ISO标准参考译文单核增生李斯特氏菌的检测和计数方法.docx
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ISO标准参考译文单核增生李斯特氏菌的检测和计数方法
国际标准ISO11290-1
第一版1996-12-15
食品和动物饲料微生物学---单核增生李斯特氏菌的检测和计数方法
第一部分
检测方法
内容页次
1范围1
2参考标准1
3定义1
4原理2
5培养基和试剂2
6设备和玻璃仪器3
7取样3
8取样前处理3
9步骤3
10结果表述7
11检验报告7
附录
A检验步骤图8
B培养基和试剂的组成和配制9
C亨氏证明试验16
食品和动物饲料微生物—单核增生李斯特氏菌检测和计数的水平方法
第一部分
检测方法
警告:
为了保障实验室人员的安全,强烈推荐执行单核增生李斯特氏菌检验应在具备相应设备条件的实验室进行,在有经验的微生物专家控制下,保温后的一切丢弃物应小心处理。
特别是,强烈推荐孕妇不能操作单核增生李斯特氏菌的培养。
1范围
本ISO11290详细说明了单核增生李斯特氏菌检测和计数的水平方法。
限于简介中讨论的条件,本ISO11290适用于给人消费和作为动物饲料的产品。
2参考标准
以下标准包含的条件;通过参照这些内容,组成了这部分ISO11290的条件。
出版时,引用的这些版本是有效的。
所有标准都需要修订,而各机构对本部分基于ISO11290的批准应鼓励调查和应用以下引用标准的最近版本。
IEC和ISO成员保留目前有效的国际标准的注册。
ISO6887:
1983,微生物学---微生物检验中稀释液制备的一般导则
ISO7281:
1996,食品及动物饲料微生物学---微生物检验通则
3有关定义
本部分ISO11290适用以下定义:
3.1单核增生李斯特氏菌依据本部分ISO11290实施检验,在固体选择性培养基上形成典型菌落并呈现固有形态、生理生化特征的微生物。
3.2单核增生李斯特氏菌的检验依据本部分ISO11290实施检验,在给定产品的质量和体积的条件下,检验这些微生物的存在或不存在。
4.原理
在本部分ISO11290范围内,单核增生李斯特氏菌检验需要四个连续的阶段(见附录A检验流程图)
注意1:
李斯特氏菌可能存在量少并与大量的其它种类细菌混杂,因此需要选择性富集。
同时也必须检测受破坏的李斯特氏菌,初级选择性富集培养基,含有降低的抑制剂浓度,可以至少部分达到此目的。
4.1应用含降低浓度选择性试剂的选择性富集培养液(半Fraser培养液)进行初级富集
对选择性初级富集培养液(包含1体积氯化锂和半体积吖啶黄以及萘啶酸—半Fraser培养液,也用作检验过程的稀释液)恒温培养,30℃24h;
4.2应用含全浓度选择性试剂的选择性富集培养液(Fraser培养液)进行次级富集
从4.1得到的培养物用高选择性次级富集培养液培养,35℃或37℃48h;
4.3从从4.1及4.2得到的培养物接种到两种选择性平板上
a)Oxford琼脂
b)PALCAM琼脂
保温于30℃、35℃或37℃24h后检查,如有必要,可保温48h后检查可疑的单核增生李斯特氏菌特征性菌落的存在。
4.4确认
再次培养可疑的单核增生李斯特氏菌特征性菌落,如4.3所述接种培养并用适当的形态、生理生化方法检测确认。
5.培养基和试剂
5.1常规原则
对于目前实验室操作,见ISO7218
注意2:
因为培养基和试剂的数量较多,其经过了更可取的考虑。
出于文章简洁的目的,在附录B中给出其组分和制备。
5.2初级选择性富集培养基含降低浓度选择性试剂的Fraser培养液(半Fraser培养液)
见条款B.1
5.3含全浓度选择性试剂的选择性次级富集培养液(Fraser培养液)
