测定细菌数量的方法.docx
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测定细菌数量的方法
测定细菌数量的方法
1、计数器测定法:
即用血细胞计数器进行计数。
取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内,用显微镜观察计数。
由于计数室的容积是一定的(O.1mm3),因而根据计数器刻度内的细菌数,可计算样品中的含菌数。
本法简便易行,可立即得出结果。
本法不仅适于细菌计数,也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。
2、电子计数器计数法:
电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化,小孔仅能通过一个细胞,当一个细胞通过这个小孔时,电阻明显增加,形成一个脉冲,自动记录在电子记录装置上。
该法测定结果较准确,但它只识别颗粒大小,而不能区分是否为细菌。
因此,要求菌悬液中不含任何碎片。
3、活细胞计数法
常用的有平板菌落计数法,是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。
取一定容量的菌悬液,作一系列的倍比稀释,然后将定量的稀释液进行平板培养,根据培养出的菌落数,可算出培养物中的活菌数。
此法灵敏度高,是一种检测污染活菌数的方法,也是目前国际上许多国家所采用的方法。
使用该法应注意:
①一般选取菌落数在30~300之间的平板进行计数,过多或过少均不准确;②为了防止菌落蔓延,影响计数,可在培养基中加入O.001%2,3,5一氯化三苯基四氮唑(TTC);③本法限用于形成菌落的微生物。
广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验,是最常用的活菌计数法。
4、比浊法
比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。
细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比,与光密度成正比,所以,可用光电比色计测定菌液,用光密度(OD值)表示样品菌液浓度。
此法简便快捷,但只能检测含有大量细菌的悬浮液,得出相对的细菌数目,对颜色太深的样品,不能用此法测定。
5、测定细胞重量法
此法分为湿重法和干重法。
湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重;干重法系单位体积培养物经离心后,以清水洗净放人干燥器加热烘干,使之失去水分然后称重。
此法适于菌体浓度较高的样品,是测定丝状真菌生长量的一种常用方法。
6、测定细胞总氮量或总碳量
氮、碳是细胞的主要成分,含量较稳定,测定氮、碳的含量可以推知细胞的质量。
此法适于细胞浓度较高的样品。
7、颜色改变单位法(colourchangeunit,简称CCU)
这种方法通常用于很小,用一般的比浊法无法计数的微生物,比如支原体等,因为支原体的液体培养物是完全透明的,呈现为清亮透明红色,因此无法用比浊法来计数,由于支原体固体培养很困难,用cfu法也不容易计数,因此需要用特殊的计数方法,即CCU法。
它是以微生物在培养基中的代谢活力为指标,来计数微生物的相对含量的,下面以解脲脲原体为例,简单介绍其操作:
(1).取12只无菌试管,每一管装1.8ml解脲脲原体培养基。
(2).在第一管加入0.2ml待测解脲脲原体菌液,充分混匀,从中吸取0.2ml加入第二管,依次类推,10倍梯度稀释,一直到最末一管
(3).于37度培养,以培养基颜色改变的最末一管作为待测菌液的CCU,也就是支原体的最大代谢活力,比如第六管出现颜色改变,他的相对浓度就是10的6次方CCU/ml.
