甘肃荒漠地区野生白刺的组织培养.docx
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甘肃荒漠地区野生白刺的组织培养
甘肃荒漠地区野生白刺的组织培养
摘要:
以荒漠野生白刺作为试验材料,研究不同消毒方式对白刺茎段无菌外植体建立的影响及不同激素、不同浓度组合对野生白刺试管苗增殖和生根的影响。
结果表明:
选取室内种子萌发的实生苗茎段为外植体,用10%NaClO消毒15~18min可以获得理想的成活率;适宜的增殖培养基是MS+0.2mg/L6-BA+0.5mg/LIBA或MS+0.5mg/LIBA;比较适宜的生根培养基是1/2MS+0.5mg/LIBA。
不添加激素的简化培养基MS0对白刺也有较为理想的增殖和生根效果。
关键词:
甘肃;荒漠地区;野生白刺;增殖;生根;组织培养
中图分类号:
S580.4文献标志码:
A文章编号:
1002-1302(2015)09-0080-03
收稿日期:
2014-09-12
基金项目:
国家农村领域科技计划(编号:
2012BAD16B0303)。
作者简介:
张艳萍(1978―),女,甘肃武威人,助理研究员,主要从事分子生物学、病毒检测以及中药材组培研究。
E-mail:
64929217@。
通信作者:
董治宝。
E-mail:
zbdong@。
当前,全球盐碱地面积已达9.5亿hm2[1],其中我国盐碱土地资源约为0.99亿hm2,其中现代盐碱土面积为0.37亿hm2,残余盐碱土约0.45亿hm2,并且尚存在有约0.173亿hm2的潜在盐碱土[2]。
大面积盐碱地、荒漠地的开发利用对环境的改善具有重要的现实意义。
白刺(NitrariaL.),灌木,蒺藜科,全世界有12个种,我国有8个种,甘肃有5种[3],其根系发达,具有很强的防风固沙、抗旱、抗盐碱、耐热、耐土壤瘠薄和耐沙埋能力,可明显改良土壤物理性状,提高土壤肥力[4]。
此外,白刺根寄生的锁阳(CynomoriumsongaricumRupr)为传统名贵的温补药材[5],白刺果含多种营养成分和丰富的微量元素,具有极高的营养和药用价值[6]。
近年来,从野生植物资源中寻找新的、潜在的药食同源植物,已成为国内外学者研究的热点,而沙生植物白刺则是经过长期的自然筛选而保留下来的优胜者之一,白刺因其顽强的生命力和优良的遗传基因而受到沙区人们的喜爱[7]。
然而据调查,白刺种间杂交混乱,分化严重[8],同时随着自然环境的严重恶化和人为的大幅度破坏,白刺出现了不同程度的退化,大面积死亡或生长不良,结实率下降或不结实,使得这一特殊野生资源的种群繁衍面临着严重的威胁[9]。
因此,为可持续利用这一野生资源,保持其优良性状的稳定性,采用离体繁育技术就成为重要途径之一。
目前,较多学者对白刺进行过多方面的研究[10-14],其中关于白刺组培再生方面的研究已有不少[15-18],发现不同品种的白刺分化增殖所需的激素种类差异很大。
西伯利亚白刺和唐古特白刺需要6-BA和IBA的浓度与配比存在很大差异[16,19],添加一定量的IAA和GA更有利于天津野生白刺的增殖。
可见,不同区域品种的基因型不同,所需激素不同,这是组培研究工作中普遍存在的问题[20-21]。
本试验以甘肃荒漠野生白刺为材料,对其组培快繁进行研究,以期建立一套甘肃地区野生白刺较为简易的组培方法,为白刺的离体繁育提供参考。
1材料与方法
1.1试验材料
试验材料为荒漠野生白刺,采自甘肃省酒泉市巴丹吉林沙漠边缘,地理坐标为39°44′N、98°31′E,海拔1000~1500m。
于2012年7月和2013年4月先后2次采样,第1次于2012年7月下旬采摘的带果实枝条,冰盒内带回实验室,剪取顶端幼嫩枝条备用,同时采摘果实收集种子备用;第2次于2013年4月下旬,剪取当年旺盛新枝,冰盒内带回实验室备用。
2次采样均为同株野生白刺枝条。
实生苗获得:
2013年2月,将收集的野生白刺种子种于温室花盆内,即可获得实生苗。
1.2试验方法
1.2.1取材和消毒处理取7月和4月野外白刺单株茎段,流动自来水冲洗30min,放于超净工作台,用75%乙醇消毒30s,0.1%氯化汞处理4、6、8、10min;取4月野外采集的茎段和种子发芽得到实生苗的茎段,流动自来水冲洗30min,放于超净工作台,用75%乙醇消毒30s,10%次氯酸钠处理7、10、12、15、18min。
消毒剂处理完之后,用无菌水冲洗4~5次,接于MS培养基上,在温度(25±2)℃、光照强度2000lx、光照周期16h/d下培养1周,统计消毒率和无菌苗成活率。
1.2.2增殖培养基筛选取启动培养获得的无菌苗茎段,接种于添加不同激素浓度配比的MS培养基中,激素浓度水平和组合见表1。
以简化MS培养基为对照,简化培养基以自来水配置,市售白糖代替蔗糖,简写为MS0。
60d后调查增殖系数。
1.2.3生根诱导将切取的单芽茎段,接种于添加不同浓度IBA和IAA的1/2MS培养基中,进行生根诱导,浓度水平和组合见表2,以简化培养基MS0作对照。
记录生根时间,40d
1.3数据处理
数据用Excel2003进行整理,用DPS7.0进行数据分析。
2结果与分析
2.1不同取材与消毒方法对启动培养的影响
7月和4月在荒漠取的枝条,采用第1种消毒方案,随着消毒时间的增加消毒率呈逐渐上升趋势,成活率呈先微升后降趋势(表3)。
2个时期采摘的枝条活性均较弱(表3),消毒时间在8~10min时,外植体基本褐化死亡,消毒时间在4~6min时,消毒不彻底,外植体污染严重。
0.1%氯化汞处理10min时,消毒率最高,7月下旬和4月上旬采取的枝条,消毒率分别高达91.67%和96.67%,可相对应的成活率却都为0;消毒6min时,2个时期的枝条成活率达到了各自的最高值,分别仅为5%和8.33%,相对应的消毒率分别为1833%和21.67%。
4月采摘的荒漠枝条和种子发芽所得的实生苗采用10%次氯酸钠进行消毒,随着消毒时间的增加,消毒率和成活率都呈逐渐上升趋势(表3)。
种子发芽实生苗茎段灭菌效果和成活率远高于野外茎段,消毒18min种子萌芽实生苗茎段的消毒率和成活率最高,分别达到96.67%和76.67%,而4月野外茎段虽然也达到最高,但仅有8.33%的消毒率和5%的成活率。
从试管苗生长状态看,种子萌发实生苗选取茎段灭菌获得的试管苗比荒漠枝条萌动快,生长的状态健康。
表3不同取材与消毒方案的结果
消毒剂消毒时间
(min)消毒率(%)成活率(%)外植体状态7月4月实生苗7月4月实生苗7月枝条4月枝条实生苗0.1%HgCl240.001.670.001.67有生长迹象有生长迹象,缓慢有生长迹象,缓慢618.3321.675.008.33慢慢黄化,不生长慢慢黄化,不生长853.3353.333.331.67部分逐渐褐化、死亡部分逐渐褐化、死亡1091.6796.670.000.00快速褐化、死亡快速褐化、死亡10%NaClO70.000.000.000.00消毒不彻底消毒不彻底100.0020.000.0010消毒不彻底带有茎尖的拔节长高120.0050.000.0033.33消毒不彻底带有茎尖的拔节长高156.6788.333.3370.00保持绿色,腋芽萌动带有茎尖的拔节长高188.3396.675.0076.67保持绿色,腋芽萌动带有茎尖的拔节长高
2.2不同激素配比对白刺增殖的影响
从表4可以看出,6号培养基(MS+6-BA0.2mg/L+IBA0.5mg/L)增殖系数最高,达4.08;其次是MS+IBA0.5mg/L的11号培养基,增殖系数达3.94,二者差异不显著;简化培养基MS0的增殖系数达2.36,显著低于6号和11号培养基,却显著高于其他激素组合。
其余激素组合的增殖系数在105~1.45之间,增殖率均较低。
从试管苗生长状态看,6号、11号和12号这3种培养基中茎段芽苗的增殖生长状态是健康的。