见条款B.2
5.4选择性固体接种培养基
5.4.1第一个培养基:
Oxford琼脂
见条款B.3
5.4.2第二个培养基:
PALCAM琼脂
见条款B.4
5.5固体培养基:
胰蛋白胨大豆酵母提取物琼脂(TSYEA)
见条款B.5
5.6液体培养基:
胰蛋白胨大豆酵母提取物增菌液(TSYEB)
见条款B.6
5.7绵羊血琼脂
见条款B.7
5.8糖发酵增菌液(鼠李糖和木糖)
见条款B.8
5.9动力试验琼脂(可选做)
见条款B.9
5.10CAMP(Christle,Atkins,Munch-Petersen)协同凝集试验及试验菌株
见条款B.10
5.11过氧化氢溶液
见条款B.11
5.12磷酸盐缓冲液(PBS)
见条款B.12
6.设备和玻璃仪器
常用微生物试验设备(见ISO7218)以及,尤其是下列:
6.1干热灭菌设备(烤箱)或湿热灭菌设备(灭菌锅)
见ISO7218
6.2干燥箱或培养箱,能够维持恒温于25℃±1℃以及50℃±1℃;
6.3数个培养箱,能够使所培养的培养基、平板以及试管恒温于下列范围:
a)25℃±1℃
b)30℃±1℃
c)35℃±1℃或37℃±1℃
6.4水浴锅,能维持恒温于47℃±2℃
6.5接种环铂/铱或镍/铬制成,直径大约3mm,以及同样材料制成的金属丝,或曲棍球杆形状的玻璃L-棒或单用接种环。
6.6pH计,能读数接近0.01pH单位(25℃),保证测量准确至±0.1pH单位。
6.7试管或烧瓶,适宜容量,用以对培养基进行灭菌和储存和温育液体培养基。
6.8量筒,容量50ml至1000ml,用以制备稀释液和培养基。
6.9全打出刻度吸管,标注容量10ml和1ml,刻度分别是0.5ml和0.1ml分度。
6.10培养皿直径90至100mm。
6.11适宜于微需氧培养的罐(选用)
6.12混合气体(选用)特用于微需氧培养。
5%-12%CO2,5%-15%O2,75%N2
6.13Henry证明试验设备(选用0
见附录C
6.14显微镜,最好是相差显微镜,载玻片和盖玻片。
7.取样
重要的是实验室收到的样品必须真正具有代表性,并且样品在运输和储存过程中未受损坏和改变。
取样方法在本部分ISO11290中不会详细介绍,如果没有针对产品的特定取样标准,推荐有关各方就此应达成协议。
8.检样制备
制备检样应根据相关产品适当的特定取样国际标准,如果没有特定国际标准,推荐有关各方就此应达成协议。
9.检验步骤
9.1检样份和初始悬浮液
见ISO6887以及所有产品相关的特定国际标准1。
制备初始悬浮液,用5.2中详细说明的选择性初级富集培养基作为稀释液。
通常情况下,制备初始悬浮液是将xg/ml所取检样加入到9xg选择性初级富集培养基(5.2)中,使二者比例1/10(质量:
体积或体积:
体积)。
9.2初级富集
错误!
链接无效。
中制备的初始悬浮液恒温培养[依据6.3b)]30℃,24±2h。
注意3:
培养过程中会产生黑着色。
9.3次级富集
9.3.1初级富集培养后,取0.1ml上述培养物(无论何色)置入含10ml次级富集培养基(Fraser培养液)(5.3)的试管。
9.3.29.3.1接种物35℃或37℃恒温培养48h±2h。
注意4:
接种物的培养温度应与各方协议规定一致并记录于检验报告中。
9.4转移接种和确认
9.4.1从(9.2)初级富集培养物中用接种环或L-棒(6.5)取少量接种到第一个选择性培养基(Oxford琼脂)表面,使得到充分分离的菌落。
同样方法接种第二个选择性培养基(PALCAM琼脂)。
注意5:
转移接种实施过程中应不管培养物的颜色如何。
9.4.2从(9.3.2)次级富集培养物中,重复(9.4.1)步骤转移接种到两种选择性平板上。