一般来说,比浊法和菌落计数法就可以满足绝大多数细菌的计数,但是对支原体这样比较特殊的微生物,用CCU法比较合适。
测定微生物生长的方法很多,各种方法均有其优缺点,也不是在任何情况下都适用。
在微生物学工作中一般常用的是平皿菌落计数法、计数器法和比浊法。
至于哪种方法比较适合你,得根据你的具体条件而定。
分离和纯化
一、目的要求
掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化物的基本操作技术。
二、基本原理
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
本实验采用平板分离法:
该方法操作简便,普遍用于微生物的分离与纯化,其包括两个方面:
1.选择适合于待分离微生物的生长条件等要求或者加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长,而抑制其它微生物生长的环境,从而淘汰一些不需要的微生物;
2.微生物在固体培养基生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体,因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。
获得单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等计数来完成的。
纯培养的确定:
1.确定其菌落观察特征;
2.结合显微镜检测个体形态特征的确定。
三、器材
1.菌种迷曲霉;
2.培养基高氏Ⅰ号培养基,牛肉膏蛋白胨培养基,马丁氏琼脂培养基,查氏琼脂培养基;
3.溶液或试剂10%酚盛9ml无菌水的试管盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶,4%水琼脂;
4.仪器或者其他用具无菌玻璃涂棒无菌吸管接种环无菌培养皿链霉素和土样显微镜血细胞计数板等。
四、操作步骤
1.稀释涂布平板法
(1)倒平板将肉膏蛋白胨琼脂培养基,高氏Ⅰ号琼脂培养基;马丁氏琼脂培养基加热溶化,待冷至55~60℃,高氏Ⅰ号琼脂培养基加入10%酚数滴,马丁氏琼脂培养基加入链霉素溶液。
混匀后分别倒平板,每种培养基倒三皿;
(2)制备土壤稀释溶液称取土样10g,放入盛有90ml无菌水并带入玻璃珠的三角烧瓶,振动约20min,使土样与水分混合,将细胞分散.用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀,然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一个盛有9ml无菌水的试管中,混合均匀,以此推制成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6不同稀释的土壤溶液;
(3)涂布将上述每种培养基的三个平板地面分别用记号笔写上10-4,10-5,10-6三种稀释度,然后用无菌吸管分别由10-4,10-5,10-6三管土壤稀释液中各取0.1ml对号放入已写好室温下静置5~10min,使菌液吸附进培养基;
(4)培养将高氏Ⅰ号琼脂培养基平板;马丁氏琼脂培养基平板倒置于28℃温室中培养3~5day,肉膏蛋白胨平板倒置于37℃温室中培养2~3day;
(5)挑菌落将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到上述三种培养基的斜面上,分别置28℃和37℃温室培养,大菌苔长出后,检查其特征是否一致,同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是为单一的微生物。
若发现有杂菌,需要再一次进行分离、纯化,直到获得纯培养。
2.平板划线分离法
(1)倒平板按稀释涂布平板倒平板,并用记号标明培养基名称,土样编号和实验日期;
(2)划线在近火焰处,左手拿皿底,右手拿接种环,挑取上述的土壤悬液一环在平板上划线.划线的方法很多,但无论采用那种方法,其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释,使之形成单个菌落;
