针织服装英语小写.docx
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针织服装英语小写
针对毛细管中单分子的激光诱导荧光检测
本研究的目的在于发展一个新型的激光诱导光谱检测方法来有效地检测流质(毛细管)中的单分子。
通过一个氩离子在钛宝石激光器中调谐到铷原子阶跃线时产生780.023nm的激光来激发在毛细管中IR140分子。
关于流动中单分子的探测已经有多种实验方案了,包括有效的激光激发和荧光检测。
1-3当分子经过聚焦的激光束时,它会在基本的电子状态和激发的电子状态之间循环,并且在每个循环懂释放光子,继而形成光子爆发。
本研究阐释了单分子检测中的一个重要概念,即如何提高样本中所有分子的检测效率,而不仅仅是经过探针的分子。
在以往关于单分子检测的实验中,大部分的分子没有经过激发激光束,结果整体的检测效率较低。
本文方法的独特之处在于将分子集中于一个毛细管中,用激发激光束来照射毛细管的整个内直径,并且用金属气过滤器吸收激光镜面散射。
溶液状态中敏感荧光检测受到了光学和溶剂中噪声源的限制。
通过将探针的体积降低到最可能小的水平,从本底发光和喇曼散射中隔离分子荧光的主要问题得到了解决。
探针体积的减小可以通过光学上限制发光\观察到的体积,或者物理上减小样本监禁的大小,或者同时采用光学和物理学上的方法。
许多实验方法已经用到了单分子检测中的样本监禁,比如鞘流动单元和电动悬浮微滴法。
通过让分子在样本流中流动,Keller等人1利用激光诱导荧光(LIF)观察单分子中的光子爆发。
运用电动悬浮将单分子限制到微滴里面,Ramsey等人2通过信噪比3检测到单分子。
Soper等人3证明了近红外分子(IR132)通过集中的高斯激光束的检测效率为97%。
通过一个非常简单的毛细管实验系统,我们运用二极管激光器产生了流动液体中的近红外荧光团,并且一次探针中检测了103-104分子。
随着更多通用激光源的发展,这种基于毛细光的方案可以简便地运用到毛细管区电泳和毛细管液相色谱的实践分析,或者是任何包括非常小样本的分析技术中。
但是,由于需要将空间探测的效率降低到单元值以下,进而最小化激光散射和本地噪音,单分子检测并未取得100%的方法效度。
本研究的重点是毛细管中单分子的有效测量。
这种方法的一大优势在于毛细管有利于分析极其细微的问题。
另外,毛细管中极其细微的物理尺寸也要求柱上检测,这排除了护套流细胞和其他类型的外部流细胞的使用。
除此之外,由于吸收情况在每种介质中时微不足道的,比如流动细胞物质、溶剂和大部分杂质,使用近红外激光作为激光诱导荧光的激发源足以引人注目。
这是有好处的,因为从这些物质中产生的背景荧光不会限制了较低的检测底限。
但是,将石英极微毛细管当做样本监禁进行单分子水平的研究还未开始,大部分原因源于识别由毛细管产生的高水平的激光镜面散射。
运用LIF进行超痕量分析的一个非常重要的问题是控制激光镜面散射。
激光镜面散射最理想的滤光器是在激光波长上展示全部的吸收,同时保持发光带的透明度。
金属汽过滤器(MVF)基于原子汽共振吸收有望成为排除窄带激光镜面散射的理想滤光器。
MVP是一个平行窗口里面带有惰性气体的加热石英细胞和激光波长上带有共振原子吸收线的挥发性金属。
MVF根据其组成部分,加热到合适的温度以便产生足够密度的金属原子来有效地吸收所有检测性的激光镜面散射。
因此,MVF中的金属原子为激光镜面散射提供了近乎完美的滤光器,使得激光能够调谐到金属蒸汽的峰巅,激光线的宽度小于MVF的吸收带宽。
跟传统的激光线控制过滤器相比,作为一种的单色仪和陷波滤波器,MVF具备以下优点:
低成本、高吸收、大信号采集固体角、窄吸收带宽、高信号吞吐量。