9.4.3翻转上两步得到的平板,置于(6.3)分别30℃,35℃或37℃恒温箱培养。
PALCAM琼脂平板保温于含混合气体(6.12)的微需氧罐(6.11)或者需氧培养。
注意6:
Oxford琼脂平板培养于30℃适合于仅受额外菌群轻度污染的食品,对于受额外菌群重度污染的食品,最好培养于35℃或37℃,因为李斯特氏菌趋于和额外菌群一同生长。
在所有事例中,培养温度应与各方协议规定一致并记录于检验报告中。
9.4.4经24h培养以及另外18h-24h恒温培养(如果培养24h后生长轻微或未见菌落)后,检查培养的平板有无可疑李斯特菌菌落。
9.4.4.1牛津琼脂:
生长在牛津琼脂上24h的典型李斯特氏菌呈小(1mm)、灰色的菌落外围是黑色的晕轮;48h后菌落变暗,可能见到绿色的辉光,直径约2mm,有黑色的晕轮并且中间凹陷。
9.4.4.2PALCAM琼脂:
对于微需氧培养的平板,培养后将平板暴露在空气中1h,使得培养基重新恢复其品红至紫色。
经过24h培养后,李斯特氏菌呈小或细小的灰绿色或橄榄绿色菌落,直径1.5至2.0mm,有时中心黑色,但常常带有黑色的晕圈。
48h培养后,呈现直径1.5至2.0mm的绿色菌落,中心下陷并围有黑色的晕圈。
9.5李斯特氏菌的确认
9.5.1供确认的菌落的选择
9.5.1.1从每种选择性培养基的每一个平板(见9.4.4.1和9.4.4.2)中选择五个疑是李斯特氏菌的菌落以供确认。
如果一只平板中少于五个疑是菌落,确认所有疑是菌落。
9.5.1.2将选择的菌落划线接种到预干的TSYEA琼脂平板上(5.5),以形成良好的单菌落。
将平板恒温培养(6.3c)于35℃或37℃18h-24h,直至长出良好的菌落。
注意7:
接种物的培养温度应与各方协议规定一致并记录于检验报告中。
典型菌落直径1-2mm,凸起,无色透明边缘完整。
如没有得到良好的单菌落,挑取典型李斯特氏菌菌落接种到另一只TSYEA平板上。
TSYEA得到的纯化菌落执行下列试验:
注意8:
如有必要,Henry照明试验(见附录C)应该执行。
重要的是琼脂培养基要薄(15ml/平板)。
9.5.2过氧化氢酶试验
从9.5.1.2平板中取单个菌落,悬浮于玻片上一滴过氧化氢溶液中(5.11)立即形成气泡为阳性反应。
9.5.3革兰氏染色
从9.5.1.2平板中取单个菌落进行革兰氏染色,李斯特氏菌为革兰氏阳性,狭长短棒状。
9.5.4运动力试验(如需要)
从9.5.1.2平板中取单个菌落悬浮于含TSYEB的试管中(5.6)。
置培养箱(6.3a)于25℃培养8-24h直至观察到培养基呈阴灰色的。
用接种环取一滴上述培养基(6.5)于玻璃显微载玻片上,盖上盖玻片并镜检(6.14)。
李斯特氏菌呈现狭长,短棒状翻滚的运动性。
培养温度高于25℃将不能展现这种运动性,常常与已知培养物比较,球菌、巨大棒状或者棒状并快速游动的不是李斯特氏菌。
作为运动性的可选替代方法,可用接种针(,取从TSYEA培养物(9.5.1.2)上得到的典型菌落,穿刺接种到动力琼脂(5.9),25℃培养48h(6.3a)。
检查沿穿刺线的菌落生长状况。
李斯特氏菌是有动力、呈现典型的伞样生长特征,如生长不充分,最多再恒温培养5天并观察穿刺线情况。
9.6单核增生李斯特氏菌的确认
9.6.1溶血性试验
如果形态和生理特征以及过氧化氢酶(触媒)反应都表明是李斯特氏菌,接种到绵羊血琼脂平板(5.7)以决定溶血性。
使用前,将血琼脂表面干好,取9.5.1.2中每平板的单个菌落并用金属丝依次穿刺接种(6.5)。
同时穿刺接种标准阳性(单核增生李斯特氏菌)和阴性对照培养物(英诺克李斯特氏菌)。
接种物35℃或37℃恒温培养24h±2h后,察看试验和对照菌株。
