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邻位连接技术
邻位连接技术(总12页)
ProximityLigationAssay
proximityligationassay(邻位连接技术,PLA):
一种高灵敏度的蛋白质检测技术。
邻位连接技术(proximityligationassay,PLA)被建立。
该技术采用核酸适体(aptamer)或单/多克隆抗体-核酸复合物作为邻位连接探针(proximityprobes)。
当一对邻位探针同时识别同一个目标蛋白分子时,它们将在空间位置上相互临近,通过连接反应形成一段可扩增的DNA标签序列,该标签序列能够反映待测蛋白的种类及浓度。
该技术将对蛋白质的检测转变为对DNA核酸序列的检测,实现了特殊蛋白质的检测,定量及定位。
美国俄亥俄州立大学的研究人员近日开发出一种新技术,能同时观察细胞中的基因数量和蛋白表达。
此技术能够详细分析基因状态以及相应蛋白表达之间的关联,并更透彻地了解癌症及其他复杂疾病。
该成果发表在《神经肿瘤》(Neuro-Oncology)上。
这种新技术称为荧光原位基因蛋白分析(fluorescentinsitugeneproteinassay)。
它将传统的荧光原位杂交(FISH)与原位邻位连接分析(insituproximityligationassay,简称PLA)相结合。
PLA分析采用核酸适体(aptamer)或单/多克隆抗体-核酸复合物作为邻位连接探针。
当一对邻位探针同时识别同一个目标蛋白分子时,它们将在空间位置上相互临近,通过连接反应形成一段可扩增的DNA标签序列,该标签序列能够反映待测蛋白的种类及浓度。
文章的作者之一,俄亥俄州立大学的ArnabChakravarti博士表示:
“据我所知,这是目前第一个技术,能让我们了解同一细胞中的基因活性和相应蛋白表达。
了解肿瘤中的基因和蛋白表达变化,有助于我们了解是什么驱动了肿瘤行为。
”
文章的通讯作者,亚拉巴马大学副教授MarkusBredel及其同事首先分析了固定的人胶质母细胞瘤细胞,然后分析了石蜡包埋的人胶质母细胞瘤组织。
在这两个分析中,他们都发现了一种表皮生长因子受体基因的突变形式(EGFRvIII)的过表达,并在胶质母细胞瘤中发现了截短蛋白。
他们认为,这种方法有潜力详细分析细胞和组织中癌基因状态及相应蛋白表达之间的关联。
他们表明,荧光原位基因蛋白分析能够在细胞水平分辨癌基因和蛋白,这对于异质性疾病(如癌症)特别重要。
因表观遗传学和转录后调控的作用,这种方法对癌症研究很有用。
它将基因和蛋白信息相关联,能提高生物标志物筛选的可靠性。
它还能辅助治疗决策,因为有时只筛选基因或蛋白产生了不确定的结果。
更多阅读
《神经肿瘤》发表论文摘要(英文)
Gene–proteincorrelationinsinglecells
JaclynJ.Renfrow,AdrienneC.Scheck,NeilS.Dhawan,PaulJ.Lukac,HannesVogel,JamesP.Chandler,JeffreyJ.Raizer,GriffithR.Harsh,ArnabChakravartiandMarkusBredel⇓
Abstract
Wepresentanovelmethodologycombiningtraditionalfluorescentinsituhybridizationwithaninsituproteindetectiontechnologycalledproximityligationassay.Thismethodhaspotentialtoperformadetailedanalysisoftherelationshipbetweengenestatusandcorrespondingproteinexpressionincellsandtissues.Wedemonstratethatthefluorescentinsitugeneproteinassaymethodologyiscapableofresolvinggeneandproteinpatternssimultaneouslyonacell-by-cellbasis.
