白腰雪雀的线粒体DNA提取及COI基因序列测定2.docx
- 文档编号:15624015
- 上传时间:2023-07-06
- 格式:DOCX
- 页数:13
- 大小:231.70KB
白腰雪雀的线粒体DNA提取及COI基因序列测定2.docx
《白腰雪雀的线粒体DNA提取及COI基因序列测定2.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《白腰雪雀的线粒体DNA提取及COI基因序列测定2.docx(13页珍藏版)》请在冰点文库上搜索。
白腰雪雀的线粒体DNA提取及COI基因序列测定2
毕
业
论
文
题目
指导老师
班级
姓名
白腰雪雀线粒体DNA的提取及CoI基因序列测定
时盛娟青海师范大学生命与地理科学学院08生物科学
西宁市810800
摘要:
雀形目((Passeriformes)是现存鸟类中种类最多、适应辐射最广的类群。
已有学者采用采用线粒体DNA等分子标记对部分雀形目鸟类的分子系统发育关系进行了一些探讨,本文通过对青藏高原的特有的白腰雪雀的DNA的提取及COI的序列测定做一个简单的分析,通过序列比对分析出现这种情况的原因,为物种鉴定奠定基础。
关键字
:
白腰雪雀线粒体DNAcol基因序列测定
White-rumpedsnowfinchMitochondrialofDNAandCoIgenesequences
Abstract
ThebirdsofPasseriformesarethegroupwhicharethelargestnumberandthebroadestadaptiveradiationofexistentaves,theirmolecularphylogenyhavebeenfocusedonforalongtime.FormermolecularphylogenyofthelimitedpasserineshadbeenstudiedbymitochondrialDNA.basedontheTibetanPlateau'suniquewhite-rumpedsnowfinchDNAextractionandCOIsequencedeterminationmaketodoasimpleanalysis.sequencealignmentanalysisofthereasonsforthis,tolaythefoundationforspeciesidentification.
目录
文献综述-------------------------------------------------------------------
1分子系统学概述------------------------------------------------------
1.2线粒体DNA在鸟类分子系统学研究中的应用---------------
1.2.1鸟类细胞色素c氧化酶亚单元I基因.------------------------------
2雪雀现状及白腰雪雀基本特征--------------------------------------
3研究内容、目的和意义--------------------------------------------
2材料与方法.--------------------------------------------------------------
2.1试验材料---------------------------------------------------------------
2.2主要仪器设备---------------------------------------------------------
2.3主要试剂及其配制---------------------------------------------------
2.4基因组DNA的提取与检测-----------------------------------------
2.4.1基因组DNA的提取.------------------------------------------------
2.4.2DNA质量的检测----------------------------------------------------
2.5PCR扩增、检测与回收.---------------------------------------------
2.5.1扩增引物--------------------------------------------------------------
2.5.2PCR反应主要体系组成及扩增程序----------------------------
2.5.3扩增产物的检测----------------------------------------------------
2.6测序---------------------------------------------------------------------
2.7序列编辑、校对及序列比对--------------------------------------
3结果与讨论-------------------------------------------------------------
