新教材高中生物二轮精品 专题12 如何选择限制酶专题.docx
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新教材高中生物二轮精品专题12如何选择限制酶专题
专题12如何选择限制酶专题练习
1.(2021福建卷.21)微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。
金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白,具有吸附重金属的作用。
科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。
回答下列问题:
(1)根据枣树的MTcDNA的核苷酸序列设计了相应的引物(图1甲),通过PCR扩增MT基因。
已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。
选用的引物组合应为___________。
(2)本实验中,PCR所用的DNA聚合酶扩增出的MT基因的末端为平末端。
由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点,需借助中间载体P将MT基因接入载体E。
载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图1乙所示。
①选用___________酶将载体P切开,再用___________(填“T4DNA或“E·coliDNA”)连接酶将MT基因与载体P相连,构成重组载体P′。
②载体P′不具有表达MT基因的___________和___________。
选用___________酶组合对载体P′和载体E进行酶切,将切下的MT基因和载体E用DNA连接酶进行连接,将得到的混合物导入到用___________离子处理的大肠杆菌,筛出MT工程菌。
(3)MT基因在工程菌的表达量如图2所示。
结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌,理由是___________。
【答案】
(1)引物1和引物4
(2)①EcoRVT4DNA
②启动子终止子XhoI和PstI钙
(3)尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定
【分析】PCR技术是模拟体内DNA的天然复制过程,在体外扩增DNA分子的一种分子生物学技术。
PCR扩增目的基因需要有一段已知的碱基序列,以此为模板合成引物。
在待扩增的DNA片段与其两侧互补的两个寡核苷酸引物,经变性、退火和延伸若干个循环后,DNA扩增2ⁿ倍。
为了获得大量的目的基因可以采用PCR技术。
基因中的启动子和终止子分别控制转录的开始和终止,mRNA上的起始密码子和终止密码子分别控制翻译的开始和结束。
将目的基因导入植物常用的方法是农杆菌转化发,将目的基因导入动物常用的方法是显微注射法,将目的基因导入微生物(如大肠杆菌)的方法是钙离子处理法。
(1)密码子位于mRNA上,是决定氨基酸的三个相邻碱基,起始密码子分别控制翻译的开始和结束,故为保证基因的正常表达,一对引物应分别位于位点A和位点B的两侧,故选择引物1和引物4。
(2)①依据题意可知,MT基因的末端为平末端,如图1乙所示限制酶中,只有用EcoRV酶切才能得到平末端,所以可用EcoRV酶将载体P切开;由于E·coliDNA连接酶只能连接黏性末端,而T4DNA连接酶可以连接平末端,故需要用T4DNA连接酶将MT基因与载体P相连,构成重组载体P′。
②载体P′是重组质粒,故不含有表达MT基因的启动子和终止子;为避免自身环化和反向连接,可选用两种酶切割两种载体,据图可知,载体P′和载体E都含有XhoI和PstI酶,故可选用XhoI和PstI酶进行酶切;将目的基因导入大肠杆菌的方法是钙离子处理法。
(3)由于尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定,故即使MT工程菌的MT蛋白相对含量较高,也无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌。
2.(2021辽宁卷.24)PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。
为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因,研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列(简称phb2基因),大小为0.9kb(1kb=1000碱基对),利用大肠杆菌表达该蛋白。
回答下列问题:
(1)为获取phb2基因,提取该动物肝脏组织的总RNA,再经__________过程得到cDNA,将其作为PCR反应的模板,并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
(2)图1为所用载体图谱示意图,图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。
为使phb2基因(该基因序列不含图1中限制酶的识别序列)与载体正确连接,在扩增的phb2基因两端分别引入__________和__________两种不同限制酶的识别序列。
经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时,可选用__________(填“E.coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”)。
相关限制酶的识别序列及切割位点
(3)转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞,使其处于__________的生理状态,以提高转化效率。
(4)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养,随机挑取菌落(分别编号为1、2、3、4)培养并提取质粒,用
(2)中选用的两种限制酶进行酶切,酶切产物经电泳分离,结果如图2,________号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。
注:
M为指示分子大小的标准参照物;小于0.2kb的DNA分子条带未出现在图中
(5)将纯化得到的PHB2蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中,培养24小时后,检测处于细胞周期(示意图见图3)不同时期的细胞数量,统计结果如图4。
分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是将细胞阻滞在细胞周期的__________(填“G1”或“S”或“G2/M”)期。
【答案】
(1)逆转录