抗体滴度
抗体滴度定义
用来衡量某种抗体(antibody)识别特定抗原决定部位(epitope)所需要的最低浓度(也即最大稀释度)。
一般表示为:
仍能产生阳性结果的最大稀释度。
通常通过ELISA方法来检测抗原滴度。
打个比方,通过间接库姆伯斯试验(indirectCoombstest)检测一个孕妇血清中anti-Rh抗体。
一个患者可能报告通过此试验检出的抗体滴度为16,这表示只要血清的稀释度不超过1/16(1份比例的血清和15份比例的稀释液),此试验都能得到阳性结果,即可识别出抗原。
如果稀释度超过1/16,则检出的结果皆为阴性,即抗体无法识别抗原。
还有可能发生的情况是,几周过后,同样一位患者可能检测出抗体滴度达到32(1份比例的血清和31份比例的稀释液)。
这可能是因为孕妇体内产生了更多的anti-Rh抗体,以至于即使更高的稀释度也能得到阳性结果。
抗核抗体
抗核抗体(antinuclearantibody,ANA)又称抗核酸抗原抗体,是一组将自身真核细胞的各种成分脱氧核糖核蛋白(DNP)、DNA、可提取的核抗原(ENA)和RNA等作为靶抗原的自身抗体的总称,能与所有动物的细胞核发生反应,主要存在于血清中,也可存在于胸水、关节滑膜液和尿液中。
抗核抗体在多种自身免疫病中均呈不同程度的阳性率,如系统性红斑狼疮(SLE,95%~100%)、类风湿性关节炎(RA,10%~20%)、混合性结缔组织病(MCTD,80%~100%)、干燥综合症(SS,10%~40%)、全身性硬皮病(85%~90%)、狼疮性肝炎(95%~100%)、原发性胆汁性肝硬化(95%~100%)等,但经皮质激素治疗后,阳性率可降低。
抗核抗体在类风湿病人中约有20%~50%IgG型ANA呈阳性,小儿类风湿ANA的阳性率约19%~35%,伴发虹膜睫状体炎者阳性率高(50%~90%),故ANA阳性预示类风湿有发生慢性睫状体炎的可能。
已发现75%类风湿病人有多形核白细胞的特异性ANA或抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)可使白细胞核受到破坏
解释
抗核抗体是一组对细胞核内的DNA,RNA,蛋白或这些物质的分子复合物的自身抗体。
按其核内各个分子的性能不同可将各ANA区分开来,如
(一)抗DNA抗体,
(二)抗组蛋白抗体,(三)抗非组蛋白抗体,(四)抗核仁抗体等。
每一大类又因不同抗原特性而再分为许多种类。
因此ANA在广义上是一组各有不同临床意义的自身抗体,更确切的名称应为抗核抗体谱。
ANA主要存在于IgG,也见于IgM、IgA,甚至LgD及LgE中。
常见的核免疫荧光杭核抗体试验有以下几种图形:
(1)均质型:
核质染色均匀一致,这种染色型常与抗组蛋白和抗DNA抗体有关;
(2)斑点型:
核质染色呈斑点状,抗可提取性核抗原(ENA)抗体常呈这种染色型;(3)周边型:
荧光染色围绕在核膜周围,它与抗DNA抗体有关;(4)核仁型:
仅有核仁染色,具有抗4-6sRNA抗体呈现这种染色型;(5)着丝点型:
在体外培养的细胞株(喉癌细胞)在核分裂相期时,可见到荧光染色的着丝点排列成特殊图型,而在鼠肝做底物中看不到此类图型,而被遗漏。
抗体分类
抗核抗体的分类,由于核抗原不同,有多种不同的ANA。
抗DNA抗体
