RNA提取实验操作步骤注意事项及问题指南.docx
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RNA提取实验操作步骤注意事项及问题指南
RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南
准备试剂:
氯仿,异丙醇,75℅乙醇,无RNase水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处理过水配制)。
操作步骤:
1.匀浆处理
a.植物组织:
以叶片RNA提取为例.取新鲜叶片在液氮中充分研磨或将叶片剪碎后直接在Trizol中研磨,研磨要迅速,最好不要超过1min.,大约100mg叶片使用1mlTrizol.
b.动物组织:
以鼠肝脏RNA提取为例.取新鲜或-70℃冻存组织,每50-100mg组织加1mlTrizol,用匀浆仪进行匀浆处理.样品体积一般不要超过Trizol体积10%.
c.单层培养细胞.
直接在培养板中加入Trizol裂解细胞,每10cm2面积加1mlTrizol.用取样器吹打几次.
注意:
Trizol加量根据培养板面积决定,不是由细胞数决定.如果Trizol加量不足,可能导致提取RNA中有DNA污染.
d.细胞悬液:
离心取细胞,每5-10×106动物、植物与酵母细胞或每107细菌细胞加1mlTrizol。
加Trizol前不要洗涤细胞,以免降解mRNA。
一些酵母与细菌细胞可能需要匀浆仪处理。
e.血液处理:
直接取新鲜血液,加入3倍体积红细胞裂解液,混匀后室温放置10min,10000rpm离心1min。
弃上清,收集白细胞沉淀。
每1ml血液收集白细胞沉淀中加入1mlTrizol。
2.将匀浆样品在15-30℃放置5mim,使得核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:
4℃10000rpm离心10min,取上清。
如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等,可离心去除。
离心得到沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA,上清中含有RNA。
处理脂肪组织样品时,上层是大量油脂,应除去。
取澄清匀浆溶液进行下一步操作。
4.每使用1mlTrizol加0.2ml氯仿,盖好管盖,剧烈震荡15s,室温放置3min。
如不能涡旋混匀,可手动颠倒混匀2min代替。
5.4℃10000rpm离心10-15min,样品会分成三层:
红色有机相,中间层与上层无色水相,RNA主要在水相中,把水相(约600ul,约为所用Trizol试剂60%)转移到新管中。
(如要分离蛋白质与DNA,可保留黄色有机相)
6.在得到水相溶液中加入等体积异丙醇,混匀,-20℃放置20-30min。
植物或动物组织RNA提取中,容易沉淀出大量蛋白等污染物,导致电泳检测时看不到RNA。
可以按以下步骤操作减轻污染:
在上清中加入1/2体积异丙醇,1/2体积RNA助沉剂,然后进行以下操作。
7.4℃10000rpm离心10min,去上清。
离心前RNA沉淀经常是看不见,离心后在管侧与管底形成胶状沉淀。
8.加入1ml75%乙醇(DEPC水处理过水配制)洗涤沉淀。
每使用1mlTrizol至少加1ml乙醇。
9.4℃10000rpm离心2min,弃上清;短暂快速离心,用移液器小心吸弃上清,注意不要吸弃沉淀。
10.室温放置晾干(不要晾得过干,RNA完全干燥后会很难溶解,大约晾干2-3min左右即可)。
加入适量DEPC水(根据实验需要,可加30-100ul水)或0.5%SDS,用枪头吸打几次,充分溶解RNA。
如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。
RNA也可用100℅去离子甲酰胺溶解,-70℃保存。
注意事项:
1.从少量样品中提取RNA(1-10mg组织或102-104细胞):
加800ulTrizol,样品裂解后加氯仿,分层,沉淀RNA前,加5-10ugRNase-free糖原,糖原会与RNA一同沉淀出来,糖原浓度不高于4mg/ml时不会影响反转录cDNA第一链合成,也不影响PCR反应。
2.匀浆后,加氯仿前,样品可在-70℃放置一个月以上:
RNA沉淀可以保存在75%酒精中,2-8℃一个星期或-20℃一年以上。
如果要长期保存,RNA可以溶解于100%去离子甲酰胺中,-70℃长期保存。
预防RNase污染,应注意以下几个方面:
1.经常更换新手套。
因为皮肤经常带有细菌,可能导致RNase污染。
2.使用无RNase塑料制品与枪头,避免交叉污染。
3.RNA在Trizol试剂中不会被RNase降解。
但提取后继续处理过程中应使用不含RNase塑料与玻璃器皿。