最近,一些MVF被证明能够有效地消除喇曼光谱的激光镜面散射。
本研究目的在于开发一种新型的LIF光谱技术来有效地检测通过微小探针体积在毛细管中流动的近红外单分子(IR140)。
激光被调谐到780.023nm的铷原子跃迁线,并集中于一个毛细管的表面。
加热的铷金属蒸汽过滤器吸收了激光镜面散射的同时忽略了分子荧光。
激发源是线宽小于铷原子吸收带宽的钛蓝宝石环形激光。
探测器是带有高光子探测效率和低暗计数率的单光子雪崩光带二极管。
由于金属蒸汽过滤器的重要性,RbMVF的传递特性得到了理论和实验的验证。
当个别分子经过激光束时,加权二次加法过滤器被用来排除光子爆发。
毛细管中单分子的检测被证明具有高度的方法有效性。
单分子检测的概念
实验部分
仪器设备单分子检测设备的原理图如图1所示。
来自于氩离子激光器的所有线(SpectraPhysics2060,MountainView,CA)被用于在环形结构中形成一个单结构、可调谐的连续波钛宝石激光器(SchwartzElectro-optics,Inc.,Orlando,FL)。
激光线宽小于10MHz。
20来自于钛蓝宝石水晶的微弱、宽带的背景荧光被一个窄带的通过干涉滤光片(0.18nmfwhmat780.1nm,OmegaOptical,Brattleboro,VT)所衰减。
样本置于一个熔融石英毛细管柱中(内直径11um,外直径139um,长10cm;PolymicroTechnology,Phoenix,AZ),机械微升注射泵控制流动(HarvardApparatus975,SouthNatick,MA)从已有的关于气密微升注射器解决和时间的介绍可知,测量体积流率接近于制造商给出的数值。
为了达到稳定的慢速流率,测量之前通常需要等待30分钟。
通过100。
C浓硫酸去掉毛细管表面上部分的聚酰亚胺可以创造一个“荧光窗口”。
激光通过一个20倍的激光扩展器(MellesGriot,Irvine,CA),并且通过毛细管的表面的摄像头(1:
1.4,f=55mm)进行聚焦。
微位移阶段(Newport461-XY-M,Irvine,CA)将刀片传到到激光束,并且在光电二极管上控制激光功率,毛细管上1/e2激光束直径被设置为11um。
由于集中激光束和毛细管内直径是相等的,系统在光学对准上很敏感。
探针体积近似为一个汽缸,该汽缸的半径等于毛细管内半径,高度为集中激光束半径的两倍。
根据毛细管的内直径和激光束的直径,探针体积约为1.05pL。
运用显微镜物镜(40x0.65,MellesGriot,Irvine,CA),我们在准确的角度上收集到荧光和激光散射,后两者通过了RbMVF。
为了在不同的围兜上对RbMVF进行吸光度测量,毛细管放在45。
的镜子上来探测通过RbMVF的激光束。
购买得到的金属蒸汽细胞(Opthos,Rockville,MD)是一个在两端带有平行石英窗口的石英汽缸(长10cm,直径2.5cm)。
剩余的铷金属(500mg)被蒸馏成疏散细胞,以便有足够金属可以提供研究中所有温度下所需要的饱和金属蒸汽。
200托的氮气(室温)用作充填气体,继而熄灭原子共振荧光和加大RbMVF的吸光带宽。
为了防止Rb金属热蒸汽冲击把窗口打开,RbMVF放在一个装有热氮加热设备的汽缸里,如图2所示。
由火炉(Lindberg55035,Watertown,WI)加热的氮气在两个窗口中流动,并返回MVF的主体,这个火炉的温度控制在±1。
C。
通过这种方式,MVF平面窗的温度将会高于MVF中心的温度,这样可以防止金属蒸汽在窗口上冷凝,否则会降低MVF的信号吞吐量和透光率。
本研究中用到的RbMVF有1年以上的时间功能完好。