抗DNA抗体有抗双链DNA(dsDNA)和抗单链(ssDNA)抗体之分。
抗dsDNA抗体与SLE的关系密切,且随疾病的活动度而升降,病情好转者其滴度多下降甚或转阴。
抗ssDNA抗体则与抗dsDNA不同,可在多种疾病出现,包括一些非自身免疫性疾病,如细菌和病毒感染。
故在临床上无实用价值。
而抗dsDNA抗体被认为是红斑狼疮(SLE)所特有。
抗DNA的自身抗体在SLE发病中起一定作用。
在一些SLE患者,DNA大分子存在于循环中或粘附于多种器官的微血管结构,这些循环或器官原位抗原型DNA均可与循环自身抗体发生反应,形成免疫复合物,激活炎症系统,在一些器官如肾脏,肺和脑组织引起免疫复合物介导的疾病,导致组织损伤。
抗可提取的核抗原(extractablenuclear)抗体此抗体原经盐水或磷酸缓冲液处理,易从胞核中提取出来,且不含DNA。
应用免疫荧光技术,抗ENA抗体型染色多呈斑点型。
此类抗原分为九种,故产生九种相应抗体。
(1)抗核糖核蛋白抗体(antiribonucleoprotein;抗RNP抗体):
抗原来源与SM相同。
它对去氧核糖核酸酶不敏感,但对核糖核酸酶,胰酶敏感。
1972年把它作为诊断混合性结缔组织病(MCTD)的重要血清学依据。
但以后发现本抗体可在多种风湿性疾病出现,不具备对某个病的特异性,但有助于鉴别结缔组织病和非结缔组织病。
抗核RNP抗体见于近32%的SLE患者,几乎见于所有MCTD患者。
(2)抗SM抗体:
SM系一患者Smith的简称。
1966年Tan&Kunkel首先在患者Smith体中发现。
抗原来源于小牛,兔胸腺,人脾等组织的一种酸性糖蛋白。
抗SM抗体可见于1/3或以上的SLE患者,不出现于其他疾病中,对SLE诊断有特异性,成为很有价值的SLE诊断标志,但无此抗体不能排除诊断。
(3)抗SS-A抗体:
系在发现Sjogren氏综合征(SS)的"A"抗原后而命名,主要见于SS。
本抗原可以从人、牛、猪脾中提取。
它除存在核内外,也存在于细胞浆内。
对胰酶敏感,对核糖核酸酶抵抗,能耐热(56度)。
(4)抗Ha抗体:
抗Ha抗体可与小牛胸腺可溶性核提取物(以及小牛和鼠的肝提取物)起反应。
见于SS患者,亦称之为SS-B抗体.应用沉淀素反应,补体结合以及荧光技术检测。
多数人认为13%SLE及33%SS患者有抗Ha沉淀性抗体。
(5)抗PM-1抗体:
系多发性肌炎的特异性抗体。
抗原系小牛胸腺核提取物,有人暂称之为PM-1。
最初有人应用补体结合抑制试验,确定该抗体特性,在皮肌类患者中发现PM-1抗体。
有人测定在多发性肌类患者阳性率%,皮肌类(DM)20%,系统性硬化并肌炎25%,SLE并肌炎偶有阳性,在其他疾病和正常人均阴性。
说明本抗体对肌炎诊断有一定特异性。
(6)抗MA1抗体:
为发现抗核酸蛋白抗原的抗体,称之为抗MA1抗体。
该抗体只出现于某些严重的SLE患者中。
(7)抗Scl-70抗体:
因出现在硬皮病且其分子量为70000,故名。
抗原为碱性非组蛋白,北京协和医院对系统性硬化用免疫双扩散法测定得抗Scl-70抗体阳性率为60%。
在其他结缔组织和非结缔组织病偶有阳性,而正常人均阴性,说明本抗体有较高的特异性,是系统性硬化的标记抗体。
(8)抗Jo-1抗体:
因患者而命名。
国外报道在多发性肌炎(PM)患者阳性率为30-50%,合并有肺间质纤维化的肌炎则达60%,而在皮肌炎(DM)患者则低于10%,在其他疾病均阴性。