3.1COI基因序列-----------------------------------------------------------
3.1.2NCBI基因比对序列-----------------------------------------------
3.2讨论--------------------------------------------------------------------
参考文献.---------------------------------------------------------------------
1文献综述
1.1分子系统学概述
分子系统学(Molecularsystematic)是检测、描述并解释生物在分子水平的多性及其演化规律的一门学科。
该学科的理论基础来源于系统学、分类学、遗传学、生物化学、分子生物学和进化论,方法来源于免疫学、仪器分析、生物化学和分子生物学【1】。
它有两个重要的理论基础【2】:
其一是中性进化理论,认为在分子水平上,在不断出现突变的情况下,生物进化来自选择性突变的随机固定,种内的遗传变异为选择中性或近乎中性,它们在种内通过注入突变和随机消失之间的平衡而在种内得以保持。
其二是进化速度均衡论,也即分子钟(molecularclock)假说,认为生物的分子进化过程中普遍存在有规律的钟,即分子进化速率近似恒定,分子变异程度能较地反映物种进化距离。
20世纪50-60年代,分子系统学的研究主要在蛋白质的水平上进行;等位酶、同功酶电泳技术开始成为分子系统学的热点技术。
70年代,分子系统学研究进入了核酸水平。
自20世纪80年代以来,伴随PCR技术的发展,DNA取代蛋白质成为分子系统学研究的主体。
分子系统学的研究方法很多,主要包括蛋白质电泳、DNA杂交技术、随机扩增多态性(RAPD)、扩增片断长度多态性(AFLP)、限制性片段长度多态性(RFLP)和核酸序列分析等。
DNA不仅是主要的遗传物质,同时也是生物进化史的重要记录者,具有DNA序列易于分析,含有无比丰富的进化信息和相对易于获取等优点,因此,核酸序列分析是最主要的方法之一,主要用于系统发育和分子进化的研究。
它直接测定生物体内DNA序列,通过比较不同类群个体同源DNA序列,基于一定的假设、模型和计算方法构建分子系统树,从而推断类群间的系统演化关系。
PCR介导的DNA序列分析的优点在于【3】:
(1)该方法能够快速获得大量个体的同源DNA序列数据,进而直接计算种间或种内的遗传差异。
通过选择保守程度不同的DNA片段可以解决不同分类水平的系统学问题;
(2)由于只要几个分子的目的DNA就能实现PCR扩增和序列分析,因此人们可以有效的利用原先难以或者不能分析的组织样品。
随之出现得非创伤性采样技术,大大促进了对濒危动物的系统学和遗传学研究[4]。
1.2线粒体DNA在鸟类分子系统学研究中的应用
传统的鸟类系统学研究主要以形态学研究为主,在研究上存在许多有争议之处。
近年来利用鸟类鸣声来进行鸟类系统学研究,它可以解决形态学无法解决的一些分类疑难。
随着分子遗传学理论和技术的发展,从分子水平上解决这些不确切的问题,是鸟类系统学的发展趋势[4]。
线粒体DNA(mtDNA)具有易分离、进化速度快、母系遗传、缺乏重组和无内含子等特点;这些特点使线粒体DNA成为分子系统发育学研究的一类重要的分子标记,而且也是当前鸟类分子系统发育研究的热点[5]。
1.2.1鸟类细胞色素c氧化酶亚单元I基因
细胞色素c氧化酶亚单元I(CytochormeoxidasesubunitI,CoI)基因是一种线粒体蛋白质编码基因。
在鸟类中该基因全长为1551bp,密码子第3位点进化最快,而第二位点最为保守。
利用CoI简短的标准化DNA片段(648bp)可以进行物种鉴定【6】,因此CoI基因被认为是一个很好的物种鉴定工具【7】,也是生物分类学的新动向一DNA条形编码选用的主要基因之一【8】其序列的整体进化速率比Cytb的略低。
利CoI简短的标准化DNA片段(648bp)可以进行物种鉴定,因此CoI基因被认为是一个很好的物种鉴定工具[9],也是生物分类学的新动向一DNA条形编码选用的主要基因之一Hebert等对260种北美洲鸟类的COI基因序列(1176bp)进行研究,发现每一种鸟类都有各自不同的COI条形码,其种间差异远大于种内差异,通过对这种条形码的分析,很容易进行分类[9]。
1.3雪雀现状及白腰雪雀基本特征
雪雀的分布呈现明显的规律性,东西走向,基本贯穿整个亚欧大陆高山带。
青藏高原是雪雀的分布中心,在这里有6个种,11个亚种不同程度的重叠分布。
在青藏高原隆起前,此地是低海拔的丘陵旱生植物草原,雪雀的原始种类有可能广泛分布于此处。
青藏高原的隆起带来新的生存环境,雪雀的原始种类不得不面临新的生存压力,为适应新形成的气候条件,雪雀从原始种类中分化出一支来以适应新环境下的寒冷气候。
在竞争压力的迫使下,雪雀向四处相似的生境扩散。
黑喉雪雀向东北扩散;阿富汗雪雀向青藏高原的临近地区兴都库什山脉扩展;白斑翅雪雀则沿横贯亚欧人陆的阿尔卑斯-喜马拉雅山脉扩散,形成今天独特的高山分布格局【10】。
雪雀属划分为三个亚属阶元:
原雪雀属种间,棕颈雪雀、棕背雪雀与黑喉雪雀有较近的亲缘关系;白斑翅雪雀与褐翅雪雀有较近的亲缘关系;,雪雀亚属与地雀亚属前者包括包括白斑翅雪雀与褐翅雪雀后者棕颈雪雀,棕背雪雀,黑喉雪雀)与阿富汗雪雀有较近的亲缘关系.