玻璃器皿可在150℃烘烤4h,塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10min,然后用水彻底清洗,再灭菌,即可去除RNase。
4.配制溶液应使用无RNase水(将水加入到干净玻璃瓶中,加入DEPC至中浓度0.1%(v/v),放置过夜,高压灭菌。
注:
DEPC有致癌之嫌,需小心操作)。
不同组织或细胞RNA提取预期得率
植物叶片100-200ug/g叶片
动物组织200-400ug/g肝脏组织
动植物培养细胞5-10ug/106细胞
大肠杆菌2-10ug/mlDH5α过夜菌
血液3-5ug/ml人全血
问题指南:
低得率
A.样品裂解或匀浆处理不彻底
B.最后得到RNA沉淀未完全溶解
A260/A280<1.65
A.检测吸光度时,RNA样品不是溶于TE,而是溶于水。
低离子浓度与低pH条件下A280会较高。
B.样品匀浆时加试剂量太少。
C.匀浆后样品未在室温放置5min。
D.水相中混有有机相。
E.最后得到RNA沉淀未完全溶解。
RNA降解
A.组织取出后没有马上处理或冷冻。
B.样品或提取RNA沉淀保存于-5~-20℃,未在-60~-70℃保存。
C.细胞在胰蛋白酶处理时被破坏。
D.溶液或离心管未经RNase去除处理。
E.电泳时使用甲酰胺pH低于3.5。
DNA污染
A.样品匀浆时加试剂体积太少。
B.样品中含有组织溶剂(如乙醇,DMSO等),强缓冲液或碱性溶液。
蛋白与多糖污染
A.样品中蛋白、多糖含量高。
B.样品量太大。
C.水相中混有有机相。
D.第6步中加入RNA助沉剂可以帮助去除这些污染。
RNA提取一般步骤总结
RNA提取原理:
通过变性剂破碎细胞或者组织,然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA,再经过沉淀,洗涤,晾干,最后溶解。
但是由于RNA酶无处不在,随时可能将RNA降解,所以实验中有很多地方需要注意,稍有疏忽就会前功尽弃。
RNA提取一般步骤
所有RNA提取过程中都有五个关键点,即:
样品细胞或组织有效破碎;有效地使核蛋白复合体变性;对内源RNA酶有效抑制;有效地将RNA从DNA与蛋白混合物中分离;对于多糖含量高样品还牵涉到多糖杂质有效除去。
但其中最关键是抑制RNA酶活性。
RNA提取目前阶段主要可采用两种途径:
提取总核酸,再用氯化锂将RNA沉淀出来;直接在酸性条件下抽提,酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。
第一种提取方法将导致小分子量RNA丢失,目前该方法使用频率已很低。
实验步骤:
破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA。
1、破碎组织与灭活RNA酶可以同步进行,可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织,加入β-ME可以抑制RNA酶活性。
2、分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂,加入少量异戊醇,经过此步,离心,RNA一般分布于上层,与蛋白层分开。
3、沉淀RNA一般用乙醇、3MNaAc(pH-5.2)或异丙醇。
4、洗涤RNA使用70%乙醇洗涤,有时,为避免RNA被洗掉,此步可以省掉,洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇,但是不能过于干燥,否则不易溶解。
5、融解RNA一般使用TE。
6、保存RNA应该尽量低温。
为了防止痕量RNase污染,从富含RNase样品(如胰脏、肝脏)中分离到RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量RNA,对于长期贮存更是如此。
从大鼠肝脏中提取RNA,在水中贮存一个星期就基本降解了,而从大鼠脾脏中提取RNA,在水中保存3年仍保持稳定。
另外,长度大于4kb转录本对于痕量RNase降解比小转录本更敏感。
为了增加贮存RNA样品稳定性,可以将RNA溶解在去离子甲酰胺中,存于-70℃。
用于保存RNA甲酰胺一定不能含有降解RNA杂物。
来源于胰脏RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。
当准备使用RNA时,可以使用下列方法沉淀RNA:
加入NaAc至0.3M,12,000×g离心5分钟。
氯化锂法提取总RNA:
本方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶,用氯化锂选择沉淀RNA,其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA,具有快速简洁长处,但也存在少量DNA污染及RNA得率不高,小RNA丢失缺陷。
试验试剂:
1、氯化锂/尿素溶液【氯化锂126g(3M)尿素、360g(6M)加水至1L,过滤灭菌】
2、悬浮液【10mM?