(9)抗Ku抗体:
因患者命名,国外报道本抗体多见于合并有肌炎的系统性硬化患者,阳性率达55%。
总之,抗PM-1,抗Jo-1,抗Ku都与肌炎有关。
抗组蛋白抗体
组蛋白是一组碱性蛋白质,含有稍高量的赖氨酸及精氨酸。
是与DNA形成的复合物,结合成DNA一组蛋白。
组蛋白抗体见于药物诱发的SLE。
国外报道,用免疫荧光三步法测23例药物致狼疮阳性率为96%,12例SLE中42%阳性。
北京协和医院以同样方法检测488例服用异烟肼,68例服用苯妥英钠,40例服用复降片(内含肼苯哒嗪),都在服用6个月以上者和另133例服他巴唑3个月以上者,无一例查到本抗体。
这种差异可能与我国服用肼苯哒嗪和普鲁卡因酰胺的患者较少之故,也不能除外人种不同而造成的差异。
抗着丝点抗体
其抗原为紧附于染色体着丝点的DNA蛋白质。
因此需要选择分裂相活跃的细胞作为底物,这种细胞的着丝点较易被暴露。
多选用人喉癌上皮细胞
(HEP-2),其优点是核大,分裂相多。
国外报道本抗体多见于CREST综合征(即表现为软组织钙化,雷诺现象,食管功能低下,指端硬化,毛细血管扩张)。
阳性率达90%以上,称之为CREST的标记抗体。
根据协和医院观察测定结果,我国系统性硬化绝大部分是弥散型,CREST型极少见;抗着丝点抗体的阳性率在系统性硬化为20%,CREST型38%,弥散型10%,说明它不一定是CREST型的标记抗体。
抗核仁抗体
抗核仁抗体是一组对核仁不同RNA成分的抗体。
由于成分(4-6sRNA)不同,因此构成斑块,斑点,均质等不同图型。
本核体在以HEP-2细胞为底物间接免疫荧光检查为明显。
协和医院免疫组的阳性率是%,%,%,(阳性者都合并有指端硬化),%,PM/%,雷诺现象25%,其他结缔组织病和正常人均阴性。
抗核仁抗体不仅在PSS最多见,且滴度亦高,故它对PSS诊断有一定的帮助。
抗核抗体的检测在自身免疫病的临床诊断、鉴别诊断、评价疗效和预后估计中具有较大的意义,因此常将抗核抗体的检测作为自身免疫病的重要初筛试验。
抗体意义
临床意义
SLE:
约99%(86%~100%)的活动期SLE病人ANA阳性,其滴度也常为1:
80,但它的特异性差。
对于未经治疗的疑似患者,多次检查抗核抗体,若结果阴性,应考虑其他疾病的可能。
ANA阳性本身不能确诊任何疾病,但ANA阳性且伴有特征性狼疮症状则支持狼疮诊断。
ANA阴性几乎可除外SLE的诊断。
但应注意有5%的SLE病人ANA可为阴性,这其中大部分为抗SSA抗体、抗SSB抗体阳性,因为测定ANA通常用鼠肝或鼠肾做底物,而这些组织核内含SSA、SSB、Jo-1、rRNP抗原相对较少,所以不易测出其相应抗体。
可加做人喉癌上皮细胞为底物的方法进行检测。
阳性意义
抗核抗体谱包括抗核抗体(ANA)、抗DNA抗体、抗核内可溶性抗原抗体(ENA)。
ENA又包括抗史密斯抗体(Sm)、抗核糖核蛋白体(RNP)抗体、抗干燥综合征A(SSA/Ro)抗体、抗干燥综合征B(SSB/La)抗体、抗硬皮病-70(Scl-70)抗体。
临床意义为:
[1]ANA:
ANA为一系列抗细胞核抗原的自身抗体的总称。
一般应用免疫荧光的方法检测。
根据核荧光的类型分为以下几种类型:
①周边型(M型):
核周边的荧光增强呈环状。
