细小病毒资料.docx
- 文档编号:15887319
- 上传时间:2023-07-08
- 格式:DOCX
- 页数:8
- 大小:25.83KB
细小病毒资料.docx
《细小病毒资料.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《细小病毒资料.docx(8页珍藏版)》请在冰点文库上搜索。
细小病毒资料
关于细小病毒的研究进展
摘要:
猪细小病毒病是引起母猪繁殖障碍的主要疾病之一,由猪细小病毒(Porcineparvovirus,PPV)引起,主要导致母猪特别是初产母猪产出死胎、畸形胎、木乃伊胎及病弱仔猪,偶有皮炎、腹泻及关节炎,母猪本身一般无明显症状。
是由Mayr和Mahhell(1966)进行猪瘟病毒组织培养时发现的,从培养细胞中发现并分离得到的一种小DNA病毒。
本病最早于1967年报道于英国,现呈世界性分布并在大多数猪场呈地方性流行。
我国于1982年由中国兽药监察所分离到该病毒,此后在上海、黑龙江、吉林、四川、浙江等地均分离到该病毒,虽然各地分离的PPV来源不同,名称各异,但均为同一型,血清学上无差别。
近年来,随着养猪业的发展,大型集约化猪场的相继出现,该病的发生呈上升趋势。
PPV按照其致病性与组织嗜性大致可以分为4个类型。
研究表明,PPV不仅是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一,而且能够引起多种猪病。
Blot等[5]证实PPV与猪的非化脓性心肌炎有关系。
一猪细小病毒病原学研究
1.1PPV的结构特点:
PPV属于细小病毒科细小病毒属,外观呈六角形或圆形,20面体等轴立体对称,无囊膜,衣壳由32个壳粒组成核心含单股线状DNA,长约5.2kb,能通过孔经为42nm的滤器。
平均直径20~26nm,分子量为5.3×106Da,G+C为48%,该病毒粒子有2种:
实心病毒粒子具有感染性和血凝活性;空心粒子不具有感染性。
2种粒子在氯化铯(作用是什么)中的浮密度分别为1.39和1.30g/cm3,是目前发现的动物病毒中一类最小最简单的单链线状DNA病毒。
该病毒具有耐热性和耐酶性,在4℃下非常稳定,56℃30min甚至48h处理后仍旧能部分保持感染力和血凝活性(甘孟候,1989;Cartwright,1969)。
PPV对酸抵抗力强,在pH3~9的条件下90min处理仍然稳定。
此外,该病毒粒子对胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶及核糖核酸酶,以及对脂溶剂如乙醚、三氯甲苯、醇和脱氧胆酸钠均有较强的抵抗力。
短时间的胰酶处理(处理的作用是什么)不但不能减弱其感染性,而且还会提高其感染效价。
PPV能凝集豚鼠、大鼠、猴、小白鼠、鸡、猫以及人的O型红细胞。
其中豚鼠红细胞的凝集效果最好;鸡红细胞对PPV的敏感性有很大的个体差异,一般1日龄小鸡的红细胞能够被凝集。
实心和空心的病毒粒子都能凝集红细胞,说明PPV的血凝性主要与病毒的衣壳蛋白有关。
1.2PPV的生长特性:
PPV的复制需要借助宿主细胞的蛋白质和核酸合成体系,因此PPV对培养细胞有一定的选择性。
PPV能在原代猪肾、猪睾丸细胞,传代PK-15、IBRS-2等细胞中增殖。
Oraveerakul等通过试验发现,PPV对宿主细胞的选择性体现在病毒的复制、转录以及蛋白质表达上而非吸附和进入细胞的过程中。
还有研究表明,PPV对不同细胞的选择性是由结构蛋白和非结构蛋白中的核苷酸序列决定的。
Choi等研究表明,PPV空衣壳可以抑制PPV在体外或体内的增殖。