Tris-HCL(pH7.6),1mM?
EDTA(pH8,0),0.5%SDS】
试验步骤:
1、对于大量组织或细胞,则每克组织或细胞加入5-10ml氯化锂-尿素溶液,匀桨器高速匀桨2分钟;对于少量细胞(107个细胞/ml),则每克组织或细胞加入0.5ml氯化锂-尿素溶液手工匀桨,并转移至Eppendof管中。
2、匀桨液在0-4℃放置4小时后,12000g离心30分钟。
3、取沉淀,加入原匀桨液1/2体积氯化锂-尿素溶液,重复步骤2。
4、沉淀用原匀桨液1/2体积氯化锂-尿素溶液复溶后,加入等体积酚/氯仿/异戊醇在室温放置15-30分钟并不时摇动混匀,4000g离心5分钟。
5、取上层水相,加1/10倍体积3M乙酸钠(pH5.2)及2倍体积乙醇,-20℃放置1小时,5000g离心。
6、70%乙醇洗沉淀一次。
真空干燥。
7、RNA溶解液溶解沉淀,得RNA,分装,于-70℃保存。
蛋白酶-热酚法-本方法适合于病毒RNA提取
试验试剂:
1、蛋白酶K(终浓度50ug/ml)
2、2×缓冲液:
1%SDS20mMTris-HCL(pH7.6)?
0.2MnaCL
试验步骤:
1、提纯病毒液中加入等体积缓冲液、蛋白酶K,37℃40-50分钟。
2、加入等体积65℃预热酚溶液,轻徭,在65℃保温5分钟后再轻徭。
3、离心,取上清,氯仿抽提一次。
4、取上层水相,加1/10倍体积3M乙酸钠(pH5.2)及2倍体积乙醇,-20℃放置1小时,5000g离心(10000g,10min)。
5、70%乙醇洗沉淀一次。
真空干燥。
6、RNA溶解液溶解沉淀,得RNA,分装,于-70℃保存。
RNA提取实验经验心得总结
一:
实验准备
实验之前必须先准备好相关试剂与实验用品.
试剂:
1.TRIZOL,一步法提取RNA用,最好是INVITROGENE,100ml850RMB,不过也有国产,便宜些.这个试剂是非常关键,也是不能省,经常有很多朋友不想买这个,嫌贵,个人感觉是非买不可,不然用其他办法自己配话也不便宜,而且配过程中很毒.
2.异丙醇,无水乙醇,三氯甲烷(氯仿),DEPC
3.逆转录酶等.一般如果做次数不是很多话可以买试剂盒,里面什么都有,PROMEGA也不是很贵,记得是30次600多.但是如果实验室做得比较多话,还是自己分开买比较好.M-MLV逆转录酶个人觉得PROMEGA最好,而且不贵,其他公司我用得也不多,反正一直用PROMEGA,还有DNTP,oligod(T)n,RNA酶抑制剂,除了逆转录酶买 PROMEGA,其他几样我都是买TAKARA,因为promega其他几样都很贵,这样配起来用一点也不比原装差.当然实验室比较富裕也可以买好,不过话说回来,咱们花经费大多数还是民脂民膏,这些不太关键地方省着点比较好(我是不是太罗嗦了!
)
4.用具.