RbMVF后面有一个带通干涉滤光片(10nmfwhmat830nm,Corion,Holliston,MA)可以阻止溶剂中860nm的喇曼散射。
利用第二个显微镜物镜(40x0.65,MellesGriot,Irvine,CA),RbMVF的产物再次聚焦到一个光纤尾纤(100-pmcorediameter,Canstar,ON,Canada)上,这是通过雪崩光电二极管预校准过的。
雪崩光电二极管(EG&GOptoelectronicsCanadaSPCM-200,Vaudreuil,Canada)是一个830nm上有25%光子探测效率和每秒25暗技术率的单光子计数模块。
22雪崩光电二极管产生的数字结果应用于啊电脑控制计数器\计时器(KeithleyMetrabyteCTM-05,Tauntor,MA)),以便进一步的数据分析。
为了将钛蓝宝石激光调谐到780.023nm的Rb转一线上,RbMVF加热到100。
C,毛细管中的激光散射从RbMVF转移到雪崩光电二极管。
接着,通过慢慢地调整腔内双折射滤光器,钛蓝宝石激光被调谐到RbMVF吸光率的最大值。
为了进一步最大化了吸光率,利用腔内法布里珀罗校准器进行改善的调谐。
吸光率最大值更像是一个高地而非仅仅是个峰点,因为法布里珀罗校准器可以在激光被调谐为截止波长和吸光率显著下降之前进行重要的调试。
当钛蓝宝石激光在谱线宽度为10-MHz的环形结构中操作时,780.023nm的计算激光线宽度(fwhm)小于0.081pm。
10
试剂和化学品IR140[ExcitonChemicalCo.,Inc.,Dayton,OH;chemicalname,5,5'-dichlor~-ll-(diphenylamino)-3,3'-diethyl-l0,12-ethylenethiatricarbocyanineperchlorate;CASno.5365517-7;fw=779]在甲醇(Optimagrade,FisherScientific,Orlando,FL)中溶解。
不同浓聚物下样本通过1.5×10-5M原液进行系列稀释所得,并在同一天进行分析。
甲醇中IR140的荧光最大值是780.023nm激发下的833nm。
结果和讨论
Rb金属蒸汽过滤器的特征鉴于在吸收激光镜面散射中的作用,RbMVF是毛细管单分子检测中非常重要的组成部分。
铷原子有两个主要的同位素:
85Rb和87Rb,它们的自然比例为0.727:
0.273。
23每种同位素有各自的超精细结构。
铷的熔点为39。
C,银币它可以在中度温度下产生足够的数密度原子。
从每次电子变调的共振器强度和数密度来看,24Rb的吸光剖面可以再不同条件下模拟。
根据Puerta&Martin近似,25图3展示了Rb在27、50和100。
C下的Voigt吸收剖面,即高斯和洛伦茨剖面的卷积。
如图3所示,细胞温度的上升对吸光率有着显著的影响,即反应了提高的Rb金属蒸汽数密度。
每个剖面的峰值不止一个是因为整体调谐的超精细结构。
沃伊特吸光带宽约为780.023nm上的21pm,接近于测量值。
26合乎理想的是,一旦窄激光线被调谐到100。
CRbMVF的吸光峰值,可以得到成千的吸光率。
与中性密度滤光片校准之后,通过RbMVF的透光信号可以再不同的温度下进行测量。
测量得到的透光率就转换为吸光率。
结果如图4所示,小黑点表示各个温度下的激光散射的吸光率。
170。
C上大约8的吸光率最大值受到背景为钛宝石水晶的微弱、宽带激光的影响。
单分子检测为了以近似于统一的测量效率检测单分子,毛细管必须完全在集中激光束的照射中。
Dovichi等人16和Soper等人13介绍过样本流中抛物线型流的计算方法,毛细管中分子的一般线性流速可以通过体积流率和毛细管的横截面积(9.5x10-7cm2)计算得到。