2.3不同激素对白刺生根的影响
不同激素对白刺苗的生根效果见表5。
加入激素0.25、0.5mg/LIBA的1号、2号培养基生根率相对较高,分别达到9167%和96.67%,二者差异不显著,但显著高于加入0.25、0.5mg/LIAA的3号、4号培养基和简化培养基对白刺茎段的生根率。
生根时间来看,加入0.5mg/LIBA的2号培养基生根仅需10~12d,1号、3号、4号培养基多在18~25d生根。
从生根数来看,茎段在加有激素的培养基上基本都是基部微膨大处长出1条粗根,只有在简化培养基MS0中培养的茎段是从基部直接长出2~3条又细又长的根。
表4不同激素对白刺增殖的影响
培养基增殖系数增殖状态11.45c偶丛生,生长慢,叶绿21.20efg偶丛生,生长慢,叶微黄31.05g少丛生,叶小,发黄41.26def偶丛生,叶小,发黄51.42cd偶丛生,有生长,叶绿64.08a丛生,拔节生长快,茎壮,叶绿71.33cde偶丛生,生长慢,叶黄白81.07g少丛生,生长慢,叶黄白91.16fg偶丛生,生长慢,叶黄白101.19efg偶丛生,生长慢,叶黄白113.94a生根,拔节生长快,茎壮,叶绿122.36b生根,拔节生长,茎细,叶绿注:
同列数据后不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。
3结论与讨论
无菌外植体的获得是组织培养的关键一步,其生长状态直接影响到后续工作的开展。
由于试验中采用的枝条来源于表5不同激素对白刺生根影响的结果
培养基生根时间
荒漠自然环境中,其表面和内生菌多而复杂,使得无菌外植体的获得比较困难。
本试验结果表明,0.1%HgCl2作为消毒剂,对复杂的菌群有很好的抑制作用,但同时也对外植体自身极易造成伤害,使得外植体褐化死亡,所以不是白刺野外茎段灭菌理想的消毒剂。
10%NaClO作为消毒剂,因其性质温和,对处理的外植体没有致死现象;也正是这个原因,其对于外界环境采摘的外植体灭菌效果不理想,但对于室内种子萌发获得的幼嫩实生苗茎段,灭菌处理15min以上,就能达到理想效果,外界采摘的枝条比新生实生苗茎段木质化程度高,萌芽所需时间也长,生长相对较弱。
因此本试验以种子室内发芽所得实生苗茎段为外植体,采用10%NaClO消毒15~18min灭菌效率最佳。
从增殖诱导的结果看,在加有激素0.2mg/L6-BA+05mg/LIBA和0.5mg/LIBA的培养基增殖效果较好,简化MS0培养基也有较好的增殖效果。
这一结论与何正伦等结果[19,22]不同,可能与所采用的外植体来源不同有关,虽然都是茎段,但是取自于室内种子萌发实生苗的茎段较外界生长的枝条茎段幼嫩,分生能力强,在MS0培养基上能够直接生根,再以拔节长高的方式生长,成为一种可取的简化增殖方式。
而且由于简化MS0培养基采取的是自来水代替蒸馏水配制的培养基,市售白糖代替试验用蔗糖等措施,使得成本降低,同时培养基配制的操作上也有所简化,这对规模化生产具有十分积极的意义。
从生根诱导的处理结果看,在1/2MS+0.5mg/LIBA培养基中生根效果最好,不但生根快,而且根粗壮,这与孙雪新等的结果[13]相同。
在本试验中,简化MS0培养基中也能够直接生根,只是带顶芽的茎段生根更容易。
本试验认为比较适宜的消毒方案是10%NaClO对室内种子萌发获得的实生苗茎段消毒15~18min;比较适宜的增殖培养基是MS+0.2mg/L6-BA+0.5mg/LIBA或MS+05mg/LIBA;比较适宜的生根培养基是1/2MS+0.5mg/LIBA。
在本试验中,白刺的茎段在简易培养基MS0中也能健康增殖生长,这使得组培中不同品种所需激素种类不同的这一局限性有所缓和,这也为今后对不同品种的白刺进行初步再生体系的建立提供参考。
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