他们将PPV空衣壳和完整的PPV病毒按不同比例混合感染猪睾丸细胞,以及先用PPV空衣壳处理细胞,然后用完整PPV病毒感染猪睾丸细胞,均发现无论在细胞内还是在细胞外病毒粒子的数量均下降,血凝效价也下降,且抑制效果和PPV空壳粒子的数量直接相关。
1.3毒株分型:
PPV按照其致病性与组织嗜性大致可以分为4个类型。
第1类是以NADL-2株为代表,口服接种不能穿过胎盘屏障,不能形成病毒血症,可以用作弱毒疫苗来防制PPV感染;第2类是以NADL-8株为代表的强毒株,口服接种能够穿过胎盘屏障,造成胎儿感染,形成病
毒血症;第3类是以Kresse株为代表的皮炎型强毒株,有报道称其毒力比NADL-8株还要强;第4类为肠炎型毒株,其主要引起肠道的病变。
虽然已经分离出了多株PPV,但是目前认为PPV只有一个血清型。
1.4组织嗜性与致病性:
PPV的组织嗜性与致病性。
目前已发现许多PPV分离株,其中研究较早的是NADL-8株和NADL-2株。
NADL-8是一种强毒株,怀孕母猪感染后将导致毒血症,并通过胎盘垂直传递给胎儿,使之大量死亡。
NADL-2是一种细胞适应后的弱毒株,怀孕母猪感染后不能经胎盘感染胎儿,因此被用作弱毒疫苗株,但NADL-2株通过子宫内接种,却有复制和感染能力,也可导致胎儿死亡。
Molitor等研究认为,NADL-2毒株感染细胞中有干扰缺损颗粒,可干扰NADL-2的复制,这种干扰作用为宿主机体建立抵抗PPV的免疫反应提供了足够时间,从而阻止了毒血症的产生和继发的胎盘垂直传染。
一般认为,母猪妊娠70d内感染PPV会造成胎儿死亡,感染后8d的细小病毒移植到血清学阴性受体母猪子宫内,卵巢黄体发现单核细胞浸润病灶。
母猪妊娠后期的胎儿已具备抵抗PPV感染的能力,因此妊娠70d后感染胎儿不会死亡。
但是Choi等用NADL-8株和Kresse株分别接种妊娠中期(40d龄)和后期(75d龄)的胎儿,却发现PPV不同毒株对胎儿的致病性不同。
Oraveerakul等用原位杂交技术来检测2病毒株在胎儿体内复制部位和数量上的差异,发现2毒株的RFDNA在肝脏内的相对数量相当,而在脑和脾中不同。
Kresse株感染的胎儿脑和脾脏中可以检测到RFDNA,而NADL-8株感染者检测不到核酸的复制,这就说明对于不同毒株,其DNA的复制具有组织选择性,因此不同组织中的病毒含量就存在差异PPV。
1.5致病机理:
pPV对猪的影响分为两方面,一是对母猪受精卵细胞的影响,二是对胎儿发育的影响。
PpV能顽固地吸附在母猪受精卵细胞透明层的外表面。
同时部分PPV能穿过透明带而进人卵细胞,并且其透明带外的卵细胞层里可以看到细胞碎片。
PPV还能使母猪的黄体发生萎缩。
如果怀孕母猪感染了PPV,则妊娠黄体发生萎缩,使之失去了正常时抑制排卵和分泌孕酮的功能,造成母猪体内的胎儿处于不利的环境中,最终出现流产、死胎、胚胎死亡、木乃伊化胎儿和不规律的恢复发情周期
二猪细小病毒分子生物学研究
2.1基因组结构和复制型DNA的特点
PPV基因组为单股负链DNA,大小约为5000bp,基因组有两个主要的开放阅读框架,基因组共编码3种结构蛋白和两种非结构蛋白,即VP1、VP2、VP3和NS1、NS2。
VP2蛋白是主要的免疫原性蛋白,可以诱导机体产生强烈的免疫反应,编码pPV的主要抗原决定簇,可诱导机体产生中和抗体.NS1蛋白是PPV基因组本身编码的反式激活蛋白,对PPV早期和晚期的转录发挥着重要作用,NS1蛋白只有在PPV进行复制时才可大量表达,PPV在DNA合成起始时感染宿主细胞,在感染细胞的细胞质中可分离出NS1,而在成熟的病毒颗粒子中含量很少或分离不出NS1。
