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维生素C的质量标准控制研究
维生素C的质量标准(控制)研究
学院药学院
专业临床药学
班级2012级药学
姓名王冠峰
学号200910062026
指导教师甘向辉
2016年4月27日
维生素C的质量标准(控制)研究
[摘要]
维生素C,具有抗坏血病的作用,所以又被称为抗坏血酸(Ascorbicacid)。
它是人体不可或缺的一种重要营养物质,在新鲜的蔬菜和水果中含量较为丰富。
由于化学结构与糖类十分相似,所以在人体代谢活动中起到重要的作用,包括参与体内一系列生物代谢和反应,促进胶原蛋白和粘多糖的合成,增加微血管的致密性,降低其通透性及脆性,增加机体抵抗力等。
但人体摄入过多时会产生多尿、下痢、皮肤发疹等不良反应,滥用维生素C甚至会削弱人体的免疫能力。
因此,在维生素C药物生产过程中需做好质量控制研究,产品的含量测定也应严格把关。
《中国药典》(2010年版)收载有维生素C原料药及其片剂、泡腾片、颗粒剂和注射剂。
维生素C的含量测定方法有碘量法,2,6—二氯靛酚滴定法,紫外分光光度法等。
目的了解并归纳国内对维生素C原料药及其片剂、注射液的含量测定的方法。
方法以“维生素C含量测定”和“抗坏血酸含量测定”为检索词对1992~2012年中国期刊网全文数据库(CNKI)中的全部文献进行全文检索,对所得有关维生素C含量测定的方法进行归纳。
结果归纳有维生素C原料药5种,片剂4种,注射液6种的测定方法。
结论维生素C及其制剂的含量测定方法种类多样,各有特点,应根据实际检测的需求采用合适的方法。
[关键词]维生素C;片剂;注射液;含量测定;质量评价方法;标准分析;探索性研究.
前言
维生素C(又称L-抗坏血酸)是一种酸性的己糖衍生物,是烯醇式己糖酸内脂。
立体结构与糖类相似,可发生氧化与还原互变。
氧化型和还原型都有生物活性。
分子中第二、三两位碳上烯醇羟基的氢容易生成H+而释出,故抗坏血酸虽然不含自由羟基,仍具有有机酸的性质。
在水中的溶解度为0.3g/ml。
熔点190~192℃。
pH=4时氧化还原电位E0=0.166V。
其电离常数PK1=4.17,PK2=11.57。
最大吸收波长245nm(酸性)与265nm(中性)。
在碱性与酸性介质中均能迅速被氧和金属离子氧化成脱氢抗坏血酸(DHAA),脱氢抗坏血酸可进一步氧化成二酮古乐糖酸(DKG)。
【1】维生素C是维持人体生理机能需要的重要营养素,也是人体需要量最大的一种维生素,它具有抗氧化、清除自由基以及促进许多酶和激素形成,有效防止血管脆性,促进铁吸收,提高机体免疫功能等作用。
还具有防治血管硬化、肝胆疾病、过敏性疾病,促进创伤愈合等作用。
【2】由于维生素C对人类非常重要,近年来发展了一些新的测定方法,而经典方法也得到了不少改进。
本文对近二十年来国内维生素C含量测定方法进行了总结。
1维生素C原料药
1.1间接光度法
实验原理:
该方法基于在弱酸性介质中,有盐酸羟胺、碘酸存在下,抗坏血酸还原对氨基苯磺酸与N-1-萘乙二胺盐酸盐混合体系生成的有色物质,体系的最大吸收波长为540nm,工作曲线的线性范围为0.5~4.0μg/ml。
方法灵敏度高,选择性好,对药用维生素C中抗坏血酸含量进行测定,结果满意。
1.1.1试剂规格
维生素C标准液:
10μg/ml;碘酸钾溶液:
20μg/ml;硫酸:
0.125mol/L;对氨基苯磺酸溶液:
2g/L;盐酸羟胺溶液:
2.5g#L;N-1-萘乙二胺盐酸盐溶液:
0.5g/L。
1.1.2试验方法
准确吸取碘酸钾溶液1.0ml与0.125mol/L硫酸0.8ml混合后加入10μg/ml维生素C溶液2ml。
用水稀释至5ml,加入2g/L对氨基苯磺酸溶液1.1ml,2.5g/L盐酸羟胺溶液1.0ml,混合物静置25min后,加入N-1-萘乙二胺盐酸盐溶液1.2ml,用蒸馏水稀释至10ml,在540nm波长处测定其吸光度,试验过程中每加入一种溶液,均必须振荡使之混合均匀。