(2)①EcoRI②PvitⅡ③T4DNA连接酶
(3)感受态
(4)3
(5)G2/M
【分析】分析图中质粒含有多个限制酶切位点,在启动子和终止子之间有三个酶切位点,KpnI在质粒上有两个酶切位点,位于终止子之间,PvitⅡ酶切后获得平末端,EcoRI酶切后获得黏性末端。
BamHI酶切后会破坏标记基因氨苄青霉素抗性基因,HindⅢ和PstI酶切后分别会破坏启动子和终止子。
图4中G1期和S期细胞减少,而G2期细胞数目明显增多。
将目的基因导入微生物细胞的方法是Ca2+处理法。
(1)利用RNA获得cDNA的过程称为逆转录或反转录。
(2)根据启动子和终止子的作用是控制转录的开始和结束,目的基因应导入启动子和终止子之间.图中看出,两者之间存在于三种限制酶切点,但是由于KpnI在质粒上不止一个酶切位点,而且位于终止子之间,所以应该选择EcoRI和PvitⅡ两种不同限制酶的识别序列;根据PvitⅡ的酶切序列,切出了平末端,EcoRI酶切后获得黏性末端,T4DNA连接酶可以连接平末端和黏性末端,所以构建基因表达载体时,应该用T4DNA连接酶连接质粒和目的基因。
(3)转化时用CaCl2处理大肠杆菌细胞,使其处于感受态的生理状态,以提高转化效率。
(4)从题干信息可知,这些菌落都可以生长在含有氨苄青霉素的培养基中,都含有质粒,但是重组质粒包含了目的基因和质粒,如果用EcoRI和PvitⅡ两种酶切割重组质粒电泳后,将获得含有质粒和目的基因两条条带,由于phb2基因大小为0.9kb,所以对应电泳图是菌落3。
(5)比较图4中G1期和S期细胞减少,而G2期细胞数目明显增多,说明了G1期和S期细胞可以进入G2期,而G2期的细胞没有能够完成分裂进入M期,因此PHB2蛋白应该作用于G2/M期。
3.(2021全国乙卷·38)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人类需要的生物产品。
在此过程中需要使用多种工具酶,其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。
回答下列问题:
(1)常用的DNA连接酶有E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。
上图中__________酶切割后的DNA片段可以用E.coliDNA连接酶连接。
上图中___________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是____________。
(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征,如质粒DNA分子上有复制原点,可以保证质粒在受体细胞中能___________;质粒DNA分子上有______________,便于外源DNA插入;质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因),利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞,方法是______________。
(4)表达载体含有启动子,启动子是指__________________。
【答案】
(1)EcoRI、PstIEcoRI、PstI、SmaI和EcoRV
(2)磷酸二酯键
(3)自我复制一至多个限制酶切位点
用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞,能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞
(4)位于基因首端的一段特殊DNA序列,是RNA聚合酶识别及结合的部位,能驱动转录过程
【详解】
(1)限制酶EcoRI和PstI切割形成的是黏性末端,限制酶SmaI和EcoRV切割形成的是平末端,E.coliDNA连接酶来源于大肠杆菌,只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来,而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体,可用于连接黏性末端和平末端。
因此可以用E.coliDNA连接酶连接图中EcoRI和PstI酶切割后的DNA片段黏性末端,可以用T4DNA连接酶连接4种限制酶切割的DNA片段末端。
(2)DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。
(3)质粒是小型环状的DNA分子,常作为基因表达的载体,首先质粒上含有复制原点,能保证质粒在受体细胞中自我复制。
质粒DNA分子上有一个至多个限制性核酸内切酶的酶切位点,便于目的基因的导入。
质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因,具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞,能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。
(4)启动子是一段特殊结构的DNA片段,位于基因的首端,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA,最终获得需要的蛋白质。
4.图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列,图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。
现有MspI、BamHI、MboI、SmaI4种限制性核酸内切酶切割的碱基序列和酶切位点分别为
C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。
请回答下列问题:
(1)若用限制酶SmaI完全切割图1中DNA片段,其产物长度为____________________。
(2)若图1中虚线方框内的碱基对被T-A碱基对替换,那么基因D就突变为基因d。
从隐性纯合子分离出图1及其对应的DNA片段,用限制酶SmaI完全切割,产物中共有____种不同DNA片段。
为了提高实验成功率,需要通过______________技术扩增目的基因,以获得大量的目的基因。
(3)若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行,形成重组质粒,那么应选用的限制酶是______________。
在导入重组质粒后,为了筛选出含质粒的大肠杆菌,一般先用添加_________的培养基
进行培养,然后将生长的菌接种到只含____________的培养基中培养,可进一步筛选出含重组质粒的受体细胞。
(4)假设用BamHI切割DNA获取目的基因,用MboI切割质粒,然后形成重组质粒,若将插入在抗生素B抗性基因处的目的基因重新切割下来,能否用BamHI?