(3)挑菌落同稀释涂布平板法,一直到分离的微生物认为纯化为止。
库克菌的检测方法
耐酸耐热菌(库克)的检测方法
1适用范围
本方法适用于清汁、浊汁、水和浓缩果汁中的耐酸耐热菌的检测。
2仪器和试剂
2.1恒温水浴:
80±1℃。
2.2恒温培养箱:
40±1℃。
2.3灭菌培养皿:
直径为90mm。
2.4灭菌试管:
18×180mm。
2.5滤膜:
0.45um水系一次性滤膜。
2.6酵母粉。
2.7蛋白胨。
2.8琼脂粉。
2.9葡萄糖。
2.10吐温80。
2.1112.5%苹果酸。
2.12灭菌蒸馏水。
2.13K氏培养基平板:
在1000ml的三角瓶中放入500ml蒸馏水,加入1.25g酵母粉、2.50g蛋白胨、6.50g琼脂粉、0.5g葡萄糖和0.5ml吐温80,使其溶解,轻轻盖上三角瓶的盖子,在121℃灭菌25分钟;在一个小烧杯中加入10ml蒸馏水和1.25克的苹果酸,搅拌直至溶解,将苹果酸的水溶液用0.45um的滤膜过滤,将处理过的苹果酸水溶液加入到灭菌的K氏培养基中,搅拌均匀,使其pH值达到3.7±0.1。
当冷却到大约50℃时,将K氏培养基倾注到培养皿中,凝固后在0-5℃的冰箱中储存,有效期60天,并记录配制日期。
3操作步骤
3.1样品处理
3.1.1浓缩清汁:
打开水浴锅,调整温度到80±1℃。
以无菌操作,取10ml浓缩清汁于15ml灭菌的试管中,再移取10ml浓缩清汁于另一带有温度计的15mL的试管中,作为温度控制用,盖上样品试管的盖子。
将上述样品试管和温度控制试管放在水浴锅中,当温度达到80±1℃,开始计时,维持13分钟(用计时器计时)。
冷却至室温,用90-100ml的灭菌蒸馏水将热处理过的样品转入灭菌容器中,摇匀。
将稀释后的样品溶液用0.45um的滤膜真空过滤。
3.1.2清汁、水:
打开水浴锅,调整温度到80±1℃。
以无菌操作,取150ml清汁(或水)于已灭过菌的玻璃样品瓶中,再移取150ml清汁(或水)于另一带有温度计的玻璃样品瓶中,作为温度控制用,盖上样品瓶的盖子。
将上述样品试管和温度控制试管放在水浴锅中,当温度达到80±1℃,开始计时,维持13分钟(用计时器计时)。
将热处理过的样品冷却至室温,用0.45um的滤膜真空过滤。
3.1.3浊汁:
打开水浴锅,调整温度到80±1℃。
以无菌操作,取20ml浊汁于已灭过菌的试管中,再移取20ml浊汁于另一带有温度计的20mL的试管中,作为温度控制用,盖上样品试管的盖子。
将上述样品试管和温度控制试管放在水浴锅中,当温度达到80±1℃时,开始计时,维持13分钟(用计时器计时)。
冷却至室温,将热处理的样品用0.45um的滤膜真空过滤。
3.2培养及计数
取掉过滤器的上部装置,用灭菌的镊子,将过滤膜从过滤器上取下放在K氏培养基上,轻敲数次,以保证滤膜与培养基接触。
倒置于40-41℃恒温培养箱中,在恒温培养箱底部放置一个有水的盘子,以调整恒温培养箱的湿度,培养5天。
培养结束后,记录该培养温度下滤膜上的菌落数。
根据对样品的污染情况,可选择稀释度。
用灭菌吸管吸取25ml样品,加入到225ml灭菌蒸馏水中,做成1:
10的稀释度;用灭菌吸管吸取1:
10的稀释液25ml,加入到225ml灭菌蒸馏水中,做成1:
100的稀释度,稀释后的样品的检测方法同上。
培养结束后,记录滤膜上的菌落数,并按相应的稀释度进行计算。
4数据处理
结果报告10ml的浓缩清汁样品中含有的菌落数,报告单位为cfu/10ml。
结果报告150ml的清汁(或水)样品中含有的菌落数,报告单位为cfu/150ml。
结果报告20ml的浊汁样品中含有的菌落数,报告单位为cfu/20ml。
参考资料:
库克实验室耐热耐酸菌的检测方法。
显微技术
显微技术
显微技术是微生物检验技术中最常用的技术之一。
显微镜的种类很多,在实验室中常用的有:
普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。
而在食品微生物检验中最常用的还是普通光学显微镜。
一、普通光学显微镜的结构和基本原理:
1.结构:
光学显微镜是由光学放大系统和机械装置两部分组成。
光学系统一般包括目镜、物镜、聚光器、光源等;机械系统一般包括镜筒、物镜转换器、镜台、镜臂和底座等。
(图3-1)
标本的放大主要由物镜完成,物镜放大倍数越大,它的焦距越短。
