推荐下载关于甘肃不同产地当归ITS序列分析.docx
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关于甘肃不同产地当归ITS序列分析
【编者按】:
医药论文是科技论文的一种是用来进行医药科学研究和描述研究成果
的论说性文章。
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关于甘肃不同产地当归ITS序列分析
作者:
楚惠媛,金建文,李海龙,李沛清,陈彻,安方玉
【摘要】目的建立甘肃产当归功效的分子系统学基础,为甘肃产当归道地性提供
分子依据。
方法采用PCR技术获得ITS基因,进行测序,经软件进行统计分析,计算各样
本间的遗传距离。
结果甘肃岷、漳两县当归ITS序列差异极小,在0.0000~0.0083之
间,岷县5个样品与漳县DG9号样品在586位都为C,589位都为T,而漳县其他3个样品
在这2个位点分别为T和G。
结论ITS序列特征可以作为当归种间鉴别的有效分子标
记,当归ITS序列第586位和589位2个位点碱基可能成为岷当归的碱基鉴别位点。
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【关键词】当归;ITS;序列分析;道地性;甘肃
Abstract:
ObjectiveToestablishthebasisofmolecularsystematicsofAngelicafrom
differentareasofGansuprovincesoastooffermolecularbasisofidentificationGansu-
producedAngelicawithgeoherbalism.MethodsTheITSgeneofAngelicawasobtainedby
PCRandsequencedtobeanalyzedbyDNAStarsoftwaretocalculatethegeneticdistance
amongdifferentspecimens.ResultsTheITSsequenceofAngelicabetweenMinCountyand
ZhangCountyofGansuProvinceshowstrivialdifferenceswiththerangeof0.0000~0.008
3.All5MinCounty-producedAngelicaspecimenshavesamebasesat586sitewithCand
589sitewithTwithZhangCounty-producedAngelicaDG9specimen,whereasthe586site
and589sitebasesoftheother3ZhangCounty-producedAngelicaspecimensareTandG
respectively.ConclusionTheITSsequencecharacteristicscanberecognizedaseffective
molecularmarkerofAngelica,andboth586sitebaseand589sitebaseoftheITSsequence
ofAngelicacanberecognizedasidentificationbasesofMinCounty-producedAngelica.
Keywords:
Angelica;internaltranscribedspacer;sequenceanalysis;geoherbalism;Gansu
当归为伞形科多年生草本植物当归[Angelicasinensi(Oliv.)Diels]的干燥根。
我国当归
主产于甘肃东南部,以岷县产量多、质量好,其次为云南、四川、陕西、湖北等省,均为栽
培。
甘肃产的当归,个大质优,称秦归或西归,销往全国并大量出口。
药材道地性研究
已经成为中医药科研的重要课题,但由于道地药材与非道地药材在形态和生药上基本一
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致,所以传统方法亦不能满足道地药材的现代研究。
道地药材是一个地域性现象,其产生
除了与栽培方法、生态环境、加工方法有关外,还与物种居群的遗传特异性有关。
在植
物系统与进化研究中,核酸分子量是最基本的进化单位,能反映进化本质;核酸的基本序列
是一元变化的,通常为点突破,趋同效应极小,以核酸分子为指标确定的系统化关系不受主
观因素影响。
所以,近些年分子鉴定技术在中药研究中不断应用,此方法也已成为中药材
道地性研究的重要手段。
ITS序列作为种以下分子鉴定的重要序列,其在中药道地性研
究中也得到了广泛研究。
1材料与方法
1.1药材来源
本试验所用药材均为2005年采自甘肃省岷县及漳县地区农民种植的当归种子,自然干
燥后备用,经甘肃中医学院张西玲教授鉴定。
见表1。
表1甘肃不同产地当归药材(略)
1.2ITS序列扩增
以已经发表于genebank中的当归ITS序列为标准,设计一对引物,引物序列为:
ITS
正,5-TTGTCGAATCCTGCAATAGC;ITS反,5-TCGAAGCGCACAGAGTATG(引物由
上海生物工程技术服务有限公司合成)。
PCR反应采用上海生物工程技术服务有限公司
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提供的即用型PCR扩增试剂盒,反应体系为50L,其中2Master25L,上下游引物各5L,
模板1L,ddH2O,14L。
PCR扩增条件:
94℃预变性1min,94℃变性1min;53℃复性
1min;72℃延伸1min;共35循环,72℃延伸10min,4℃保存。
1.3基因组DNA提取
称取种子100mg用医用纱布包好,置于液氮中10min,取出后用研钵研细,用筛网过滤
后称取细粉50mg,然后按照上海生物工程技术服务有限公司生产的UNIQ-10柱式植物
基因组DNA抽提试剂盒提取,提取的基因组DNA于-20℃保存,备用。
1.4序列测定和分析
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后由上海生物工程技术服务有限公司测序,每个样品
均采用双向测序。
测序结果以已经发表于genebank中的当归ITS序列确定ITS序列的
边界,并进行两端碱基手工修订。
各序列特征采用DNAStar软件进行统计分析;DNA序
列的用DNAMAN软件排序,排序后的序列采用MEGA4[1](molecularevolutionary
geneticsanalysis4)分子进化遗传分析软件,根据Kimura-2参数遗传距离(kimura-2
parametergeneticdistance)法计算各样品间的遗传距离值。
2结果与分析
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关于芫花根质量标准研究
作者:
韩伟,章军,吴立军,李娆娆
【摘要】目的建立芫花根中芫花酯甲的定性鉴别和定量分析方法。
方法采用薄层
色谱法对芫花根中芫花酯甲进行定性鉴别,采用高效液相色谱法测定芫花酯甲的含量。
色谱条件:
KromasilC18色谱柱(4.6mm250mm,5流动相为甲醇-水(85∶15),流速1.0
mL/min;柱温40℃;检测波长为238nm;记录时间40min。
结果芫花根中芫花酯甲的薄
层色谱鉴别特征明显、专属性强;含量测定线性范围为0.047~0.282g(r=0.9996);平均回
收率为99.2%,RSD=2.00%(n=6)。
结论该方法操作简便,结果准确,能够对芫花根中的芫
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花酯甲进行定性鉴别和定量分析,提高了该药材的质量控制水平。
【关键词】芫花根;芫花酯甲;薄层色谱法;高效液相色谱法
Abstract:
ObjectiveTodevelopqualitativeidentificationandquantitativeanalysismethod
ofyuanhuacininrootofDaphnegenkwasieb.etZucc.MethodYuanhuacinwasidentifiedby
TLCanditscontentwasdeterminedbyHPLC.KromasilC18(4.6mm250mm,5m)column
wasused.Themobilephasewasmethanol-water(85∶15)ataflowrateof1.0mL/min.The
columntemperaturewas40℃.Thedetectionwavelengthofyuanhuacinweresetat238nm.
