇生产过程(连续发酵和分批发酵)中工业酵母群体细胞蛋白的表达水平的变化规律。
建立了连续发酵的不同发酵罐和分批发酵的不同时期工业酵母细胞群体在乙醇生产过程中的蛋白质表达图谱,进一步鉴定和分析表明在连续发酵过程中酵母细胞47个差异明显的蛋白中,17个蛋白(酶)与细胞的磷酸戊糖途径、糖酵解途径、甘油合成途径密切相关;9个蛋白(酶)与细胞氧化胁迫和热胁迫响应密切相关。
同时,分析与磷酸戊糖途径、糖酵解途径、甘油合成途径密切相关的蛋白(酶)在分批发酵不同时期的变化规律。
(4)运用脂质组学研究群体细胞在剪切力作用下磷脂分子的变化。
采用
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LC-ESI-MS,对99种磷脂分子进行了定量研究。
PCA和PLS都用于寻找可能的生物标志物。
PA和LysoPC是造成剪切处理过的细胞和正常细胞之间差异的主要物质。
进一步研究发现剪切力激活了PLD和PLC进而增加了剪切处理过的细胞中PA的含量。
这些结果说明了磷脂及相关的磷脂酶在群体细胞对剪切力响应的机械信号转导中起了重要的作用。
2.1.2细胞群体行为协同变化的调控机制
(1)细胞群体效应的分子调控机制
1)基于调控群体行为的信号分子AHL及其相应的基因,利用标准化的生物砖(BioBricks),运用了这种生物体内的时间延迟效应,完成基因触发器设计,实现了该装置触发的特性,此基因电路融合了群体效应、荧光蛋白等生物体功能部件。
2)构建了基于群体效应信号分子的,对氨苄青霉素和卡那霉素胁迫响应的大肠杆菌DH5α双菌株(ER和EG)人工共生体系。
采用LC-MS-MS和GC-TOF-MS方法,确定ER细胞能够产生3OC6HSL信号分子,EG细胞能够产生C4HSL信号分子;研究表明,在ER和EG细胞组成的共生体系中,在高氨苄青霉素(4mg/ml)和卡那霉素(0.4mg/ml)条件下,ER和EG细胞延迟期增长,但ER细胞比EG细胞更具竞争优势;细胞初始浓度固定时,随着氨苄青霉素和卡那霉素浓度的增高共生系统稳定性降低,过高的浓度会导致此共生系统崩溃。
当氨苄青霉素浓度为4mg/ml,卡那霉素浓度为0.4mg/ml时,ER和EG细胞最低初始浓度在2×106cells/ml左右就可维持此共生系统。
(2)信号分子对微生物胁迫抗性的调控
1)建立了基于化学诱变和进化代谢工程的丙酮丁醇梭菌随机突变方法,并构建了随机突变文库,研究了C.acetobutylicumSMB-1的丁醇耐受性,该菌能够耐受13g/L丁醇。
利用甲基硝基亚硝基胍(N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine,NTG)、硫酸二乙酯(Diethylsulfate,DES)和乙基甲磺酸(Ethylmethanesulfonate,EMS)为化学诱变剂,分别用高浓度、高致死率及低浓度、低致死率两种策略;建立了丙酮丁醇梭菌进化代谢工程的操作方法,获得约含104突变子的基因组规模随机突变文库;以更高丁醇耐受性进行筛选,获得了耐受丁醇浓度提高到19g/L的突变株20余株。
2)建立了基于酶标仪的高通量筛选方法:
通过构建了基于酶标仪96孔液体培养的初筛模型,以与好氧/微氧条件下丙酮丁醇梭菌活性保护方法的结合,可以加快菌株突变文库评价和筛选特异表型突变株的速度;发现反应发生后生成的络合物在5分钟内是稳定的,在低温时反应可以用来测定丁醇;最终优选并确立了一种筛选方案。
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(3)极端微生物胁迫抗性功能基因的发掘
1)完成了嗜碱单胞菌N10在不同Na+浓度条件下蛋白表达谱的差异蛋白质数据库的构建:
通过将MALDI-TOF/TOF与Denovo相结合,相互印证之后经统计分析发现在63个差异点中有39个差异点得到了鉴定,鉴定率为62%。
其中发生下调的主要是与能量合成相关的蛋白及与氨基酸合成相关的蛋白,发生上调的主要是溶质转运蛋白及与细胞分裂相关蛋白。
这些蛋白可能在细菌适应外界渗透压的升高的过程中发挥重要作用。
2)对ATP合成酶进行了初步研究
通过对嗜碱菌N10ATP合成酶的beta亚基的基因进行表达、纯化和该蛋白的多克隆抗体的制备和相应的免疫学检测,以及该蛋白基因的mRNA水平进行分析,结果显示该蛋白在最适生长条件下表达量最高。
进一步研究表明这种酶活性随pH值的升高而降低,该酶活性降低可能与该菌适应外界pH值的升高相关。
(4)链霉菌和乳杆菌规模培养的微生物群体效应研究
1)链霉菌发酵生产抗生素过程中的群体感应现象的研究:
不同的接种密度(1倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍接种密度)研究表明当接种密度小于对照起始接种量15倍的时候,产物中并没有有效霉素的同系物积累,当接种密度大于或等于15倍的时候,此产物被检测到在发酵液中的存在。
这结果可能是由于信号分子积累到一阈值导致了群体感应现象的发生所致。
回添高密度发酵培养基提取物研究表明加入了高密度发酵培养基提取物,能激发类似高密度发酵过程中有效霉素合成代谢的现象。
有关高浓度有效霉素对发酵的影响以及群体信号分子对有效霉素发酵的影响,尚在进一步研究之中。
2)乳杆菌发酵中产BSH酶过程中的细胞群体效应的研究:
考察了乳杆菌细胞群体效应的相关研究体系:
以BileSaltHydrolase(BSH)酶为目标物和主要考察指标,建立了筛选方法,已筛选获得了2株植物乳杆菌菌株作为产生细胞群体效应的研究对象,至目前已经发现了乳杆菌在产BSH酶和热应激方面具有细胞群体效应现象的存在,现正进行重现性和定量化研究。
2.1.3细胞群体效应的调控策略
(1)细胞群体效应过程调控与规模放大
1).第一类信号分子AHLs为高丝氨酸内酯类物质,对于短链AHLs分子,在AHLs刺激下基因突变菌Chromobacteriumviola
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