焦距越小,物镜的透镜和玻片间距离(工作距离)也小。
油镜的工作距离很短,使用时需格外注意。
目镜只起放大作用,不能提高分辨率,标准目镜的放大倍数是十倍。
聚光镜能使光线照射标本后进入物镜,形成一个大角度的锥形光柱,因而对提高物镜分辨率是很重要的。
聚光镜可以上下移动,以调节光的明暗,可变光阑可以调节入射光束的大小。
显微镜用光源,自然光和灯光都可以,以灯光较好,因光色和强度都容易控制。
一般的显微镜可用普通的灯光,质量高的显微镜要用显微镜灯,才能充分发挥其性能。
有些需要很强照明,如暗视野照明、摄影等,常常使用卤素灯作为光源。
图3-1 光学显微镜结构图
2.原理:
显微镜的放大效能(分辨率)是由所用光波长短和物镜数值口径决定,缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率,可见光的光波幅度比较窄,紫外光波长短可以提高分辨率,但不能用肉眼直接观察。
所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的,提高数值口径是提高分辨率的理想措施。
要增加数值口径,可以提高介质折射率,当空气为介质时折射率为1,而香柏油的折射率为1.51,和载片玻璃的折射率(1.52)相近,这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜,从而提高分辨率。
显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积,而物镜的放大倍数越高,分辨率越高。
二、普通显微镜的使用方法
1、低倍镜观察
先将低倍物镜的位置固定好,然后放置标本片,转动反光镜,调好光线,将物镜提高,向下调至看到标本,再用细调对准焦距进行观察。
除少数显微镜外,聚光镜的位置都要放在最高点。
如果视野中出现外界物体的图像,可以将聚光镜稍微下降,图像就可以消失。
聚光镜下的虹彩光圈应调到适当的大小,以控制射入光线的量,增加明暗差。
2、高倍镜观察
显微镜的设计一般是共焦点的。
低倍镜对准焦点后,转换到高倍镜基本上也对准焦点,只要稍微转动微调即可。
有些简易的显微镜不是共焦点,或者是由于物镜的更换而达不到共焦点,就要采取将高倍物镜下移,再向上调准焦点的方法。
虹彩光圈要放大,使之能形成足够的光锥角度。
稍微上下移动聚光镜,观察图像是否清晰。
3、油浸镜观察
油浸镜的工作距离很小,所以要防止载皮片和物镜上的透镜损坏。
使用时,一般是经低倍、高倍到油浸镜。
当高倍物镜对准标本后,再加油浸镜观察。
载玻片标本也可以不经过低倍和高倍物镜,直接用油浸镜观察。
显微镜有自动止降装置的,载玻片上加油以后,将油浸镜下移到油滴中,到停止下降为止,然后用微调向上调准焦点。
没有自动止降装置的,对准焦点的方法是从显微镜的侧面观察,将油浸镜下移到与载玻片稍微接触为止,然后用微调向上提升调准焦点。
使用油浸镜时,镜台要保持水平,防止油流动。
油浸镜所用的油要洁净,聚光镜要提高到最高点,并放大聚光镜下的虹彩光圈,否则会降低数值口径而影响分辨率。
无论是油浸镜或高倍镜观察,都宜用可调节的显微镜灯作光源。
三、普通显微镜的保养
显微镜是精密贵重的仪器,必须很好地保养。
显微镜用完后要放回原来的镜箱或镜柜中,同时要注意下列事项:
1、观察完后,移去观察的载玻片标本。
2、用过油浸镜的,应先用擦镜纸将镜头上的油擦去,再用擦镜纸蘸着二甲苯擦拭2—3次,最后再用擦镜纸将二甲苯擦去。
3、转动物镜转换器,放在低倍镜的位置。
4、将镜身下降到最低位置,调节好镜台上标本移动器的位置,罩上防尘套。
镜头的保护最为重要。
镜头要保持清洁,只能用软而没有短绒毛的擦镜纸擦拭。
擦镜纸要放在纸盒中,以防沾染灰尘。
切勿用手绢或纱布等擦镜头。
物镜在必要时可以用溶剂清洗,但要注意防止溶解固定透镜的胶固剂。
根据不同的胶固剂,可选用不同的溶剂,如酒精、丙酮和二甲苯等,其中最安全的是二甲苯。
方法是用脱脂棉花团蘸取少量的二甲苯,轻擦,并立即用擦镜纸将二甲苯擦去,然后用洗耳球吹去可能残留的短绒。
目镜是否清洁可以在显微镜下检视。
转动目镜,如果视野中可以看到污点随着转动,则说明目镜已沾有污物,可用擦镜纸擦拭接目的透镜。
