细菌和噬菌体的遗传重组szxy1324.docx
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细菌和噬菌体的遗传重组szxy1324
第六章细菌和噬菌体遗传分析
真核生物中的遗传重组,主要是通过染色体上的基因自由组合或交换实现的,基因的自由组合和交换是在两个交配亲体的整套染色体基因组间进行的。
但原核生物(如细菌)的遗传重组就不象真核生物那样的完善和有规律性,因此需要学习原核生物的遗传重组。
第一节细菌的遗传分析
常用肺炎双球菌、沙门氏菌、枯草杆菌、大肠杆菌、尤其二后者。
一、细菌的突变型
(一)营养缺陷型
营养缺陷型指由于基因突变不能合成某种营养物质,在营养代谢方面表现出某种缺陷,所以统称为营养缺陷型(anxotroph)。
而把正常的野生型叫做原养型(prototroph),原养型大肠杆菌对培养基中营养成分的要求是很简单的,只要有葡萄糖和一些无机盐就能生活了。
这种能保持野生型生活的最低限度的培养基叫做基本培养基(minimalmedium)。
而营养缺陷型由于基因突变失去了自己制造某种物质的能力,所以在营养上产生了特殊的要求,在基本培养基不能生长,只有在基本培养基中补加它们所不能合成的某些物质才能生长、繁殖。
这种补加一些营养物质的基本培养基叫做补充培养基(additivemedium)。
把营养缺陷型细菌接种在一系列分别附加有各种氨基酸、维生素、嘌呤或嘧啶的基本培养基上,就可以判断出每种营养缺陷型生长所需要的物质,从而知哪一基因发生了突变。
为简明起见,这些突变型的基因型可用它不能合成的物质名称来表示,取前三个字母并在右上角加“-”或“+”。
“-”代表不能合成该物质的缺陷型,“+”表示能合成该物质的野生型。
thr-,pro-,ade-,trp-分别代表苏氨酸、脯氨酸、腺嘌呤和色氨酸的缺陷型。
Lac-和gal-是指不能利用培养基中乳糖和半乳糖。
鉴定方法:
完全培养基接种基本培养基不生长
基本培养基+thr不生长
基本培养基+pro不生长
基本培养基+ade生长为腺嘌呤营养缺陷型
菌落:
单一细菌经繁殖形成肉眼可见微生物集团有一定特性。
营养缺陷型也可利用特定的培养基检测出如能发酵乳糖的正常菌落在含伊红和甲基蓝的培养基(EMB)上长成的菌落是红色的,不能发酵乳糖的细菌则长成白色菌落。
这种能把野生型和突变型明显地区分开来,便于人们进行选择的培养基叫做选择培养基。
利用EMB培养基还分离出了不能利用阿拉伯糖、甘露糖、木糖、麦芽糖作碳源的一批大肠杆菌突变型。
(二)抗药突变型
细菌的另一类突变型叫做抗药型。
野生型细菌通常会被一定剂量的某种药物杀死,所以叫做药物敏感型,本世纪初发现有一些细菌不受药物的影响而存活下来,这是由于在原来的药物敏感型中,有一些细菌已转变为抗药型。
20世纪40年代,随着各种抗菌素(青霉素、链霉素等)的广泛应用,细菌对药物发生抗性的现象越来越普遍。
以后用青霉素,特别是链霉素做选择因素,在大肠杆菌中选出了一批抗青霉素和链霉素的抗药性突变型。
它们的基因符号可用该药物名称的前三个字母并在右上角附加“r”来表示:
Penr,Strr。
与之相应的药物敏感型可写成Pens和Strs。
鉴定方法:
完全培养基+Pen无菌落
+Str无菌落
+azi有菌落azir
(三)抗噬菌突变体
此外,在大肠杆菌中还发现有抗噬菌体突变型,它的细胞壁上由于没有T1噬菌体赖以附着的接受点,所以能抗T1噬菌体而不被噬菌体侵染破裂,无噬菌斑。
它的基因型符号是Tonr。
而野生型的大肠杆菌由于细胞壁上具有T1噬菌体的接受点,使噬菌体颗粒得以附着在它的壁上,因而能被侵入细胞内的噬菌体杀死,出现噬菌斑,所以叫做T1噬菌体敏感型。
鉴定方法:
完全培养基+噬菌体+细菌→观察有无噬菌斑(噬菌体侵染细菌使细菌细胞破裂在培养基上留下空斑)有—敏感型;无—抗噬菌体型
二、细菌的遗传物质
是DNA,细菌基因组是指细菌染色体以及以外遗传物质所带的基因总和。
(一)细菌染色体:
为闭合双链环状DNA,如K12DNA比细菌细胞长1000倍,在菌体中高度螺旋,相对分子量3×109左右,约含4.7×103Kbp,约含4000-5000个基因,已知编码2000多种酶及其结构蛋白。
(二)染色体外遗传物质:
指质粒和转位因子等。
质粒是1952提出,是一种独立于染色体之外的能自主复制的细胞质遗传因子,广泛存在生物中,其含的基因对宿主细胞一般是非必需的,但在某些条件下能是宿主生长更好。
细菌中质粒研究最详细。
1、质粒的结构及其鉴定
质粒通常以共价闭合环状的超螺旋双链DNA分子形式存在细胞中,三种构型:
CCC型、开环型OC、线性L,不同构型的DNA插入溴化啶EB的量不同(可与DNA、RNA结合在紫外线下显现荧光),凝胶电泳迁移率不同,CCC型DNA速度最快,OC最慢,进行质粒检测通常有三条带,可通过单酶切使质粒均成线性电泳时显现一条带。
2、质粒的类型
(1)根据拷贝数
松驰型(高拷贝数质粒):
每个细胞内有的10-100个。
严紧型(低拷贝数质粒):
一个细菌细胞内的质粒数量有1-2个;
如F质粒;PSC101带抗四环素标记基因;ColE1,带大肠杆菌素基因(蛋白质性质抗生素)。
(2)根据宿主范围
窄宿主范围质粒:
只能在特定宿主细胞中复制,复制起点要求特异。
广宿主范围质粒:
在许多细菌中复制,复制起点不太特异。
(3)根据质粒编码的功能和赋予宿主的表型效应
致育因子:
F因子,决定细菌的育性。
相对分子量4.5×106,9×104bp,约为大肠杆菌环状染色体全长2%。
抗性因子:
R因子,有抗药性和抗金属性,使细菌具有抗性,如R100质粒(89Kb),对5种药物(四环素tet、链霉素str、磺胺su、氯霉素cm、夫西地酸fus)、1种金属(Hg),这些抗性基因成簇存在质粒上。
产细菌素质粒:
许多细菌能产生抑制或杀死近缘或同种不同菌株而自身不受影响的代谢产物,由质粒编码的杀菌不具广谱性,根据其产生的细菌命名,如大肠杆菌素由大肠杆菌Col质粒编码,因质粒本身可编码一种免疫蛋白,对大肠杆菌素有免疫作用。
毒性质粒:
致病细菌的致病性是由于质粒携带了编码毒素的基因,其产物对宿主造成伤害,如产毒素大肠杆菌可致腹泻,由于许多菌株含一种或多种编码肠毒素的质粒。
如苏云金杆菌含编码δ内毒素(伴孢晶体中)质粒,杀死鳞翅目昆虫。
Ti质粒是一种细菌质粒,它自然存在于土壤农杆菌(革兰氏阴菌)细胞中→可诱导植物产生瘤细胞→冠瘿瘤。
Ti质粒一部分DNA叫转移DNA(T-DNA),当农杆菌感染植物时,T-DNA便转移到植物的染色体上,致细胞无限制增生,诱导冠瘿瘤,并能合成冠瘿碱(opine),作为农杆菌的碳源和氮源。
代谢质粒:
质粒上带有利于微生物生长的基因,如可将基质中复杂有机物降解为简单可用的碳源或能源。
隐秘质粒:
不显示任何表型效应,存在的意义不清,在应用上可通过改造如加上抗性基因作为基因工程载体。
三、细菌有性杂交——接合生殖
1946年Ledeberg和Tatum用大肠杆菌K,证明细菌有性杂交存在。
(一)大肠杆菌杂交试验
Abio-(生物素)met-(甲硫氨酸)thr+(苏)leu+(亮)thi+(VB1)
Bbio+(生物素)met+(甲硫氨酸)thr-(苏)leu-(亮)thi-(VB1)
AB都为营养缺陷型,在基本培养基上不能生长,
A、B混合培养,基本培养基上有10-7-10-8菌落,菌落产生原因:
1、个别细菌由营养缺陷型转变为原养型
a、基因突变
Abio-met-bio+met+
或Bthr-leu-thi-thr+leu+thi+