1.1.3吸收曲线
按试验方法,在不同的波长下测定吸光度,并做空白试验,结果表明,本体系的最大吸收波长为540nm。
1.1.4样品分析
精密称取一定质量的样品,溶解于10g/L草酸溶液中,过滤后用10g/L草酸溶液定容于1L容量瓶中,吸取10ml于100ml容量瓶中,用10g/L草酸溶液稀释至刻度,按试验方法进行测定。
【3】
1.2直接碘量法
实验原理:
抗坏血酸分子中的烯二醇基具有还原性,与I2反应定量地被氧化生成二酮基。
反应式如下:
以淀粉为指示剂,用碘的标准溶液滴定抗坏血酸,过量的碘标准溶液与淀粉发生反应使溶液呈蓝色,即达到滴定终点。
1.2.1含量测定
精密称取样品0.2g,放入250ml锥形瓶中,加入新煮沸过放冷的蒸馏水100ml,再加入2mol/L冰醋酸溶液1ml,0.5%淀粉指示液2ml,摇匀,立即用标定过的碘标准溶液滴定,直至溶液呈蓝色在30s内不褪色为止。
此方法常用作食品或药剂中抗坏血酸含量的测定。
方便实用,但准确度不高,误差较大。
【4】
1.3间接碘量法
实验原理:
先加过量的碘标准溶液与配制好的维生素C溶液反应完全,用硫代硫酸钠滴定过量的碘至蓝色刚好消失。
相比直接碘量法有如下优点:
消除了不溶物吸附作用的影响,缩短了维生素C溶液与空气的接触时间,避免了碘的挥发对实验结果造成的影响。
【4】
1.4反滴定碘量法
药典中常采用将碘溶解在KI溶液中以增大碘的溶解度。
此实验取20%的KI溶液5ml于250ml锥形瓶中,精确量取0.01mol/LCuSO4溶液1ml加入锥形瓶中使其充分反应,再加2ml淀粉指示液。
VC液溶于冰乙酸介质中,用其进行滴定至恰使蓝色消失为止。
CuI2不稳定随即分解为Cu2I2和游离的碘。
2CuSO4+4KI=CuI2+2K2SO4
2CuI2=Cu2I2+I2
空白试验:
取20%的KI溶液5ml于锥形瓶中,加蒸馏水1ml,再加10滴淀粉指示剂溶液,然后用溶于冰乙酸介质中的VC液进行滴定,边摇边滴定,直至与测定颜色一致为止。
反滴定碘量法的空白实验消除了因KI中含有碘而产生的系统误差,也消除了人眼对溶液变色的敏感程度不同而对实验造成的误差。
由于样品液能与KI中本身含有的碘作用,也消除了因KI中含有的碘产生的误差。
反滴定法比滴定法更准确,但操作较繁琐,适合测定少批量样品。
【4】
1.52,6-二氯吲哚酚滴定法
实验原理:
2,6-二氯吲哚酚即为一染料,其氧化型在酸性溶液中显红色,碱性溶液中为蓝色。
当与抗坏血酸反应后,转变为无色的酚亚胺(还原型)。
因此,抗坏血酸可在酸性溶液中用2,6-二氯吲哚酚标准液滴定,至溶液显玫瑰红色时即为终点。
1.5.1含量测定
精密称取约0.0020gVC,放入50ml锥形瓶中,加入新煮沸过的冷蒸馏水10ml,加偏磷酸-醋酸试液5ml,用二氯吲哚酚标准液滴定,至溶液显玫瑰红色在5s内不褪色为止;另取偏磷酸-醋酸试液5.5ml,加水15ml作为空白,用二氯吲哚酚标准液滴定,进行校正。
2,6-二氯吲哚酚滴定法的专属性较碘量法为高,多用于含维生素C的制剂和食品的分析。
而且此法不是维生素C的专一反应,其他还原性物质对测定有干扰。
由于维生素C的氧化速度远高于其他还原性物质,所以此法必须快速滴定才可减少干扰物质的影响。
【4】
2维生素C片
2.1薄层扫描法
《中国药典》2000年版规定维生素C片剂的含量测定用碘量法。
(2010年版中国药典所用同为碘量法)该方法操作比较繁杂,重现性较差,分析周期较长。
实验原理:
维生素C具有较强还原性,可使蓝色染料2,6-二氯靛酚钠定量地还原成无色的酚亚胺,而本身被氧化成去氧抗坏血酸。
此反应为维生素C的特征反应。
2.1.1试纸的制备
2,6--二氯靛酚钠(DCP-Na)溶于无水乙醇配成0.05%DCP-Na乙醇溶液的展开缸中浸渍3min,边浸边摇展开缸,使滤纸均匀着色,充分被染料溶液所饱和。