如果还不能除去,再擦拭下面的透镜,擦过后用洗耳球将短绒吹去。
在擦拭目镜或由于其他原因需要取下目镜时,都要用擦镜纸将镜筒的口盖好,以防灰尘进入镜筒内,落在镜筒下面的物镜上。
四、显微计数
利用血球计数器在显微镜下直接计数是一种常见的微生物计总数的方法。
因为计数器载片和盖片间的容积一定,所以可以根据显微镜下观察到的微生物数目来计算单位体积内微生物总数。
血球计数器是一只特制载玻片。
载片上有两个方格网,每一方格网共分九个大方格,其中间的一个大方格用来做微生物计数,所以又称为计数室。
计数室的刻度一般有两种,一种是每个大方格分成16个中方格,每中方格又分成25个小方格。
另一种是一个大方格分25个中方格,每个中方格又分成16个小方格,不论哪一种,一个大方格,都等分成(25×16或16×25)400个小方格。
(图3-2)因为每个大方格边长为1毫米,载片与盖片间距离为0.1毫米,所以每个计数室(1个大方格)体积为0.1
图3-2 两种血球计数板
a.25X16计数板b.16X25计数板立方毫米。
测出每个中方格菌数,就可以算出一个大方格的菌数,由此推算出1毫升菌液内所含的菌数。
一个大方格是16个中方格时,应当数4角4个中方格(即100个小方格)的菌数,一个大方格是25个中方格时,除取4角4个中方格外,还要数中央一个中方格(即为80个小方格)的菌数。
计算公式如下:
16×25计数板:
总菌数/ml=×400×10000×稀释倍数
=每个小方格内菌数×4×106×稀释倍数
25×16计数板:
总菌数/ml=×400×10000×稀释倍数
=每小方格内菌数×4×106×稀释倍数
染色技术
染色技术
由于微生物细胞含有大量水分(一般在80-90%以上),对光线的吸收和反射与水溶液的差别不大,与周围背景没有明显的明暗差。
所以,除了观察活体微生物细胞的运动性和直接计算菌数外,绝大多数情况下都必须经过染色后,才能在显微镜下进行观察。
但是,任何一项技术都不是完美无缺的。
染色后的微生物标本是死的,在染色过程中微生物的形态与结构均会发生一些变化,不能完全代表其生活细胞的真实情况,染色观察时必须注意。
本节包括四部分:
一、染色的基本原理
微生物染色的基本原理,是借助物理因素和化学因素的作用而进行的。
物理因素如细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等。
化学因素则是根据细胞物质和染料的不同性质而发生地各种化学反应。
酸性物质对于碱性染料较易吸附,且吸附作用稳固;同样,碱性物质对酸性染料较易于吸附。
如酸性物质细胞核对于碱性染料就有化学亲和力,易于吸附。
但是,要使酸性物质染上酸性材料,必须把它们的物理形式加以改变(如改变pH值),才利于吸附作用的发生。
相反,碱性物质(如细胞质)通常仅能染上酸性染料,若把它们变为适宜的物理形式,也同样能与碱性染料发生吸附作用。
细菌的等电点较低,pH值大约在2—5之间,故在中性、碱性或弱酸性溶液中,菌体蛋白质电离后带阴电荷;而碱性染料电离时染料离子带阳电。
因此,带阴电的细菌常和带阳电的碱性染料进行结合。
所以,在细菌学上常用碱性染料进行染色。
影响染色的其它因素,还有菌体细胞的构造和其外膜的通透性,如细胞膜的通透性、膜孔的大小和细胞结构完整与否,在染色上都起一定作用。
此外,培养基的组成、菌令、染色液中的电介质含量和pH、温度、药物的作用等,也都能影响细菌的染色。
二、染料的种类和选择
染料分为天然染料和人工染料两种。
天然染料有胭脂虫红、地衣素、石蕊和苏木素等,它们多从植物体中提取得到,其成分复杂,有些至今还未搞清楚。
目前主要采用人工染料,也称煤焦油染料,多从煤焦油中提取获得,是苯的衍生物。
多数染料为带色的有机酸或碱类,难溶于水,而易溶于有机溶剂中。
为使它们易溶于水,通常制成盐类。
染料可按其电离后染料离子所带电荷的性质,分为酸性染料、碱性染料、中性(复合)染料和单纯染料四大类。
1、酸性染料
这类染料电离后染料离子带负电,如伊红、刚果红、藻红、苯胺黑、苦味酸和酸性复红等,可与碱性物质结合成盐。
当培养基因糖类分解产酸使pH值下降时,细菌所带的正电荷增加,这时选择酸性染料,易被染色。
2、碱性染料
这类染料电离后染料离子带正电,可与酸性物质结合成盐。