___________。
为什么?
______________________。
【答案】
(1)537bp790bp661bp
(2)2PCR
(3)BamHI抗生素B抗生素A
(4)不一定因为目的基因和抗生素B抗性基因连接处不一定出现GGATCC序列
【详解】
(1)SmaI限制性核酸内切酶识别的碱基序列和酶切位点为CCC↓GGG,因此若用限制酶SmaI完全切割图1中DNA片段,其产物长度为534+3、796-3、658+3。
(2)若图1中虚线方框内的碱基对被T-A碱基对替换,那么基因D就突变为基因d。
基因d对应的DNA片段上只有一个SmaI限制酶切位点,用限制酶SmaI完全切割后,产物中共有534+796-3和658+3两种不同DNA片段。
PCR技术是模拟体内DNA的天然复制过程,在体外扩增DNA分子的一种分子生物学技术,在待扩增的DNA片段与其两侧互补的两个寡核苷酸引物,经变性、退火和延伸若干个循环后,DNA扩增2ⁿ倍。
为了获得大量的目的基因可以采用PCR技术。
(3)限制酶MspI和SmaI识别的序列位于基因D内部,而MboI识别的序列位于质粒的两个标记基因抗性基因内部,均不能选择。
目的基因两侧有限制酶BamHI识别的序列G↓GATCC,虽然会破坏抗生素A抗性基因,但是不会破坏抗生素B抗性基因,仍然有一个标记基因起作用。
因此,应选用的限制酶是BamHI。
在导入重组质粒后,为了筛选出含质粒的大肠杆菌,一般先用添加抗生素B的培养基进行培养,能生存下来的是含普通质粒的大肠杆菌和含重组质粒的大肠杆菌,然后将生长的菌接种到含抗生素A的培养基中培养,能生存下来的是含普通质粒的大肠杆菌,不能生存的是含重组质粒的大肠杆菌。
能在添加抗生素B的培养基生存、不能在添加抗生素A的培养基生存的菌落即为含重组质粒的大肠杆菌,从而筛选出含重组质粒的受体细胞。
(4)用BamHI切割DNA获取目的基因,产生黏性末端--GATC,用MboI切割质粒,也产生黏性末端--GATC,虽然可以形成重组质粒,但是质粒抗生素B抗性基因中GATC序列两端不一定为C或G,连接处不一定出现GGATCC序列,用BamHI不一定能识别。
5.(2018全国Ⅱ·38)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光,这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。
某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端,获得了L1GFP融合基因(简称为甲),并将其插入质粒P0,构建了真核表达载体P1,其部分结构和酶切位点的示意图如下,图中E1~E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
回答下列问题:
(1)据图推断,该团队在将甲插入质粒P0时,使用了两种限制酶,这两种酶是_______________。
使用这两种酶进行酶切是为了保证______________,也是为了保证______________________。
(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后,若在该细胞中观察到了绿色荧光,则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了________和________过程。
(3)为了获得含有甲的牛,该团队需要做的工作包括:
将能够产生绿色荧光细胞的____________移入牛的_______________中、体外培养、胚胎移植等。
(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中,某同学用PCR方法进行鉴定,在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的________(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。
【答案】
(1)E1和E4 甲的完整性 甲与载体正确连接
(2)转录 翻译
(3)细胞核 去核卵母细胞
(4)核DNA
【详解】
(1)由题意可知,L1基因和GFP基因合成了L1GFP融合基因(简称为甲),题图中显示了四个酶切位点,当将L1GFP融合基因插入质粒P0时,可用E1和E4限制酶进行酶切,用这两种酶进行酶切不会破坏甲的完整性,若用E2或E3,目的基因会不完整。
要保证目的基因在受体细胞中能正确表达,目的基因首端应有启动子,尾端有终止子,用E1和E4限制酶进行酶切能保证甲按照正确的方向与载体连接。