灭活疫苗很难刺激机体产生针对NS1蛋白的抗体,而自然感染猪却可产生大量抗体,因此,检测非结构蛋白NS1的抗体可以用来区别灭活疫苗免疫猪和自然感染猪,另外有研究表明,NS1蛋白是具有多种功能的锚定蛋白,在PPV体外感染过程中具有重要功能。
结构蛋白和非结构蛋白的mRNAs共同终止于94~96bp的Poly(A)信号处。
基因组两端均有回文发夹结构,3′-端的102bp的回文序列折叠形成Y型结构;5′端有一个127bp的回文序列,中间被一个24bp的短回文序列中断,折叠形成U型结构。
PPV基因组的这种未端结构对其复制是必需的,Molitor等在构建PPV感染性分子克隆时发现,如果PPV基因组末端的回文序列的碱基数少于80bp,则PPV不能在宿主细胞上进行繁殖和复制。
PPV基因组复制遵循滚筒式复制原则,其复制不需要DNA环化,也不需要RNA引物,在宿主DNA多聚酶的作用下,首先由病毒基因组3′端发夹结构起始合成互补链(正链),将感染的亲代DNA转变为双链复制型DNA,然后以RFDNA为模板,合成病毒mRNAs和子代病毒基因组。
Moditor用选择性抽提法在PPV病毒株NADL-8感染的猪睾丸传代细胞培养物中抽提到非染色体性DNA,即PPVDNAL-8复制型DNA,其大小为5000bp碱基对。
PPVNADL-2株基因组除5000bp复制型DNA外,还有4700bp-NADL-2*复制型DNA。
经过研究表明NADL-2株复制型DNA的酶切特征与NADL-8株复制型DNA相同,而与NADL-2*复制型DNA则有明显的差异。
进一步试验表明,NADL-8株和NADL-2株复制型DNA对猪睾丸细胞具有感染性,呈现PPV诱导的特征性细胞病变,而NADL-2*复制型DNA无感染性。
2.2基因组的转录PPV感染宿主细胞后,早期启动子P4和晚期启动子P40分别从基因组的225nt和2035nt处起始转录物PT4和PT40,共同终止于4833nt处的Poly(A),经过4种不同拼接方式的拼接,产生四种次级转录物。
PT4不经过拼接,产生编码663个氨基酸(aa)的非结构蛋白NS1,PT4经过C型拼接,产生编码161aa的非结构蛋白NS2,其N端的86aa与NS1的完全相同,C末端的75aa为NS2特异性的,与NS1不同。
PT4经过D型拼接,产生编码106aa的非结构蛋白NS3,其N端的86aa与NS1完全相同,C端的20aa与NS1不同,与VP1编码区重叠,但目前尚无证据证明PPV感染的细胞中有NS3蛋白存在。
在PT40中有2个拼接供体位点和一个拼接受体位点,PT40经过B型拼结产生约2.9kb的VP2mRNA;VP1mRNA和VP2mRNA分别从2287nt和2810nt处的ATG起始翻译,共同终止于4547nt处的ATG,产生两种结构蛋白VP1和VP2。
现在认为,VP3是VP2的翻译后切割加工的产物。
Molitor等证实,PPVVP2基因在759~917位点有连续158个碱基是PPV所特有的,而且强毒株和弱毒株此段基因序列完全相同。
在PPVVP2蛋白的近N端有连续的9个甘氨酸,这种GGG样的甘氨酸富集区折叠成α-螺旋结构,可能是产生VP3蛋白的切割位点。
2.3结构蛋白与非结构蛋白
(1)结构蛋白PPV基因组编码两条结构多肽,即VP1和VP2。
另有一条结构多肽VP3由VP2水解而产生。
结构多肽形成后,装配成病毒粒子。
编码PPV结构多肽和非结构多肽的基因几乎贯穿整个DNA序列,这样,就使形成的病毒粒子能以极小的空间存在。
VP1蛋白C端氨基酸与VP2的N端氨基酸序列相互重叠,其37N端富含碱性残基。
李昌文等经过分析表明,不同PPV毒株VP2基因的核苷酸之间的同源性为99%左右,而且含有细小病毒的保守序列,即UFPNGQIWD-KEL;在无感染性的缺损病毒NADL-2*的基因组中没有这段保守序列的相应序列,因此推测这段保守序列可能是产生完整的病毒结构蛋白和成熟的病毒粒子必不可少的功能区域。