取出悬挂于暗处,晾干后,立即放入干燥器中避光保存,备用。
2.1.2扫描条件确定
在制备的染料试纸上定量点维生素C对照品进行扫描,维生素C在290nm处有最大吸收,420nm处无吸收,故选择λS=290nm,λR=420nm,双波长反射式锯齿扫描。
2.1.3样品的含量测定
取维生素C片10片,研细,精密称取平均片重一片的粉末,放入100ml容量瓶中,加入缓冲液至刻度,振摇,使维生素C溶解,放置、澄清,用吸液管取3ml,移至10ml容量瓶中,用缓冲液稀释至刻度。
用5μL定量毛细管点样品溶液与不同浓度的标准液于同一试纸上,然后扫描测定峰面积,由工作曲线法计算维生素C片中的维生素C含量。
【5】
2.2高效液相色谱法
2.2.1色谱条件
色谱柱phenomene-C18;流动相磷酸盐缓冲溶液(pH=5.8):
甲醇=95:
5,流速0.8ml/min;紫外检测器:
检测波长254nm;进样:
10μL。
2.2.2供试品溶液与对照品溶液的制备
维生素C供试品溶液的制备
取本品20片(规格0.1g),精密称定,研细,取本品1片(约相当于维生素C100mg),加0.1%的草酸使溶解制成每1ml含0.1mg的溶液,分析前用0.45μm滤膜过滤。
维生素C对照品溶液的制备
精密称取维生素C对照品适量,加0.1%的草酸使溶解制成0.1mg/ml的标准溶液。
2.2.3标准工作曲线的绘制
精密称取对照品50.80mg置50ml量瓶中,用0.1%草酸溶液稀释至刻度,精密量取0.5ml,2.5ml,5ml,12.5ml,25ml分别置50ml量瓶中,用0.1%草酸溶液稀释至刻度,制成维生素C标准溶液,用0.45μm滤膜过滤,用微量进样器进样10μL,依次测出峰面积,然后以维生素C标准溶液质量浓度(mg/ml)作自变量,相对应的峰面积作因变量,绘制标准工作曲线。
2.2.4样品测定
分别精密量取供试品与对照品溶液10μL,注入液相色谱仪记录色谱图,测定结果。
【6】
2.3差示旋光法
实验原理:
根据维生素C在不同的pH溶液中旋光度有显著差异,而片剂辅料的旋光度保持不变这一特性,设计用差示旋光法消除辅料的影响,直接测定该制剂的含量。
本法结果准确、操作简便、快速。
2.3.1差示旋光度与浓度的关系
精密称取105℃干燥至恒重的维生素C6.39g,置50ml量瓶中,加入新沸过的冷水至刻度。
精密量取上述溶液0.4、1.2、2.0、2.8、4.0ml各2份,分别置50ml量瓶中,1份用新沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml的混合液(以下简称醋酸液)稀释至刻度,1份用5%的碳酸氢钠溶液稀释至刻度,以前者为空白,分别测定后者的差示旋光度(△α),以浓度对差示旋光度作线性回归,结果表明,本品浓度在1-10mg/ml范围内,线性关系良好。
回归方程为:
C=0.0876+5.241△αr=0.9999
2.3.2样品测定方法
精密称取本品30片,研细,精密称出适量(约相当于维生素C1g),置100rnl量瓶中,加新沸过的冷水至刻度,用干燥滤器过滤弃去初滤液,取续滤液25ml2份,分置50ml量瓶中,1份加醋酸液至刻度,1份加5%碳酸氢钠液至刻度,以前者为空白,测定后者的差示旋光度,代入直线回归方程,计算出含量。
【7】
2.4流动注射化学发光抑制法
实验方法:
化学发光分析法测定抗坏血酸具有仪器简单、操作方便和灵敏度高等显著优点,引起人们的极大兴趣。
我们详细研究了Luminol-KIO4-H2O2化学发光反应体系,发现抗坏血酸对该化学发光体系有明显的抑制作用,结合流动注射技术建立了一种流动注射化学发光抑制测定抗坏血酸的新方法。
2.4.1化学发光抑制原理及发光动力学曲线
H2O2对KIO4氧化Luminol发光有很高的“协同催化”活性,如反应
(1)所示。