但单独培养都未突变,间接说明不是。
b、AB二细菌杂交得
bio-met-thr+)leu+thi+bio+met+thr+leu+thi+
bio+met+thr-leu-thi-
2、营养物质互补
A能合成B不能合成物质,而B能合成A不能合成物质,混合后二种物质被同一细菌利用,可生长。
(二)U实验
1950年Davis(戴维斯),做了U实验,在U底部中间用滤片隔开,交替吸压
0.1um营养分子和DNA分子可通过,细胞不能通过。
证明菌落是由于AB二细胞接触杂交基因重组。
(三)电境观察--接合管
性纤毛是由F+细胞表面伸出的长附属物,F+细胞与F-混合接触,F+细胞性纤毛F-表面受体结合,形成细胞质桥——接合管。
证实有性杂交存在。
问题:
AB二细胞遗传物质是混合,还是单向转移。
(四)遗传物质单向转移
Lederberg和Tatum认为细菌杂交似高等生物,二细胞融合基因重组,1953年Hayes(海斯)在验证杂交时偶尔发现杂交中A、B细菌作用不同,遗传物质是单向转移,A→B,不能B→A。
用链霉素处理其中一细菌(阻止细胞分裂不能形成菌落,但不影响细胞其他行为),当受体被链霉素处理时,即使得到供体的遗传物质也不能形成菌落,供体被处理时,不影响菌落的形成。
结果不同,表明A、B有性杂交作用不同,提出遗传物质单向转移。
供体:
提供遗传物质的细菌雄性A
受体:
接受遗传物质的细菌雌性B所以A→B
不久发现导致单向转移的是细胞质中一个微小可转移因子—F因子(致育因子)
四、大肠杆菌F-F+HfrF/菌株
(一)F因子
细胞质中环状DNA,决定细菌的育性。
1、存在方式
游离状态:
在细胞质中,能自我复制独立遗传
整合状态:
整合到细菌环状染色体上,与细菌染色体一起遗传。
这种既能独立遗传又能整合到细菌环状染色体上两种状态的遗传物质,叫附加体
2、结构
分三个区段,相对分子量4.5×106,94Kbp,约为大肠杆菌环状染色体全长2%,含有约60个基因,1/3与接合生殖有关。
1)复制原点:
转移起点和2个复制起点,复制起点oriV是F因子独立在细胞质中的复制起点,oriT是在染色体转移时进行滚环式复制的起点。
2)致育基因(结合转移基因区):
长33bp,含有一套在细胞间建立接合和转移的基因,决定细菌的育性,含有育性区的大肠杆菌在细胞表面有很多毛状的性纤毛(或性伞毛),性纤毛蛋白由该区一些基因编码。
3)配对区(插入序列IS):
与细菌环状染色体多个区域核苷酸序列相对应,与这些区域同源序列配对,通过简单的单交换可到细菌染色体上,有极性,整合到细菌染色体上方向不同。
3、特性
(1)决定大肠杆菌育性,含F因子供体雄性
无F因子受体雌性
(2)F因子可转移
F因子转移:
受体与供体细胞接触,性纤毛成为通道即形成接合管,诱导F因子上traYz基因表达,产生核酸内切酶,该酶在转移起点处将F因子的oriT处将F因子上双链中一条链切开,该链从5/端开始进入F-菌株,边复制边转移(因此叫滚环复制)成为完整F因子,留在F+细菌中另一条链也复制成为完整F因子,F-→F+。
(3)以自发丧失,F+→F-
(二)F-和F+菌株
1、结构特点F-菌株:
无F因子的细菌
F+菌株:
含有游离F因子的细菌
2、当F+×F-混合(杂交)特点
(1)高频率的转移F因子,F+中F因子复制进入F-,使F-转变为F+,频率高达95%。
(2)基因重组的频率低
F+菌株环状DNA复制通过接合管进入F-细菌细胞,与F-细菌的基因交换,使基因重组,但频率很低<1%,菌落很少。
(三)高频重组菌株(Hfr菌株)
1951年,卡瓦里(Cavalli)等人,1954年海斯(Hayes)先后在A菌株中分离出新的菌株。
1、Hfr×F-混合(杂交)特点
(1)可以作为供体,与B杂交,重组频率比A×B高1000倍,称高频重组菌株。