Therecordtimewas40min.ResultsThelinearrangeofyuanhuacinwas0.047~0.282g
(r=0.9996).Theaveragerecoverywas99.2%withRSD=2.0%(n=6).ConclusionThese
analyticalmethodsweresimpleandaccurate,andcanbeusedforthequalitativeidentification
andquantitativeanalysisofyuanhuacin.ItissuitableforqualitycontrolofrootofDaphne
genkwaSieb.etZucc.
Keywords:
DaphnegenkwaSieb.etZucc;yuanhuacin;TLC;HPLC
芫花根为瑞香科植物芫花DaphnegenkwaSieb.etZucc.的干燥根,广泛分布于我国长江
流域各省和黄河流域的部分地区。
本品味辛、苦,性温,有毒;具有逐水、解毒、散结等功
效;用于治疗水肿、乳痈等。
本品主要含二萜类、黄酮类和香豆素类成分[1];芫花酯甲为
主要的二萜类成分,具有利水作用,能直接兴奋子宫平滑肌,为引产药的有效成分,还能抑
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制P388癌细胞核酸和蛋白质的合成,有抗白血病作用。
该成分具有强烈的刺激性,对皮
肤、黏膜系统有较大的毒害作用,是芫花根利水、抗生育作用的有效成分,也是毒性成
分。
本试验对芫花根中芫花酯甲进行定性定量研究,以期为提高芫花根的质量控制水平
提供试验数据。
1仪器与试药
薄层成像系统TRANSILLVMINATOR2020D型(冷泉港科技有
限公司);MerckTLC薄层板(德国Merck公司);Waters高效液相色谱仪(600
Pump;Waters600Controller;Waters2487DualAbsorbanceDetector);Millennium32色谱管
理软件;CX-250超声波清洗器(北京医疗设备二厂,功率250W,频率40kHz)。
芫花酯甲对照品为自制,经1HNMR和13CNMR鉴定结构,HPLC检测其纯度,面积归
一化法计算对照品的含量在98%以上,符合对照品纯度要求。
甲醇为色谱纯,水为自制高
纯水。
其余试剂均为分析纯。
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2.1ITS长度与GC质量分
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数比较
本实验测得的9样品ITS(包括5.8s)序列中7样品为600bp,2样品为601bp。
所有样
品5.8srDNA高度一致,无碱基差异。
ITS一区有3个变异位点,ITS二区有3个变异位
点。
各样品ITS序列(包括5.8s)G+C含量范围在54.1%~54.6%之间。
2.2基于ITS分析各样品间的遗传距离
(见表2)表2各样品间的遗传距离(略)
3讨论
道地药材的形成是特定的基因型,在特定的生境下受到复杂的调控,导致次生代谢过程
的关键酶基因的表达产生了时空差异的结果,其形态及次生代谢产物的多样性是由基因
的遗传变异引起的[2]。
不少学者在研究道地药材分子机理时,都期望能找到决定道地药
材的表型的关键酶基因,发现道地药材特定的基因型,但尚未取得突破性进展。
ITS序列
作为种以下一级分类群亲缘关系研究的重要基因序列,在中药材道地性研究中也得到了
广泛应用。
研究发现,海拔高的岷县、宕昌所产当归阿魏酸、挥发油含量显著高于漳
县、渭源、定西、陇西当归,岷县当归的阿魏酸、挥发油、水溶性多糖及浸出物含量显
著高于漳县产当归[3]。
我们采集的9号样品来自漳县贵清山,其产地虽属漳县但因来自
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山体,其海拔比漳县其他3样品高,与岷县海拔及生长环境接近。
我们在对岷、漳两县当
归ITS序列研究时发现各样品间的遗传距离极小,在0.0000~0.0083之间,9个样品间的
碱基变异位点只有6个,岷县5个样品与漳县9号样品在586位都为C,589位都为T,而
漳县其他3个样品在这2个位点分别为T和G,这一结果与两地当归成分研究出现了统
一性,因此,我们认为这2个位点碱基可能成为岷当归的碱基鉴别位点,不过其可靠性还
需进一步研究证实。
【参考文献】
[1]TamuraK,DudleyJ,NeiMKumarS.MEGA4:
MolecularEvolutionaryGenetics
Analysis(MEGA)softwareversion4.0[J].MolecularBiologyandEvolution,2007,24:
1596-
1599.
[2]黄璐琦.分子生药学[M].北京:
北京大学医学出版社,2006.115-116.
[3]欧阳晓玫,何英梅,朱俊儒,等.不同商品规格的甘肃当归的综合质量评价[J].中医药
学报,2005,33(4):
12-14
医药卫生栏目
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