探针体积上分子的平均传输时间可以通过以下方程计算而得:
16
运输时间约为0.8ms,注射泵的体积流率被设置为0.061uL/min。
探针体积中分子传输时间的误差可能来自于直径内小毛细管的不确定性、圆柱毛细管中变形的激光束形状和布朗漫射。
先前高浓度实验残留下来的毛细管壁上的分子解析可能导致检测的分子比预先的多。
或者,检测的分子由于毛细管壁上的样本吸光率可能小于预先的分子。
流动细胞的平均光裂解概率可以通过计算依赖于激光束中荧光分子流速的荧光密度而得。
27当光功率为150mW时,随着体积流率从1.26讲到0.061uL/min,IR140的荧光信号降为最大值的85%;探针体积上IR140分子的传输时间从0.039ms上升到0.8ms,由此可见大部分分子在经过激光束时并没有受到分裂。
图5展示了IR140在不同的浓度范围内的对数校准曲线。
这些校准曲线来自于传输时间为0.8ms下三个不同的光功率。
IR140的信号是线性的,并且至少有4个数量级,从1.9x10-12到1.9x10-8M。
在线性的浓度范围内,每传输时间内探针体积上的分子平均数目为1.2到1200。
从1.9x10-12浓度的IR140以及0.8ms的传说时间,大约有1500个分子在1-s的集成时间内通过的了探针体积。
为了保证在任何给定的时间里探针体积只有一个分子,探针体积上有两个及以上分子的可能性都要降到最低。
假设在传输时间内探针体积上的分子数服从泊松分布,那么探针体积上n个分子的可能性通过以下公式计算而得:
Nt代表t时间上的分子数,k是每个传输时间的时间间隔数,λp是每时间间隔内探针体积上的分子平均数。
当IR140的浓度为1.9x10-13M,探针体积(1.05pL)上的分子平均数为0.12。
在现有的实验参数下,由于探针体积IR140单分子的传输时间为0.8ms,因此在间隔时间为200-us的计数下,k=4,λp=0.03。
换句话说,当单分子以约0.8ms的传输时间经过探针体积时,发射光子在四个连续的时间间隔上分布。
表2列出了任何给定时间上不同数量的分子在探针体积上的可能性。
大部分时间,探针体积上没有任何分子(P(n=0)=0.887),有单个分子的概率为P(n=1)=0.106,而有多个分子的概率为P(n≥2)=0.006,是相对较低的,可以忽略不计。
当IR140单分子经过聚焦激光束时,可以估计活动的平均数。
这里活动的数目指的是IR140分子信号数量的时间片段。
在测量时间T内经过探针体积的所有分子的活动的数目,Nev,可以通过以下的公式来计算:
上式中,Nev指的是在测量时间分子的活动数目;Np指的是探针体积上分子的平均数;tr指的是探针体积上单分子的传输时间。
在一个典型实验运行中([IR140]=1.9xM,Np=0.12,T=200ms,k=4,andt,=0.8ms),活动的所有数目Nev为120。
在200ms的测量时间内,大约30个分子会通过探针体积。
为了得到单个分子中的光子爆发,多种信号处理方法用来进一步的检测和控制进入探针体积的分子。
1,3.13-15,28,29单个分子的光子爆发在数据流中进行分析和查找,以便获得单分子敏感度的直接证据。
为了提高单分子中光子爆发的可视度,WQS过滤器,修正过的滑动和法,在先前的单分子检测实验中得到了检验并被证明是有效的单分子光子爆发指标。
原始数据经过了平方,并用WQS算法进行处理,公式如下:
k代表了近似于单分子通过探针体积传输时间的时间片段;
是个权重因子,是
时间点上的原始数据。
由于不知道毛细管中激光激发的实际形状和单分子的光子发射形状,权重因子可以根据实验条件给出一个最佳的S/N比率。