(2)转移F因子频率低
2、Hfr形成
F因子整合到细菌环状DNA上,这种整合状态F+菌株叫Hfr(高频重组)。
F因子可整合在细菌环状染色体不同部位,不同方向整合,由于整合的部位不同,方向不同,则形成了不同的Hfr。
3、高频原因
杂交过程也是先形成接合管,然后Hfr边复制边转移。
当接合管形成后,诱导F因子上traYz基因表达,产生核酸内切酶,该酶在转移起点处将F因子的oriT处将细菌DNA双链中一条链切开,供体DNA从5/端开始进入F-菌株,边复制边转移(因此叫滚环复制)进入受体细胞中,将细菌环状染色体上基因带入受体细胞中,转移的顺序:
F因子原点→配对区→大肠杆菌基因→配对区→育性基因。
Hfr×F-很容易形成接合管,Hfr基因较高频率进入F-,基因重组频率高。
但在转移过程中,结合管很易断开,这样转移到受体的部分只是靠近原点的一部分(全部转移需温和条件120分钟),形成部分二倍体,致育基因位于最后,最后进入受体细胞,转移F因子频率低。
(四)F/菌株
F因子可从Hfr脱离成为F+,通常准确脱离,偶尔不准,使F因子带有细菌的个别基因。
这种带有细菌个别基因的F因子,称F/菌株。
(五)大肠杆菌的F-、F+、Hfr、F、菌株
五、细菌基因重组作图
原核生物的遗传重组实质上是指受体中插入来自供体的遗传性不同的DNA片段,并把这种DNA片段或它的复本整合为受体基因组的一部分。
受体的遗传重组可以通过接合生殖、转化、转导和性导四种途径来实现:
(一)接合生殖基因重组作图
1、过程供体细菌的DNA通过接合管进入受体细菌,实现基因重组。
由于Hfr或F+的DNA在转移过程中,结合管很易断开,进入受体细胞的DNA仅部分,在受体细胞中染色体为部分二倍体。
2、基因重组特点:
①交换发生在完整的F-环状染色体和供体线性染色体片段之间即部分二倍体,其中受体的基因组叫内基因子,供体的基因组叫外基因子。
外基因子转移到受体以后,可以游离状态存在,随着细胞分裂代数的增加被稀释,消失;也可与内基因子发生交换实现基因的重组。
②偶数交换形成环状重组体(有效交换),奇数交换形成一个线状分子,在大肠杆菌中不能复制,导致细胞死亡(无效交换,大肠杆菌复制时,DNA复制酶只能识别环状分子,其中原点有273bp,富含AT,首先解旋成“眼”状结构,然后双向复制)。
③一次有效交换只出现一种重组子(杂交后代),无对应重组体(真核生物出现四种杂交后代)。
只有F+×F-,Hfr×F-能杂交,F+×F-产生少量重组体(L),Hfr×F-产生大量重组体(M),而F+×F+,F-×F-,Hfr×Hfr,Hfr×F+都不能杂交(重组体为0)。
3、基因重组作图
利用交换值做出连锁基因图
例如:
已知lac+和ade+紧密连锁,由中断杂交知lac+比ade+早进入受体。
作出两连锁基因连锁图。
选用杂交亲本为Hfrlac+ade+strs×F-lac-ade-strR混合后接种
由于lac+比ade+先进入受体,此时lac+已进入受体但不一定重组到细菌染色体上,两种情况:
lac+ade+和lac-ade+都是重组体,但前者在两基因间没有发生交换,是非交换型重组体,后者是交换型重组体。
检测:
lac-ade+菌落数=Ⅰ上菌落数-Ⅱ上菌落数
R=lac-ade+菌落数/ade+菌落数
或将Ⅰ影印到EMB(伊红甲基蓝)选择性培养基上
lac+ade+能发酵乳糖菌落紫红色
lac-ade+→不能发酵乳糖菌落白色
由上求出交换值为22%,由中断杂交实验得到lac+比ade+早1分钟进入受体,大量实验统计1分钟=20%。
重组值=某一性状单独出现的菌落数/重组体菌落数×100%(注意分母不是总菌落数)
例1:
两连锁基因间R=交换型重组体数/交换型重组体数+非交换型重组体数×100%