1.3.2白腰雪雀基本特点
拉丁名:
Montifringillataczanowskii
英文名:
White-rumpedsnowfinck
分类:
雀形目、麻雀科、雪雀属
雪雀全长约17cm。
上体淡褐色,前额及眉纹白色,有一道黑色过眼纹。
腰及尾上覆羽白色,翼覆羽及次级飞羽基部白色,形成翼上大块白斑;中央尾羽为黑褐色,其余尾羽具有白色端部;下体白色,胸部沾褐灰色。
栖息于3000~4500m的多裸岩的高原荒漠、草原及沼泽边缘,喜结小群枉于鼠兔群集处,栖息、营巢于鼠兔废弃的旧洞中。
炫耀飞行似,以及在地面作"敲击"求偶炫耀。
冬季成大群。
着陆时尾摇摆不停。
甚惧生。
分布于西藏、青海、甘肃以及四川,甚常见于海拔3800~4900米。
留鸟于西藏、青海东部及甘肃西南部祁连山及阿尼玛卿山并四川的北部及西部岷山[11]。
1.4研究内容、目的和意义
雀形目((Passeriformes)是现存鸟类中种类最多、适应辐射最广的类群。
已有学者采用采用线粒体DNA等分子标记对部分雀形目鸟类的分子系统发育关系进行了一些探讨,但对于高原地区的雪雀的研究目前还处于起步状态,通过对其DNA的提取及COI的基因序列的测定做一个简单的分析,通过序列比对分析出现这种情况的原因,为物种鉴定奠定基础。
2.实验材料及方法
2.1实验材料白腰雪雀采集于祁连
2.2主要仪器设备
1)PCR仪:
PXII,美国Hybaid
2)高速冷冻离心机:
58048型,德国Eppendorf
3)离心机:
5415D型,德国Eppendorf
4)紫外透射仪:
TVC-3128型,美国Spectroline公司
5)电子天平:
CP225D型,北京赛多利斯仪器系统有限公司
6)电泳仪:
DY8C型,北京六一仪器厂
7)凝胶成像分析系统:
TransilluminatorWS-3C,河北万生博朗电子有限公司
8)移液枪:
德国Eppendorf
9)电热恒温水浴锅:
HAS型,上海医疗器械五厂
10)常温冰箱:
Haier(cool&fresh),青岛海尔集团
11)微波炉:
青岛海尔集团
12)SW-CJ超菌工作台:
苏州安泰空气技术有限公司
13)耗材:
枪头、离心管、PCR扩增管均为国产
2.3主要试剂及其配制
本实验采用PCR扩增的为线粒体COI基因进行扩增、,本试验所需部分溶液配制方法如下:
匀浆液:
A:
B:
C=8:
1:
1
A液TrisV=50mlM=0.3035gPH=8
Na2EDTAM=1.6913gV=50ml
NaclM=0.2925gV=5ml
B液SDS(5%)V=50ml
C液PDK2mg/ml
2.4基因组DNA的提取与检测
2.4.1基因组DNA的提取
本实验的样本采用传统的酚一氯仿抽提法从肌肉中提取基因组DNA.酚一氯仿抽提法步骤如下:
1)取样取冷冻的鸟类肌肉组织约0.5g放置在洁净的滤纸上,吸干水分,将标本放置预先加300vld的匀浆缓冲液的离心管中(1.5m1),剪碎肌肉。
2)研磨在离心管中加入一支已灭菌的研磨棒,将肌肉研碎,至溶液均匀,然后再给离心管加入30ul的缓冲液。
3)消化水浴40摄氏度2小时+60摄氏度3小时至混合液消化至清亮为止。
4)酚抽取取出上清液,加入酚、氯仿各20u1,缓慢颠倒混合10min;4℃,8000rcf离心15min)
5)氯仿异戊醇抽提取出上清液,加入等体积氯仿异戊醇((24:
1),缓慢颠倒混合数次离心15min4℃,8000rcf,取出DNA溶液。
6)DNA的沉淀上清液中加入2倍体积的-20℃无水乙醇,冰箱内-20℃放置一段时间后取出(大约30分钟),4℃,,12000rcf离心15分钟,弃上清。
7)DNA的洗涤再加入-20℃70%乙醇500vl漂洗,缓慢颠倒混合,40C,10000rcf离心5分钟,弃乙醇溶液,通风自然晾干。
8)DNA的保存加入适量100ul的无菌水溶解,放4℃备用,或一20℃保存。
9)DNA的检测电泳检测:
1%的琼脂糖平板凝胶,0.5xTBE缓冲液电泳,DNA样品取2.0,ul上样,80V电泳40min。
(如下图)
(白腰雪雀DNA电泳图)
2.5PCR扩增、检测