(2)若在牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光,则说明L1GFP融合基因得到表达,即目的基因在受体细胞中通过转录和翻译合成了荧光蛋白。
(3)为了获得含有甲的牛,必须要用核移植和胚胎移植技术,可将含有目的基因的细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中,然后进行体外培养、胚胎移植等。
(4)克隆牛通过核移植获得,甲是否存在于的不同组织细胞中,应以核DNA作为PCR扩增的模板,利用PCR技术扩增目的基因,可以检测目的基因是否存在。
6.大肠杆菌的质粒上含有lacZ基因,其编码的产物β半乳糖苷酶在X-gal和IPTG同时存在时,可以产生蓝色沉淀,使菌落呈现蓝色,否则菌落呈现白色。
如图为利用该质粒进行的转基因过程,请据图回答下列相关问题:
(1)图中切割目的基因时用到________种限制酶,而切割质粒时用到的限制酶是______________。
(2)在基因工程的“四步曲”中,______________________是基因工程的核心步骤,____________________阶段没有碱基互补配对现象。
(3)图中的受体细胞是______________,其作为受体细胞的优点是____________________(至少答出两点)。
(4)在培养基中加入X-gal和IPTG的目的是________________________;结合题干信息,菌落①②③的颜色分别是______________、______________、_______________。
【答案】
(1)2 EcoRⅠ
(2)基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞
(3)大肠杆菌 繁殖快、遗传物质相对较少、易培养等
(4)筛选导入了重组质粒的大肠杆菌蓝色 蓝色 白色
【详解】
(1)由图可知,处理目的基因时用到了EcoRⅠ和SmaⅠ两种限制酶,而切割质粒时用到的限制酶是EcoRⅠ。
(2)在基因工程的“四步曲”是:
目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定,其中基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤,将目的基因导入受体细胞阶段没有碱基互补配对现象。
(3)由图可知,受体细胞是大肠杆菌,其作为受体细胞的优点是繁殖快、遗传物质相对较少、易培养等。
(4)根据题干信息可知,加入X-gal和IPTG的培养基属于选择培养基,因此加入X-gal和IPTG的目的就是将导入了重组质粒的大肠杆菌筛选出来;在同时具有X-gal和IPTG的培养基中,如果大肠杆菌中导入了完整的lacZ基因,则该基因就可以控制合成β半乳糖苷酶,菌落就呈现蓝色,否则菌落呈现白色,因此,质粒自身环化后均具有完整的lacZ基因,导入目的基因的质粒中lacZ基因不完整,因此菌落①和②均呈现蓝色,而菌落③呈现白色。
7.科学家从某细菌中提取抗盐基因,转入烟草并培育成转基因抗盐烟草。
下图是转基因抗盐烟草的培育过程,含目的基因的DNA和质粒上的实线箭头表示相关限制酶的酶切位点,虚线箭头表示转录的方向。
请分析回答下列问题:
(1)在该过程中,研究人员首先获取了抗盐基因(目的基因),并采用________技术对目的基因进行扩增,该技术需要的条件是__________、酶、原料、模板,该技术必须用的酶是__________;然后构建基因表达载体,基因表达载体中除了具有目的基因、启动子和终止子之外,还需具有_______________________。
(2)用图中的质粒和目的基因构建重组质粒,不能使用SmaⅠ酶切割,原因是_______________________。
图中①②过程为防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化,应选用__________________酶对外源DNA、质粒进行切割。
(3)为确定转基因烟草是否培育成功,可用放射性同位素标记的__________作为探针进行分子杂交检测,还需要在个体水平上鉴定,后者具体过程是__________________________________
_______________________________________________________________________________。
【答案】
(1)PCR(或多聚酶链式反应) 引物 耐热的DNA聚合酶(或热稳定性的DNA聚合酶或Taq酶) 标记基因
(2)SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因 BamHⅠ和HindⅢ
(3)抗盐基因(或目的基因) 将培育的烟草幼苗栽培于含有一定盐的土壤中,观察烟草植株的生长状态