单核增生李斯特氏菌呈现狭窄、清晰、明亮的溶血圈(β-溶血2),(见图1),英诺克李斯特氏菌无清晰的区域环绕着穿刺点。
西尔李斯特氏菌出现弱的溶血圈;绵羊李斯特氏菌通常呈宽的、轮廓清晰的β-溶血区域。
在明亮的光线下检查平板并比较试验物与对照物。
注意9:
溶血性试验也可以用红血球来做。
将所取菌落分散于150μlTSYEB(5.6),35℃或37℃恒温培养2h,加入150μl用2‰PBS稀释的绵羊红血球(5.12)。
35℃或37℃恒温培养15-60min,然后冰箱3℃±2℃放约2h,再检查溶血现象的出现与否。
如果试验结果不确定,可置3℃±2℃冰箱长至24h,再观察结果。
9.6.2糖发酵试验
用接种环取(65)TSYEB(9.5.4)培养物接种至糖发酵液中(5.8),35℃或37℃恒温培养至5天,阳性反应(产酸)呈现黄色并大多数在24-48h内产生。
9.6.3协同溶血试验(CAMP)
在绵羊血平板(5.7或10.3)上相对平行接种金黄色葡萄球菌和马红球菌培养物(R.equi)(B10.4)(见图1),接种线必须窄、均匀,可通过用接种环和金属线与琼脂平面呈直角的方向(垂直)接种而得。
在它们两个培养物中间靠近1-2mm处垂直接种9.5.1.2取的可疑李斯特氏菌,但不能与二者接触。
几个试验菌株应该条列于同一平板内。
如果该分析试验由一个多年从事此项工作的有经验的微生物专家来检验李斯特氏菌,此检查步骤不是必须的。
这种现象在去除生长在接种线周围琼脂表面的所有菌落将会更清晰。
图1:
CAMP试验的接种方法和说明
注意:
1.如表格中所示接种薄的血琼脂平板(5.7或B.10.3)。
垂直线代表条状排列的金黄色葡萄球菌以及马红球菌,水平线代表条状排列的待检培养物,阴影部分说明较明显的溶血作用。
2.加点的部分说明是影响金黄色葡萄球菌培养物的区域。
同样,条列接种单核增生李斯特氏菌、西尔李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌培养物,如果用血琼脂(5.7),平板于35℃或37℃恒温培养18-24h,如果用双层平板(B.10.3),平板于35℃或37℃恒温培养12-18h。
增强的β-溶血作用出现于试验菌株与金黄色葡萄球菌以及马红球菌培养物,可认为是阳性反应。
马红球菌接种点的阳性反应为宽的(5-10mm)“箭头状”溶血作用。
在试验菌株的扩散区和马红球菌培养物之间的阴性反应则是小区域约1mm的弱溶血作用。
靠近金黄色葡萄球菌接种点的阳性反应呈现增强的小区域的溶血作用,离试验菌株2mm,弱溶血区域内取决于金黄色葡萄球菌的生长情况,大区域的溶血作用不会出现在在金黄色葡萄球菌和单核增生李斯特杆菌区间内。
9.7形态和生理生化反应的特征的说明
所有的李斯特氏菌为小的,革兰氏阳性、棒状、有动力。
过氧化氢酶(触媒)阳性,单核李斯特氏菌与其它李斯特氏菌的区别见表1。
9.8定性确认
认为是单核李斯特氏菌的菌株(9.7)应该送至认可的李氏杆菌参考实验室进行血清学,或在有条件的情况下,进行噬菌体定型。
派送时应该带上菌株的所有可能的有关信息。
9.9对照培养
为了检查富集培养基和确认培养基是否有支持李斯特氏菌的选择性增菌功能,将最近分离的李斯特氏菌菌株和阴性对照菌(例如,杆菌,葡萄球菌)稀释并接入装有初级富集培养基的对照烧瓶中(见9.2),每个烧瓶中加10-100个李斯特氏菌或阴性对照菌细胞。
进一步检查对照烧瓶中培养基以表明阳性对照培养物特征能够重现。
表1李斯特氏菌鉴定的反应
种类
溶血性
产酸
CAMP试验
鼠李糖
木糖
金黄色葡萄球菌
马红球菌
单核增生李斯特氏菌
英诺克李斯特氏菌
绵羊李斯特氏菌
西尔李斯特氏菌
威尔斯李斯特氏菌
格氏李斯特氏菌
墨氏李斯特氏菌
+
-