2.5.1扩增引物
本文选用1对引物,对白腰雪雀COI基因部分序列进行了扩增。
引物具体情况见表1-1。
以上引物均由上海生工生物工程技术有
限公司合成,可特异地扩增鸟类线粒体DNA的COI基因部分序列(561bp)。
其中H和L分别代表重链和轻链,数字表示引物3‘碱基在鸟类全线粒体DNA序列上的位置。
表1-1CoI基因扩增测序引物
Table2-2CoIPrimersforPCRAmplineationandSequneeing
引物名称引物序列引物来源
Co1L66155'-CTCTATAAAAAGGTCTACAGCC-3'Sorenso[11]
H79565'-GGTAGTTCCGAGTATCGTCG-3'
2.5.2PCR反应主要体系及组成及扩增程序
鸟类COI基因部分序列PCR反应体系组成及扩增程序如下:
CoI基因部分序列扩增程序为:
94℃预变性4min;94℃变性45s,42-50℃退火Imin,72℃延伸1min,35个循环,循环结束后72℃最终延伸5min部分个体的线粒体基因扩增使用TouchdownPCR程序。
为了确保实验过程中不受外源DNA分子的污染,PCR扩增过程中设置空白对照。
PCR原液组成DNA解旋酶25vl;水22vl;样本1vl;上游引物1vl;下游引物1vl;共50vlRCR原液上下引物各4管
2.5.3扩增产物的检测
取其中一管PCR原液,用1%的琼脂糖凝胶、在120V电压下电泳,电泳时选用Marker2000进行目的基因片段的进一步确认,电泳结束后;在紫外检测仪上检测扩增产物,并用凝胶成像仪扫描。
其他三管送生工生物(上海)有限公司测序。
2.6测序
所扩增的CoI基因片段虽较长,但这个基因相对保守,可选用的引物通用性较好,因此,大部分序列采用纯化后直接送上海生工生物工程技术服务有限公司,利用AB13730遗传分析仪进行序列的双向测定。
2.7序列编辑、校对及序列处理。
将测序结果输入Chromos软件观察其测序质量后,将所得的双向测序结果用DNAStar软件包中SeqM。
和EditSeq软件进行拼接并辅以人工矫正,并将拼接矫正保存后的DNA序列在NCBI中进行BLAST相似性搜索,以确保获得的序列为目的基因片段。
再用ClustalX2.0软件进行比对,比对过程的参数pairwiseparameters和multipleparameters设置均采用默认值,输出文件形式CLUSTALformat和NEXUSformat,最后进行全序列比对。
将比对的结果输入MEGA4.1软件,转换为MEGA格式。
对序列组成进行统计,包括保守位点(Conservedsites,C)、变异位点(variablesites,V)、简约信息位点(parsimonyinformationsites,Pi)、自裔位点(singletonsites,S)、各数据组碱基的组成(Nucleotidecomposition)、转换与颠换的t匕例(TS/TV)等。
3实验结果与讨论
3.1白腰雪雀的COI基因序列
-------------TCAAAGTTGTAGTGTTGAGAGGCGGTTGGTAATTCAT
CGGTTGTCCAGGGAAGGAAGAAGTAG----GGCTGGGAATATTATTGAGA
TGAGAACTAATGGGATTCCTAGG---AGTGATGGGCTTGAGAACTGGTCG
AAGAAGCTTAAGTTCATGGTCAG-GTTCAAGGGGTAGTGCTTGGGGCCAC
AATTGATTTGTGAGATGGGGGG--------TTTGTTGATACAAATGATAG
GAGTTTAGGTTGAATGATTAGGGAGAAGGTTATTCATGAAATGATTATAA
TAAAAAATCAGGGGTTAGGGTTTAGTTGGGGCATGCCATTAAGGAGGGGG
AAAGCCCTCTTTCTTTAGCTTAAAAGGCTAATGCTGGTTCATAGCTTCT-
TAATGATTAGGATGATATTAGAGAGGATCAGTTTTCGAAGTTGGCGAGGG