Bergerron等证实VP2基因内的位于两个BglII酶切位点之间的基因编码区对不同毒株的细胞嗜性致关重要。
因此,我们可以将不同毒株的此基因编码区进行改造,购建嵌合病毒,从中筛选更加优良的疫苗株。
从纯化的PPV病毒电镜图中可以找到两种PPV粒子,一是完整病毒粒子,富含VP3,可以感染细胞或组织;另一为病毒空壳,没有VP3,富含VP2,不能感染组织和细胞,但病毒空壳却占据宿主细胞表面PPV受体位点,从而干扰完整病毒粒子与宿主细胞的结合,影响细胞培养物的HA值。
(2)非结构蛋白PPVNS1基因编码PPV的非结构蛋白NS1,该蛋白是PPV基因组本身编码的反式激活蛋白,对PPV早期和晚期的转录发挥着重要作用。
另外有研究表明,NS1蛋白是具有多种功能的锚定蛋白,在PPV体外感染过程中具有重要功能。
因此可以用NS1蛋白来区别灭活疫苗感染猪和自然感染猪,这在昆虫杆状病毒中已经得到实现。
WesternBlot分析,由PPV完整病毒粒子提纯物免疫家兔所得到的抗血清能与NS-1产生免疫反应。
而颇有趣的是几种脊椎动物的细小病毒的抗血清与NS-1能产生交叉免疫反应,而结构多肽仅在紧密相关的几种细小病毒之间产生这种类似反应。
说明脊椎动物细小病毒的NS-1遗传是极为保守的。
吴丹等通过研究表明,NS1基因编码区全长1989bp,编码662个氨基酸,几株不同的PPV毒株间NS1基因的同一性可达98%~99%,含有3个潜在的糖基化位点,分别位于356~359、446~449和513~516位氨基酸处。
NS1基因并含有一切细小病毒共有的保守序列GKRN,目前认为此类保守序列是与ATP酶或GTP酶相关的ATP或GTP结合位点,并具有解旋活性,它拓展了PPV病毒末端的空间构型,对病毒DNA复制的复制是必需的。
与PPV不同的是,其他一些脊椎动物细小病毒还存在一条分子量较小的非结构多肽NS2,其氨基端与NS-1相同。
三防治与免疫
3.1防治措施
本病目前尚无特异的治疗方法。
对于发病猪场,应将发病母猪、仔猪隔离或淘汰。
所有猪场环境、用具应严密消毒,并采用血清学方法对全群猪进行检查,对阳性猪应采取隔离或淘汰,以防疫情进一步发展。
在未发生猪细小病毒病的猪场和地区,应建立高标准的卫生防疫和综合防制措施;定期进行血清学监测,及时发现可疑猪,将其猪群淘汰,并对其猪舍、饲具、车辆、饲料等彻底消毒;坚持自繁自养,确实需引进种猪时,一定要按规定引种,杜绝引进病猪及带毒猪;配种时采用经检验不带毒的精液.进行人工授精。
在地方性流行发病猪场:
对初产母猪要建立主动免疫(9一10月龄)后才配种;猪场要经常消毒,并且一定要彻底,同时建立消毒效果检查制度;建立科学、规范的免疫程序,并建立经常性的血清抗体监测制度。
3.2疫苗的使用
使用疫苗是预防猪细小病毒病,提高母猪繁殖率最有效的方法。
猪细小病毒疫苗分为弱毒活苗和灭活苗两大类,其中弱毒苗目前主要在国外应用(子宫内接种对胎儿有致病性,是否发生毒力返强亦不得而知),而我国均普通使用灭活苗。
弱毒活苗主要有NADI2(细胞培养适应株),H'T株(低温细胞传代育成株),HT-SK-C株(HT株经紫外线照射后再传代育成株)和N株(自然弱毒株)4株弱毒活苗。
灭活苗有蜂胶组织灭活苗,铝胶细胞灭活苗和油佐剂灭活苗3种灭活苗。
蜂胶组织灭活苗的最小免疫剂量为
接种4周后产生保护性免疫;铝胶细胞灭活苗为猪细小病毒经组织培养,经甲醛灭活处理,加人氢氧化铝胶溶液;油佐剂灭活苗为猪细小病毒经组织培养,N.乙酞乙烯亚胺(AEI)或甲醛灭活30--60小时,加人油佐剂配制而成双相油乳剂苗。