微生物实验室一般常用的碱性染料有美兰、甲基紫、结晶紫、碱性复红、中性红、孔雀绿和蕃红等,在一般的情况下,细菌易被碱性染料染色。
3、中性(复合)染料
酸性染料与碱性染料的结合物叫做中性(复合)染料,如瑞脱氏(Wright)染料和基姆萨氏(Gimsa)染料等,后者常用于细胞核的染色。
4、单纯染料
这类染料的化学亲和力低,不能和被染的物质生成盐,其染色能力视其是否溶于被染物而定,因为它们大多数都属于偶氮化合物,不溶于水,但溶于脂肪溶剂中,如紫丹类(Sudanb)的染料。
三、制片和染色的基本程序
微生物的染色方法很多,各种方法应用的染料也不尽相同,但是一般染色都要通过制片及一套染色操作程序。
1、制片
在干净的载玻片上滴上一滴蒸馏水,用接种环进行无菌操作,挑取培养物少许,置载玻片的水滴中,与水混合做成悬液并涂成直径约1厘米的薄层,为避免因菌数过多聚成集团,不利观察个体形态,可在载玻片之一侧再加一滴水,从已涂布的菌液中再取一环于此水滴中进行稀释,涂布成薄层,若材料为液体培养物或固体培养物中洗下制备的菌液,则直接涂布于载玻片上即可。
2、自然干燥
涂片最好在室温下使其自然干燥,有时为了使之干得更快些,可将标本面向上,手持载玻片一端的两侧,小心地在酒精灯上高处微微加热,使水分蒸发,但切勿紧靠火焰或加热时间过长,以防标本烤枯而变形。
3、固定
标本干燥后即进行固定,固定的目的有三个:
1)杀死微生物,固定细胞结构。
2)保证菌体能更牢的粘附在载玻片上,防止标本被水冲洗掉。
3)改变染料对细胞的通透性,因为死的原生质比活的原生质易于染色。
固定常常利用高温,手执载玻片的一端(涂有标本的远端),标本向上,在酒精灯火焰外层尽快的来回通过3—4次,共约2—3秒钟,并不时以载玻片背面加热触及皮肤,不觉过烫为宜(不超过60℃),放置待冷后,进行染色。
以上这种固定法在微生物实验室中虽然应用较多普遍,但是应当指出,在研究微生物细胞结构时不适用,应采用化学固定法。
化学固定法最常用的固定剂有:
酒精(95%),酒精和醚各半的混合物,丙酮,1—2%的饿酸等。
饿酸能很快固定细胞但不改变其结构,故较常用。
应用饿酸固定细胞的技术如下:
在培养皿中放一玻璃,在玻璃上放置玻璃毛细管,在毛细管中注入少量的1—2%饿酸溶液,同时在玻璃上再放置湿标本涂片的载玻片,然后把培养皿盖上,经过1—2分钟后把标本从培养皿中取出,并使之干燥。
4、染色
标本固定后,滴加染色液。
染色的时间各不相同,视标本与染料的性质而定,有时染色时还要加热。
染料作用标本的时间平均约1—3分钟,而所有的染色时间内,整个涂片(或有标本的部分)应该浸在染料之中。
若作复合染色,在媒染处理时,媒染剂与染料形成不溶性化合物,可增加染料和细菌的亲和力。
一般固定后媒染,但也可以结合固定或染色同时进行。
5、脱色
用醇类或酸类处理染色的细胞,使之脱色。
可检查染料与细胞结合的稳定程度,鉴别不同种类的细菌。
常用的脱色剂是95%酒精和3%盐酸溶液。
6、复染
脱色后再用一种染色剂进行染色,与不被脱色部位形成鲜明的对照,便于观察。
革氏染色在酒精脱色后用番红,石碳酸复红最后进行染色,就是复染。
7、水洗
染色到一定的时候,用细小的水流从标本的背面把多余的染料冲洗掉,被菌体吸附的染料则保留。
8、干燥
着色标本洗净后,将标本晾干,或用吸水纸把多余的水吸去,然后晾干或微热烘干,用吸水纸时,切勿使载玻片翻转,以免将菌体擦掉。
9、镜检
干燥后的标本可用显微镜观察。
综上所述,染色的基本程序如下:
制片→固定→媒染→染色→脱色→复染→水洗→干燥→镜检。
四、染色方法
微生物染色方法一般分为单染色法和复染色法两种。
前者用一种染料使微生物染色,但不能鉴别微生物。
复染色法是用两种或两种以上染料,有协助鉴别微生物的作用。
故亦称鉴别染色法。
常用的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法,此外还有鉴别细胞各部分结构的(如芽胞、鞭毛、细胞核等)特殊染色法。
食品微生物检验中常用的是单染色法和革兰氏染色法。
1、单染色法
用一种染色剂对涂片进行染色,简便易行,适于进行微生物的形态观察。
在一般情况下,细菌菌体多带负电荷,易于和带正电荷的碱性染料结合
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