GAGTCGATTCTACTACGATTGGTATGAAGCTGTGGTTAGCCCCGCAAATT
TCTGAACATTGTCCGTAGAAGACTCCGGGTCGGGAGGCAAGGAAGGAAGT
TTGATTGAGGCGTCCTGGGATTGCATCGGTTTTTACGCCTA
3.2NCBI对比序列
ATAAGAATACTTATTCGTACTGAATTAGGAATACCTGGGTCCTTAATTGG
TAATGACCAAATTTATAATGTTTTAGTTACAGCACATGCTTTTATTATAA
TTTTTTTTATAGTAATACCAATAATAATTGGAGGATTTGGTAACTGATTG
G------TCCCATTAATAATTGGGGCTCCAGATATAGCATTCCCTCGAAT
AAATAATATAAGATTTTGGCTATTACCTCCTTCCTTAATACTCTTATTAA
TATCTTCTTTTGT-CGACTCCGGAGTTGGAACAGGCTGGACTCTTTACCC
CCCCTTATC-----CTCAAATTTATCTCATTCTGGCCCTTCAGTTGATTT
ATCTATTTTTTCTCTCCATTTAGCAGGTGTCTCCTCAATTCTAGGTGCTA
TTAATTTTATTACAACAATTATTAATATACGTTCTAAGGGAATAAAATTT
GAGTTAATTCCACTA---TTTGTTTGAAGA-ATTTTAATTACTGTAATTC
TTCTTCTTCTTTCTCTCCCTGTATTAG---CAGGCG-CTATTACTATACT
TTTAACAGATCGAAATTTTAATACCTCATTT----------
在COI(1176bp)基因序列中共有变异位点369个占总位点的31.4%,信息简约位点303个,占变异位点82.7%占总位点25.5%,转换/颠换为1.604,碱基A、T、G、C的平均含量为27.7%、25.5%、29.4%、17.4%。
2.7.2讨论
导致这种结果出现的原因:
雀形目是鸟类中最进化的类群,这一类群最初仅仅是通过包括颇、精子、前翅和后肢肌肉、以及脚趾形态上的共同衍征而划分出来的,然而,在某些连续的特征上该
类群与其它鸟类也存在差异,它们比同等体型的有着更高的代谢率,有着相对较大的大脑和优越的学习能力,特别是在发声方面。
由于雀形目种类多、数目庞大、形态多样、行为复杂、行为和解剖特征等差距较大,可导致COI基因序列差距较大。
白腰雪雀属于高原特有种,因高原特有的气候所造成的基因突变或进化,或在实验过程中出现误差所造成这种变化,出现这种现状也是白腰雪雀对其生境的一种适应。
参考文献
[1]黄原.分子系统学一原理,方法及应用【M]。
北京:
中国农业出版社,1998.
[2]Felsenstein,J.Phylogeniesfrommolecularsequences:
inferenceandreliability[J].AnnualReviewofGenetics,1988,22
(1):
521-565.
[3]张亚平.从DNA序列到物种树[[J].动物学研究,1996,17(3):
247-252.
[4]王亚明,周开亚.PCR介导的DNA序列系统分析在系统动物学中的应用[[J].动物学杂志,1996,
[5]张原,陈之端.分子进化生物学中序列分析方法的新进展[[J].植物学通报,2003,20(4):
462-468.
[6]Zhang,W.,F.Lei,G.Liang,etal:
TaxonomicstatusofeightAsianshrikespecies(Lanius):
phylogeneticanalysisbasedonCytbandColgenesequences[J].ActaOmithologica,2007,42
(2):
173一180.
[7]雷忻,廉振民,雷富民等.基于线粒体COI
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 白腰雪雀 线粒体 DNA 提取 COI 基因 序列 测定