抗坏血酸为多羟基化合物,分子中的烯二醇基具有较强的还原性(E=0.136V),如反应
(2)所示,抗坏血酸可将H2O2定量还原,从而抑制了发光反应
(1)。
发光信号随抗坏血酸浓度的增大而减弱。
2.4.2标准曲线
在本实验条件下,逐级分段固定H2O2浓度,测定抗坏血酸的含量。
试验表明,抗坏血酸的浓度在1.0×10-7-1.0×10-5mol/L范围内有良好的线性关系。
检出限为6.0×10-8rnol/L。
2.4.3样品分析
应用本法对维生素C片剂中抗坏血酸含量进行测定。
【8】
3维生素C注射液
3.1电导法
实验方法:
根据浓度和电导率的关系,作工作曲线,然后测量样品溶液的电导率。
依据工作曲线,得出样品溶液的浓度,从而得出样品维生素C注射液的含量。
该方法具有简便、快捷、准确、重现性好的优点。
3.1.1维生素C的浓度与电导率关系
精密称取维生素C0.9106g,置于100ml容量瓶中,加水溶解并定容到刻度,摇匀备用。
精密量取备用溶液5、10、15、20、25ml,分别置于50ml容量瓶中,加水稀释到刻度,摇匀后测定电导率。
以浓度c为横坐标,电导率k为纵坐标作图。
3.1.2含量测定
精密量取维生素C注射液4ml置于100ml容量瓶中,加水稀释到刻度,摇匀备用。
精密量取该样品溶液10ml置于50ml容量瓶中,加水稀释到刻度,摇匀,按实验方法测定电导率。
【9】
3.2紫外分光光度法
实验方法:
根据维生素C在溶液pH5-6和EDTA中稳定的性质,以EDTA与醋酸—醋酸钠缓冲液(pH6)为溶剂,采用紫外分光光度法测定其含量。
3.2.1溶剂EDTA与醋酸—醋酸钠缓冲液(pH6)的配制(以下简称EDTA液)
取无水醋酸钠5g,稀醋酸4ml与EDTA—2Na液(0.05mol/L)1ml,加水使溶解成500ml。
3.2.2测定波长的选择
取维生素C适量,用EDTA液制备每1ml含8μg的溶液同时按处方比例制备全辅料的EDTA液,以EDTA液为空白,在230-290nm波长处扫描,结果表明,本品在264nm波长处有最大吸收,而辅料对吸收无干扰。
3.2.3标准曲线的制备
精密称取维生素C适量,用EDTA液制成每1ml含4、6、8、10、12μg的溶液,在264nm波长处测定吸光度,得回归方程:
A=0.0832C+0.009r=0.9998
3.2.4含量测定
精密吸取维生素C注射液用EDTA液制成每1ml含8μg的溶液,依法测定。
【10】
3.3比色法
实验方法:
维生素C与Fe(Ⅲ)-邻菲啰琳复合物反应生成邻菲啰琳-Fe(Ⅱ)复合物,后者在510nm波长处有最大吸收。
采用比色法直接测定维生素C注射液的含量。
3.3.1浓度与吸收度的关系
精密称取维生素C适量,用水溶解,制成约20件g/ml的溶液,精密吸取
1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml,分别置于25ml容量瓶中,以下操作同样品测定方法项下,将结果数据进行回归,得回归方程:
A=1230C-0.001,r=0.9997
表明维生素C在0.9-5.4μg/ml范围内符合比尔定律。
3.3.2样品测定方法
精密量取样品适量,加水制成约25μg/ml的浓度,再精密量取2ml置25.0ml容量瓶中,加邻菲啰琳-Fe(Ⅲ)试液lml,混匀。
静置lmin后用水稀释至刻度,以邻菲啰琳-Fe(Ⅲ)试液lml稀释至25.0ml为空白,于510nm处测定吸收度。
利用回归方程,按下式计算百分含量。
本法操体简便、快速、灵敏,可作为医院、药厂对维生素C注射液及其中间品质量监测的参考。
【11】
3.4动力学荧光法
实验方法:
在硫酸介质中,抗坏血酸能活化钒(Ⅴ)催化溴酸钾氧化藏红T的反应,使其荧光猝灭,建立了动力学荧光法测定抗坏血酸的新方法。
采用固定时间法测定体系的荧光猝灭程度。
方法的检出限为5.8×10-3μg/ml,线性范围为0-0.56μg/ml。