+
(-)
-
-
-
+
V
-
-
V
-
V
-
-
+
+
+
-
-
+
-
-
(+)
-
-
-
-
-
+
-
-
-
-
V:
反应不定(+):
弱阳性反应+:
>90%阳性反应-:
无反应
注意:
在本部分ISO11290中,存在少数单核增生李斯特氏菌不出现β-溶血现象,或者CAMP试验无阳性反应。
10结果的表述
根据结果的表述要求,报告检样中单核李斯特氏菌检出或未检出。
注明样品的量,以质量g或以体积ml表示。
注意10:
如果分离到其它种类李斯特氏菌,应该在报告中注明,并遵循各方约定。
11结果的报告
报告中应注明所用的检验方法,培养的温度和获得的结果。
还应涉及本ISO11290中未注明的或认为是可选择的操作细节,以及可能会影响结果的任何事件。
检验报告应包括完成样品检验确认的所有必须信息。
附件A
(标准化)
试验步骤表
检样(g/ml)
初级浓缩培养液(5.2)
恒温培养30℃(24±2h)
10ml次级富集(5.3)培养液中牛津琼脂(5.4.1)1)
取0.1ml(次级培养)置于鉴定(9.5-9.8)
PALCAM琼脂(5.4.2)2)
恒温35或37℃3)培养48±2h
牛津琼脂
平皿培养于
PALCAM琼脂
鉴定(9.5-9.8)
1)牛津琼脂基在30℃,35℃或37℃是需氧培养24~48小时。
2)PALCAM琼脂基在30℃,35℃或37℃培养24~28小时,如有必要采用微需氧。
3)温度必须满足有关各方规定的要求。
附件B
(标准化)
培养基和试剂的组成与制备
B.1选择性初级营养液:
佛莱塞液体培养基
B.1.1基本成分
B.1.1.1组成
肉蛋白胨(动物组织消化低级肽)5.0g
胰蛋白胨(酪蛋白消化低级肽)5.0g
牛肉浸膏5.0g
酵母浸膏5.0g
氯化钠20.g
磷酸氢二钠12.0g
KH2PO41.35g
七叶苷1.0g
水1000ml
B.1.1.2制备
将以上组份或脱水成分溶解于水中,必要时可加热。
调节PH值,使其在杀菌后保持在25℃时7.2±0.2。
将上述成分分装到一定容积的烧瓶(6.7)中,以获取试验所需的量(见9.1)。
在121℃高压灭菌15min(6.1)。
注:
Licl溶液(B.1.2)和萘啶酸(B.1.3)溶液应于消毒处理前加入到上述培养基中去(B.1.1)。
B.1.2氯化锂溶液
B.1.2.1组成
氯化锂3g
水10ml
B.1.2.2制备
将氯化锂加入水中,过滤除菌。
注意:
溶解氯化锂时一定要做好预防措施,因为该反应剧烈且对粘膜有刺激作用。
B.1.3萘啶酸钠溶液
B.1.3.1组成
萘啶酸钠0.1g
0.05mol/LNaOH溶液10mL
B.1.3.2制备
将萘啶酸钠溶解NaOH溶液中,过滤除菌。
B.1.4吖碇黄的盐酸盐溶液
B.1.4.1组成
吖啶黄素的盐酸盐0.25g
水100mL
B.1.4.2制备
将吖啶黄素的盐酸盐溶于水中,过滤除菌。
B.1.5柠檬酸铁(Ⅲ)铵
B.1.5.1组成
柠檬酸铁(Ⅲ)铵5.0g
水100mL
B.1.5.2制备
将柠檬酸铁(Ⅲ)铵溶于水中过滤
B.1.6溶液制备完成
B.1.6.1组成
基本成分(B.1.1)100mL
氯化锂溶液(B.1.2)1.0mL
萘啶酸钠溶液(B.1.3)0.1mL
吖啶黄盐酸盐(B.1.4)0.5mL
柠檬酸铁(3)铵溶液(B.1.5)1.0mL
B.1.6.2制备
在即将用之前,将上述四种溶液分别加入到4份100mL的基本成分中去
B.2选择性次级溶液:
佛莱塞养基
B.2.1基本成分
B.2.1.1组成
肉蛋白胨5.0g
胰蛋白胨5.0g
猪浸液5.0g
酵母浸膏5.0g
氯化钠20g
磷酸氢二钠12.0g
KH2PO41.35g
七叶苷1.0g