各种大小枪头与EP管。
由于RNA提取过程中对于RNA酶是非常敏感,所以枪头与管子都要做灭酶处理。
灭酶正常程序是用加入DEPC水泡枪头与管子,过夜。
DEPC浓度是0.1%。
DEPC是强致癌物,做时候要戴手套口罩,作好防护措施。
泡好后再高压,烘干。
灭酶除了用DEPC处理外,还可以用氯仿泡枪头与管子,不用泡过夜,1-2小时就行,也没有DEPC那么恐怖,泡后也是高压烘干。
5.水。
实验用水也是很关键,必须用DEPC处理灭过酶水才可以。
具体做法是将去离子水中加入0.1%DEPC,摇过夜,之后再高压。
高压这步是不能省,因为必须用高压把残留DEPC分解掉,不然会影响后续反应。
二.实验步骤
TRIZOL提取RNA原理就是利用变性剂将细胞裂解,释放出蛋白质,DNA,RNA,之后根据它们在不同PH值与不同极性溶剂中溶解度不一样。
而把RNA提取出来。
详细原理可以自己查一查,在这里不做赘述。
1.样品处理
对于组织样品,书上说办法是匀浆后加TRIZOL,但是我经验是用匀浆器匀浆话很多组织都是沾在匀浆器壁上了,所以我一般都是用小剪刀剪,剪时候要耐心,剪得很碎才行。
一般样品其始量大概黄豆那么大一坨就行了,加1mlTRIZOL,然后在EP管中剪碎。
样品尽量用新鲜,不是新鲜泡在PBS中一段时间也行。
样品泡在TRIZOL里面后RNA就基本不会降解,这一步可以放在冰箱里面冻起来,可以保存一段时间
2.RNA提取。
往第一步中剪碎样品与TRIZOL中加入0.2ml氯仿,之后剧烈摇晃。
震荡,此时整个液体颜色应该变成一种粉红色。
之后静置10分钟,静置后可以看到液体分层了。
12000转4度离心10分钟,可以看见液体分层很明显,最上面是无色水相,RNA就溶解在里面,中间一层是白色固体,这层是蛋白质与DNA形成复合体,下面是红色酚相。
把上层水相吸到另外一个管子里面,注意不要把下面两层吸出来了,宁愿少一下没关系。
往水相液体中加入500ul无水乙醇或者是异丙醇,上下颠倒混匀,此时如果RNA量多话可以看见一些油一样东西,反正就是感觉怪怪那种,不过一般都不会出现明显沉淀。
之后12000转离心10分钟,离心之后就可以看见管底有点半透明东西了,那就是我们要RNA。
倒掉无水乙醇或者异丙醇,加入500ul用DEPC处理水配制70%乙醇,以洗涤RNA,加入后把管子敲一敲,尽量使RNA沉淀飘起来。
之后在7500转离心8分钟,到掉乙醇,倒扣在干净吸水纸上面,空气室温干燥,时间可以稍长点,40分钟到1小时,以看不见明显液滴为准。
干后用20ul或者30ulDEPC水溶解RNA,50度保温1小时。
之后得到RNA就可以泡个电泳或者测个浓度什么,就看大家需要了,具体方法可以自己查一查,因为我一般是用RNA做RT-PCR,或者是扩基因全长,所以我一般都不用电泳或者测浓度,都是等到逆转录完成之后,用beta-actin或者其他内参做个PCR检测RNA质量。
补充一点:
上述实验与下面逆转录都要在超净台里面完成。
3.逆转录
总RNA提取之后,往往我们要是mRNA,并且由于RNA不好保存,所以要把RNA经逆转录变成cDNA,就可以方便保存与操作了。
逆转录过程就是照着说明书一步步做了,所以就简单说一下。
取8-10ulRNA,加上1uloligod(T),用水补足13ul,这一步RNA量是可以调节。
70度变性10分钟,然后迅速放在冰上,这一步是为了让oligod(T)结合到mRNA上。
当然,有实验需要用随机引物做,大家自己把握。
变性后加如5*buffer,dntp,RNA酶抑制剂,逆转录酶,42度保温60分钟,这一步最好是在PCR仪上做。
保温后再94度变性5分钟,冰上放置。
好了,cdna得到了,下面就是要检验一下质量了,也就是拿beta-actin引物为内参做个PCR了。
看看扩出来亮度怎么样了(具体关于引物设计与PCR优化有时间我会发到PCR版上去)。
好了,如果内参扩出来比较好话,那你就成功了,可以做下面试验了。
总来说,RNA提取过程中最应该注意就是RNA酶防止,所有操作在超净台完成,然后一定要带一次性手套,而且一直要换。
其他器具处理就象前面说那样了。
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