如上例,Hfrlac+ade+×F-lac-ade-接合生殖结果后代菌落统计如下:
lac+ade+35个、lac-ade+5个、lac+ade—10个,求基因间重组值。
以上3种菌落均为重组型菌落(lac-ade-不是重组型),
R(lac-ade)=lac-ade+菌落数+lac+ade—菌落数/总重组型菌落数=5+10/50=30%
两基因间距离为30CM
例2:
HfrABC×F-abc,各菌落数如下:
ABC800个、ABc(书有误)30个、AbC80个(4次交换,实际很少)、Abc40个、aBC10个、aBc40个、abc40个(受体没变,亲组型)。
求三连锁基因间距离。
各种类型产生原因:
R(a-b)=(Ab+Ab)/总的重组体数=80+40+10+40/1000=17%
R(b-c)=Bc+bC/总的重组体数=30+80+40=15%
R(a-c)=Ac+aC/总的重组体数=30+40+10=8%
(二)转化(transformation)作图
游离的细菌DNA片段被不同的细菌细胞(受体)吸收。
已经发现不少属的细菌可以
转化,如链球菌属,嗜血杆菌属,芽孢杆菌属,奈瑟氏球菌属,假单孢杆菌属以及大肠杆菌属。
在细菌中转化很可能是十分普遍的现象。
(1)转化条件
①受体是感受态细胞,能吸取DNA分子而被转化的细菌细胞叫做感受态细胞(competentrecipientcell),在某一细菌群体中,只有极少数细胞是感受态的,它们具有感受因子,可能是细胞表面的一种蛋白质或是一种转化酶,它参与了DNA的吸收。
②外源DNA性质如分子量大小,一般细胞DNA的0.3%,多为双链,纯度高、亲缘关系近易转化。
(2)转化基因重组过程:
①双链DNA分子和细胞表面感受位点可逆性的结合;
②核酸外切酶将供体DNA片段一条链降解,另一条链被吸入受体细胞;
③侵入受体细胞的供体单链DNA与受体细胞的DNA链局部变性的部位一条单连形成双链置换出受体的局部单连,形成杂合的DNA分子;
④置换出受体的局部单连被降解;
⑤这种杂合的DNA复制后,形成一个亲代类型的DNA(受体,非转化子)和一个重组类型的DNA(供体和受体,转化子)。
同源性大易形成杂交DNA分子,相距远的基因很难同时转化,但相距近的可同时转化,通过转化作图。
Nester等人用枯草杆菌的菌株trp2+(色氨酸)、his+(组氨酸)、tyr+(酪氨酸)做供体,受体是trp2--、his--、tyr-进行转化,结果如下表:
基因
转化子类型
trp2
+
-
-
-
+
+
+
his
+
+
-
+
-
-
+
tyr
+
+
+
-
-
+
-
数目
11940
3660
685
418
2600
107
1180
3个基因同时转化数最多,可见3基因在染色体上相距近,计算R
转化同接合一样只有一种重组体,偶数交换有效,计算时非转化子不计入总数。
R(trp2-his)=重组型转化子数/重组型+亲组型=(+-)+(-+)/(+-)+(-+)+(++)
=3660+418+2600+107/3660+418+2600+107+11940+1180=34%
(注意:
只考虑trp2-his,--属于非转化子不考虑),同理计算
R(his-tyr)=13%;R(trp2-tyr)=40%
连锁基因顺序:
trp2-——his——tyr
(三)转导(transduction)作图
一种细菌的DNA片段经过温和的或有缺陷的噬菌体传递给另一种细菌,实现两细菌基因重组。
例如1:
用大肠杆菌P1噬菌体转导,供体thr+、lec=、azi=转入thr_、lec-、azi-,结果如下:
选择标记(培养基中缺)
非选择标记
Lec+
50%azi+,2%thr+
thr+
0%azi=,3%lec+