当分子经过图分解后,随着分子经过激光束,荧光信号缓慢提高,接着出现一个突然的停止。
为了更好地识别出随机背景噪音产生的与时间相关的荧光信号,我们选择用不对称三角斜坡代表权重分子
。
1,3
图6展示WQS中IR140溶液1.9x10-13M的过滤数据,空白是甲醇。
IR140溶液的大振幅爆发显著地验证了经过激光束中心的个别单分子。
爆发振幅中的变异来自于经过不同高斯密度激光面的分子。
当分子经过激光束的边缘时,他们受到较少的激发循环,因此释放出较少的电子。
溶液空白处光子爆发的变动来自于背景的波动和暗计数。
为了估计近红外线染色分子的检测效率,超过鉴别器阈值的WQS过滤累计数形成了溶剂空白和染色溶剂的点图。
图7展示了激光光率为100-mW时,1.9x10-13M的IR140溶液和甲醇空白中超过鉴别器阈值的过滤事件累积数。
由于空间探测效率接近于一致,测量效率用流经毛细管中测量到的分子事件与预期分子事件的比率来计算。
为了使错误的可能性最小,鉴别器阈值被设置为S(t)=5,如图6中的虚线所示。
IR140分子超过阈值的数量为110,其中1件来自于空白。
由于200ms测量时间内的预期数量约为120,测量效率小于100%,这可能由于分析物浓度和探针体积或者是毛细管壁样本吸光率的误差。
为了标出个别单分子的光子爆发,原始数据和WQS过滤数据进行了比较。
WQS幅度高于特定的鉴别器阈值的连续四个原始数据被设置为200ms测试时间内的四个(200us×4)。
这四个连续原始数据点的总光电子数给出了这个特殊单分子中的光子爆发规模。
表3总结了不同激光光率下激发的单分子事件的总数和平均探测光电子。
在保持相同的检测效率下,随着激光率的提高,鉴别器阈值也要提高。
结果显示,当激光光率分别为150、100、50mW时,每传输时间经过探针体积的单个IR140分子检测到的光电子的平均数量对应为8.5、7.0和5.9。
理想情况下,当一个单分子通过激光光束,发射光子的分布反映了激光束的高斯分布。
不幸的是,如果单个分子的光子爆发大小,这个研究中,泊松噪声会严重扭曲了高斯分布。
目前的实验配置其他一下问题是一些分子通过激光光束的边缘。
这使得准确计数单分子更加困难。
由于三个激光光率喜爱每传输时间内背景的平均数量计数小于1计数,5个或者5个以上5的信号数量证明LOD的概念,但并不能证明LOG的情况。
表4比较了IR132和IR140的近红外单分子检测。
尽管同样的光子检测效率下,IR140单分子产生的平均光子比较低,但是由于整个毛细管内直径得到了激光束的完全照射以达到近似的空间探测效率,测量效率达到了4阶。
结论
总之,本研究论述了IR140单分子的高效率光子爆发检测。
单分子检测领域的研究有许多有趣和相关的部分。
例如,金属蒸汽过滤器的使用和照射整个毛细管内直径产生的高空间探测效率是非常独特的。
这种方法的关键在于运用金属蒸汽过滤器来最小化毛细管产生的激光散射。
170。
C铷金属蒸汽过滤器的吸光率约为8。
我们认为,吸光率的最大值受到钛蓝宝石激光发出的背景荧光的影响。
近红外线激发和检测通过降低杂质产生背景噪音可以产生超灵敏的荧光检测。
荧光信号和浓度图具有很好的线性关系,至少有从1.9x10-12到1.9x10-8M的4阶高度。
为了提高单分子的检测,我们运用了数字权重二次方加总过滤器来排除原始数据产生的个别光子爆发。
基于单分子灵敏度的毛细管检测方法对于众多分析工具有着重要的影响,比如细胞分类和分级、免疫测定、DNA测序,以及微型化工分析技术,如管电泳、填充毛细管液相色谱和开放的管状毛细管液相色谱法。
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