氯化锂3.0g
萘啶酸钠0.02g
水1000mL
B.2.1.2制备
将以上组份或脱水成分溶于水中,可加热,调节PH值,使其杀菌后25℃时PH=7.2±0.2;将上述溶液分装试验所需量到试管中,121℃高温消毒15min。
B.2.2吖啶黄盐酸盐溶液
见B.1.4
B.2.3柠檬酸铁(Ⅲ)铵溶液
见B.1.5
B.2.4溶液制备完成
即将使用之前,在各个试管(10mL)分别加0.1mLB.2.2溶液和B.2.3溶液,缓缓混合均匀。
B.3初次选择性平皿培养基:
牛津琼脂
B.3.1琼脂基本成分
B.3.1.1组成
钶琼脂1)39g
七叶苷1g
柠檬酸铁(Ⅲ)铵0.5g
氯化锂15g
水1000Ml
1)蛋白胨23.0g
淀粉1.0g
氯化钠5.0g
琼脂(根据琼脂强度)9~18g
B.3.2.1制备
煮沸,使上述组成物质溶解于水中,调节PH值使其灭菌处理后25℃时PH=7.0±0.2,121℃高温消毒15min。
B.3.21000mL补充溶液
B.3.2.1组成
环已酰亚胺400mg
黏菌素20mg
吖啶黄素盐酸盐5.0mg
头孢替坦二钠2.0mg
磷霉素10mg
乙醇5.0mg
水5.0mg
B.3.2.2制备
将上述组成物质溶解于乙醇中,过滤除菌。
B.3.3制备完成
将上述成分降温至47℃,然后在无菌条件上加入上述补充溶液(需预温),将上述培养基分装15mL到无菌的培养皿中且凝固。
避光保存
B.4次级选择性增殖培养基:
PALCAM琼脂4)
B.4.1琼脂基础
B.4.1.1组成
蛋白胨23.0g
淀粉1.0g
氯化钠5.0g
酵母浸膏3.0g
琼脂(根据凝固程度)9-18g
D-葡萄糖0.5g
D-甘露糖10.0g
七叶苷0.8g
柠檬酸铁(Ⅲ)铵0.5g
苯酚红0.08g
氯化锂15.0g
水960ml
B.4.1.2制备
将上述组分加入水中,煮沸使其溶解。
调节PH值使其灭菌处理后25℃时PH=7.0±0.2,121℃高温消毒15min。
B.4.2硫酸多粘菌素B溶液
B.4.2.1成分
硫酸多粘菌素B(100,000IU)0.1g
水100ml
B.4.2.2制备
将硫酸多粘菌素B溶解于水中,过滤除菌。
B.4.3吖啶黄素盐酸盐溶液
B.4.3.1成分
吖啶黄素盐酸盐0.05g
水100ml
B.4.3.2制备
将吖啶黄素盐酸盐溶解于水中,过滤除菌。
B.4.4五水合钠溶液
B.4.4.1组成
五水合钠0.116g
水100ml
B.4.4.1制备
将五水合钠溶解于水中,过滤除菌。
B.4.5溶液制备完成
B.4.5.1组成
基础(B.4.1)960ml
硫酸多粘菌素B溶液(B.4.2)10ml
吖啶黄素盐酸盐溶液(B.4.3)10ml
五水合钠溶液(B.4.4)20ml
将基础溶解降温至47℃,然后分别加入上述B.4.2至B.4.4溶液,每步添加后需缓缓混匀。
B.4.6制备琼脂平板
每只平板内加入上述新制备的完全培养基(B.4.5)15ml,使其凝固,避光保存。
B.5固体培养基TSYEA
B.5.1组成
胰酪胨大豆汤1)30g
酵母浸膏6g
琼脂2)9-18g
水1000ml
1)胰酪胨17.0g
大豆胨3.0g
氯化钠5.0g
磷酸氢二钾2.5g
葡萄糖2.5g
2)根据琼脂的凝固性能
B.5.2制备
将各组分和脱水基质加入水中加热溶解,调节PH值使其灭菌处理后25℃时PH=7.3±0.2,分装试管至适量,121℃高温消毒15min,制成斜面。
将适量培养基注入灭菌平皿,凝固备用。
B.6液体培养基:
TSYEB
B.6.1成分
胰酪胨大豆肉汤1)30g
酵母浸膏6g
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