猪注射疫苗后7--14天产生免疫,免疫期为7~12个月。
母源抗体的持续期为16一24周,仔猪母源抗体的持续时间与母猪抗体滴度呈正相关。
一般注苗后血凝抑制抗体效价大于1:
80时,即可抵抗ppv的感染,但血清抗体转阴后一个星期的猪对ppv又具有易感性.在猪场内一定要改本交为人工授精,杜绝使用带有PPV的精液进行配种;改善生态环境,驱除和消灭鼠类、鸟类,科学选择猪场场址,猪场内
严禁饲养猫、狗及鸟。
总之,建立严格的、立体的、及全方位的防疫制度,即规模化养猪的防疫系统工程是当务之急。
疫苗的研究进展见附页
研究热点:
1.山东农业大学的鹅细小病毒NS1基因植物真核表达载体的构建
鹅细小病毒GPVB株全基因组设计一对引物,采用PCR方法扩增出鹅细小病毒扬州株(GPVYZ)非结构蛋白基因NS1,克隆到植物表达载体pBI121中,转化至大肠杆菌感受态细胞JM109。
经菌液PCR、双酶切及质粒PCR鉴定后,将阳性重组质粒转化感受态农杆菌LBA4404。
经菌液PCR及质粒PCR分析,获得了真核表达载体pBI121-NS1,该载体的构建为进一步研究鹅细小病毒NS1基因的分子生物学特性打下良好基础。
2.中国农科院哈宾兽医研究所关于鹅细小病毒vp1基因片段的原核表达及抗血清的制备
3.福建农林大学关于犬细小病毒VP2基因原核表达载体的构建与分析,从犬细小病毒/犬瘟热进口二联苗中提取犬细小病毒基因组DNA,以此为模板进行PCR扩增,PCR产物经BamHI和XhoI双酶切后,克隆至pET22b(+)质粒的相应位点上,构建了原核表达载体pET22b/VP2.重组质粒经限制性内切酶酶切和核苷酸序列分析表明,VP2基因已正确克隆到pET22b(+)载体上,从而成功地构建了pET22b/VP2表达载体.
4.河南农业大学关于猪细小病毒NS1基因的原核表达及重组蛋白的复性
利用PCR技术扩增出PPVNS1基因抗原区。
将目的基因与原核表达载体pGEX-4T-1进行连接并转化,重组质粒经鉴定并测序。
测序结果表明,目的基因插入的位置、大小和读码框均正确,通过试验摸索并确定了表达NS1基因的最佳诱导条件:
IPTG终浓度为1·0mmol/L,诱导时间为10h,温度为37℃,其表达量占全菌蛋白的29·8%。
表达产物经SDS-PAGE分析,得到分子量约为52kDa的重组蛋白且以包涵体形式存在。
重组蛋白经Westernblot检测,结果证明重组蛋白可被PPV阳性血清识别。
用8mol/L尿素变性溶解包涵体,再用稀释方法和还原型、氧化型谷胱甘肽系统相结合的方法对重组蛋白进行复性。
ELISA检测表明,复性后的重组蛋白有良好的生物活性。
5.四川农业大学关于猪细小病毒(PPV)SC1株非结构蛋白NS1基因的克隆和序列分析
6.南京农业大学关于猪细小病毒基因主要抗原表位的表达及检测应用
7.中国科学院武汉病毒研究所关于猪细小病毒vp2基因的表达和类病毒颗粒的构建
利用PCR方法从病毒基因组中获得了vp2完整的编码区并经测序后克隆到原核表达载体pET-32(a)上。
在大肠杆菌中诱导表达了VP2与Trx-His-STag的融合蛋白,通过免疫家兔获得了高特异性的兔抗血清。
另外,将vp2克隆到pFastBacDUAL载体上,利用昆虫表达系统,即AcMNPV的Bac-to-Bac系统对vp2进行了表达,经SDS-PAGE
和Westernblot分析,表达产物为64kD,并且该蛋白能在昆虫细胞中形成类病毒颗粒
人们主要集中在vp2和ns1的研究
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 细小 病毒 资料