【分析】 基因工程技术的基本步骤:
1、目的基因的获取:
方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
2、基因表达载体的构建:
是基因工程的核心步骤,基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
启动子:
是一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的首端,是RNA聚合酶识别和结合的部位,能驱动基因转录出mRNA,最终获得所需的蛋白质;终止子:
也是一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的尾端;标记基因的作用:
是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
3、将目的基因导入受体细胞:
根据受体细胞不同,导入的方法也不一样.将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法;将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法;将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
4、目的基因的检测与鉴定:
(1)分子水平上的检测:
①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因用DNA分子杂交技术;②检测目的基因是否转录出了mRNA用分子杂交技术;③检测目的基因是否翻译成蛋白质用抗原-抗体杂交技术.
(2)个体水平上的鉴定:
抗盐碱鉴定、抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】
(1)在该过程中,研究人员首先获取了抗盐基因(目的基因),并采用PCR(多聚酶链式反应)技术对目的基因进行扩增,该技术需要的条件是引物、酶、原料、模板,该技术必须用耐热的DNA聚合酶或热稳定性的DNA聚合酶(Taq酶);然后构建基因表达载体,基因表达载体中除了具有目的基因、启动子和终止子之外,还需具有标记基因。
(2)从图中信息可知,SmaⅠ酶的切割位点位于目的基因和M抗生素抗性基因上。
分析抗盐基因的DNA片段,可知该DNA含四种限制酶切点,其中SmaⅠ位于目的基因上,不宜采用。
EcoRⅠ位于目的基因两侧,若用EcoRⅠ切割,则目的基因会自身环化。
BamHⅠ与HindⅢ位于目的基因两端,且质粒中也有相应的适合的切割位点,因此用BamHⅠ和HindⅢ才能完整地切下该抗盐基因,而且目的基因的两端黏性末端不同,同时保证目的基因与质粒连接方式的唯一性,防止自身环化。
若用EcoRⅠ与HindⅢ切割,目的基因的转录的方向与质粒的转录的方向不一致,影响目的基因表达。
(3)为确定转基因抗盐烟草是否培育成功,既要用放射性同位素标记的抗盐基因(或目的基因)作为探针进行分子杂交检测,又要在个体水平上鉴定,后者具体过程是将培育的烟草幼苗栽培于含有一定盐的土壤中,观察该烟草植株的生长状态。
8.(2020江苏高考·33)如果已知一小段DNA的序列,可采用PCR的方法,简捷地分析出已知序列两侧的序列,具体流程如下图(以EcoRⅠ酶切为例):
请据图回答问题:
(1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种 酶,它通过识别特定的 切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3'-羟基与5'-磷酸间形成 ;PCR循环中,升温到95℃是为了获得 ;TaqDNA聚合酶的作用是催化 。
(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物,步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是 (从引物①②③④中选择,填编号)。
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知序列
PCR引物
①5'-AACTATGCGCTCATGA-3'
②5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3'
③5'-AGAGGCTACGCATTGC-3'
④5'-TCATGAGCGCATAGTT-3'
(4)对PCR产物测序,经分析得到了片段F的完整序列。
下列DNA单链序列中(虚线处省
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