thr+、lec+,
0%azi+,
从选择标记Lec+表明Lec与azi+,靠近、与thr+较远,有以上两种;以选择标记thr+,表明Lec与thr+较近,所以是
(2),以选择标记thr+、lec+,,表明从thr+开始转移。
例如2:
利用P22在沙门氏菌间进行转导,供体arg+(精氨酸)leu+(亮氨酸)his+(组氨酸),受体arg-leu-his-,先选择arg+的转导子,在多种培养基上检测到基因型结果如下:
Arg+leu-his-585
Arg+leu-his+300
Arg+leu+his-1
Arg+leu+his+114合计1000
(1)基因顺序、图距
Arg+leu+比Arg+his+少,所有Arg与leu相距远,基因顺序是Arg—his—leu
R(A-L)=(Arg+leu-)/1000=88.6%
R(A-H)=Arg+his-/1000=58.6%
R(L-H)=(leu-his+)+(leu+his-)/转导子总数=leu+his+/(leu+his+)+(leu-his+)+(leu+his-)=301/301+114=72.5%
(2)共转导率
T(A+L)=Arg+leu+/转导子总数=115/1000=11.5%
T(A+H)=Arg+his+/转导子总数=414/1000=41.4%
T(L+H)=leu+his+/转导子数=leu+his+/(leu+his+)+(leu-his+)+(leu+his-)=114/300+1+114=27.5%
(四)性导
F因子可从Hfr脱离成为F+,通常准确脱离,偶尔不准,使F因子带有细菌的个别基因。
这种带有细菌个别基因的F因子称F/因子,带有F/因子的菌株称为F/菌株。
F/菌株因带有F因子可作为供体,当与受体混合时,F/因子进入受体细菌,不但能使受体转变为F+菌株,还可将所带的基因代入,实现细菌间基因重组。
六、中断杂交试验作图
人为的中断大肠杆菌杂交而进行的基因定位叫中断杂交法。
(一)原理
Hfr和F-一混合,马上形成接合管,然后进行转移,越接近原点的基因,进入受体就越快。
用振荡器振荡使之中断,再稀释接种在一定成分的培养基上,检测受体细胞中的供体基因。
不同时间受体基因型可能不同,可按时间顺序从原点开始排出基因顺序。
1分钟内出现了供体的A基因,则说明A基因很近原点;2分钟内出现了供体的AB基因,则说明B在A之后,也近原点;3分钟内出现了供体的ABC基因,则说明C在AB之后,也近原点;则按时间来定位,标出不同基因位于原点的先后位置,单位:
时间单位。
据基因进入受体的时间来定位基因(假定转移是匀速的)。
(二)方法沃尔曼(Wollman)、雅各布(Jacob)
叠氮化钠噬菌体乳糖半乳糖链霉素
Hfrazirtonrlac+gal+strs
F-:
azistonslac-gal-strr
将Hfr与F-同时加入装有完全培养基的大试管中,一定时间取样振荡,稀释接种至添加str的基本培养基(葡萄糖和无机盐)上,生长形成的菌落基因型为F-strr(F-或具Hfr部分基因的F-),再把菌落分别转移到只添加azi、ton、以lac或gal为炭源的选择性培养基上。
进入F-的Hfr基因
8/不生长有噬菌斑不生长不生长无
9/生长有噬菌斑不生长不生长azir
11/生长无噬菌斑不生长不生长azirtonr
18/生长无噬菌斑生长不生长azirtonrlac+
24/生长无噬菌斑生长生长azirtonrlac+gal+
F因子约在120分钟后进入。
(1)Hfr的基因按一定顺序和时间间隔进入F-
(2)每个基因进入F-有一定频率,且在短时间内达到最高
(3)进入F-越早
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