可用于药品、蔬菜、尿液中抗坏血酸含量的测定。
3.4.1方法
在25mL具塞比色管中,加入1.20mL0.05mol/LKBrO3溶液,0.60ml0.10mol/L的H2SO4溶液,1.20ml3.0×10-4mol/L的藏红T溶液,1.20ml0.40μg/ml钒标准溶液,适量的抗坏血酸标准溶液,用水稀释至刻度,摇匀,置于沸水浴中加热8min,取出后流水冷却3min。
于荧光光度计上以516nm为激发波长,586nm为发射波长测定荧光值F,以对应试剂空白为F0,计算△F=F0-F。
3.4.2样品含量测定
Vc用去离子水溶解定容后按实验方法进行测定,对结果进行处理。
【12】
3.5碘离子选择性电极分析法
实验方法:
离子选择性电极分析法多用于无机离子的直接测定。
该方法设备简单,操作简便易行,精确度较高,全部实验只需十几分钟即可完成。
可满足生产部门的中控和一般制药厂及营养研究单位抗坏血酸含量的测定。
3.5.1格氏作图法
空白测定:
在50ml容量瓶中加1mol/LKNO35ml,淀粉液2滴,用去离子水稀释至刻度。
将其倒入100ml干烧杯中,插入电极,依次加0.5ml标准碘化钾溶液(浓度由试样浓度决定)数次,测其相应电位值。
试样测定:
在另一50ml容量瓶中加1mol/LKNO35ml,淀粉液2滴,准确加入一定量被测试样,用去离子水稀释至刻度,将其倒入100ml干烧杯中,滴加I2-乙醇溶液(浓度由试样浓度决定)至呈微兰色。
插入电极按空白操作方法测其相应电位值。
由所得电位值和对应的碘化钾溶液体积在格氏纸上作图,即可求出待测物浓度。
3.5.2标准曲线法
取50ml容量瓶若干个,分别加1mol/LKNO35ml,5%淀粉液2滴和不同体积的抗坏血酸标准溶液,稀释至刻度。
分别滴加I2-乙醇溶演至微兰色,由稀至浓测其电位值。
以电位为纵坐标,—lgC为横坐标绘制工作曲线。
按同样操作测出试样的电位值,即可由工作曲线求得待测物浓度。
【13】
3.6酶催化动力学光度法
血红蛋白(Hb)具有和天然生物酶辣根过氧化物酶(HRP)相同的铁卟啉辅基和相似的空间结构,并且具有稳定、价廉、高效的优点。
在碱性介质中,血红蛋白对H2O2氧化酸性铬蓝K具有强烈的催化作用,而抗坏血酸对该体系具有一定的抑制作用。
据此建立了测定抗坏血酸的高灵敏度分析方法。
实验方法:
在10ml比色管中依次加入2.0ml的pH=9.5的NH3-NH4Cl缓冲溶液、2.5ml浓度为1.0×10-4mol/L的酸性铬蓝K溶液、1.0ml浓度为1.0×10-3mol/L的H2O2溶液、不同浓度的抗坏血酸标准溶液、1.5ml浓度为5.0×10-6mol/L的牛血红蛋白,用水定容。
在室温下放置20min后,用1cm吸收池,以水作参比,在550nm处测量吸光度。
以不加牛血红蛋白和抗坏血酸的试剂溶液为空白,测定吸光度为A0,加抗坏血酸的试剂溶液吸光度为A1,加抗坏血酸的试剂溶液吸光度为A2,计算抑制率I%=(A2-A1)/(A0-A1)用所得抑制率对抗坏血酸的浓度作校准曲线。
3.6.1吸收光谱
最大吸收波长均为550nm,加入血红蛋白后试剂溶液吸光度明显降低,而加入抗坏血酸后体系吸光度降低减少,表明抗坏血酸对血红蛋白催化过氧化氢氧化酸性铬蓝K的体系有强烈抑制作用。
3.6.2样品分析
将抗维生素C注射液适当稀释后按上述实验方法进行测定。
【14】
致谢
通过本次研究论文的设计,明确进一步脑补了维生素C的各种制剂的质量含量的控制标准,掌握了相关的专业知识。
感谢指导教师甘向辉老师、各位药房、实验室的(副)主任医师及药房药师的帮助,在此表示诚挚谢意。
结论
维生素C的测定方法有很多种,各有各的优缺点。
随着科技的发展,相信将来会有更多操作简便、选择性好、灵敏可靠、效率高、准确性高的分析方法。
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