M型的ANA主要有抗双链DNA抗体组成,故高滴度的M型ANA几乎仅见于SLE,因此有助于SLE的诊断。
②均质型(H型):
整个细胞核呈一片模糊而均匀的荧光。
H型的ANA主要有抗脱氧核蛋白抗体组成。
高滴度的H型ANA主要见于SLE,而低滴度H型ANA偶可见于药物性狼疮,JRA等其他自身免疫性疾病。
③斑点型(S型):
核内荧光呈颗粒状。
是有抗Sm抗体,抗SSB/La抗体、抗Scl-70抗体等多种抗体组成。
因此S型ANA可见于SLE,混合性结缔组织病(MCTD),硬皮病(PSS),干燥综合征(SS),多法性肌炎及皮肌炎(PM或DM)等自身免疫病。
[2]抗DNA抗体:
抗DNA抗体主要为抗双链DNA(ds-DNA)抗体。
抗ds-DNA抗体主要见于SLE患儿,其他疾病及正常人很少出现,是SLE的诊断标准之一。
高滴度的抗ds-DNA抗体不仅表示疾病的活动性,而且提示疾病累及肾脏的可能性。
[3]ENA:
①
抗Sm抗体:
其抗原主要为U簇小分子细胞核糖核蛋白微粒。
抗Sm抗体是SLE的特异性抗体,为SLE的诊断指标之一。
Sm抗体与狼疮的肾脏和中枢神经病变有关。
②抗RNP抗体:
其抗原主要为U1小分子细胞核糖核蛋白粒子,主要见于混合结缔组织病,患者SLE、PSS或DM的临床表现,高滴度的RNP抗体为混合结缔组织病的标志。
③抗SSA/Ro抗体:
抗SSA抗体主要参与皮肤的病理损害,引起重度过敏为特征的急性皮肤型狼疮的皮损,当母体血清中含有IgG类的抗SSA抗体,可引起新生儿狼疮综合征,出现典型的SLE皮损,该抗体还可以与胎儿的心脏的传导系统结合,导致新生儿先天性心脏完全型传导组滞。
④抗SSB/La抗体:
该抗体是公认的干燥综合征的标志抗体,其他免疫性疾病如果发现抗SSB抗体阳性,患者一般有继发性干燥综合征。
⑤抗Scl-70抗体:
其仅见于硬皮病,是硬皮病的特异性抗体。
因此你还要进一步检查查明引抗核抗体阳性的病因。
检测方法
由于ANA的复杂性及多样性,故测定方法繁多。
ANA常用的方法有免疫荧光法、放射免疫法、ELISA、免疫双扩散、对流免疫电泳及免疫印迹技术等。
1.免疫荧光法检测血清总ANA最常用的方法是荧光免疫组化法。
多用小鼠肝切片或印片作为细胞核基质,结果比较稳定可靠,在荧光显微镜下见到的细胞核有荧光着色为阳性反应。
如将患者血清先进行不同比例的稀释,可以做大致的定量试验,在1:
80稀释仍然虽阳性时,对SLE的诊断有较大的参考价值。
在油镜下观察结果,可以将ANA阳性的荧光现象分成4种主要的荧光核型,核型的确定对临床诊断有进一步的参考价值。
①周边型表示抗DNA抗体存在;②均质型表示有抗DNP抗体;③斑点(颗粒)型多为抗ENA抗体;④核仁型多为抗核小体抗体。
SLE患者常出现周边型、匀质型或混合型,斑点型多见于混合结缔组织病,而硬皮病多为核仁型;周边型对SLE有较高的特异性。
有人用锥虫或血鞭毛虫(例如绿蝇短膜虫试验)作基质测定抗dsDNA抗体,因为这些血寄生虫的动基体内含大量的纯dsNDA,无其他抗原干扰;在阳性结果时,可见鞭毛一端的动基体显示清晰的荧光。
因此该试验用于测定抗dsDNA抗体具有特异性强和敏感性高的优点。
另外,短膜虫对人畜无害,可以人工养殖,来源方便,值得推广。
2.放射免疫法常用检测抗DNA抗体,有Farr法及过滤法。
①Farr法的原理为用同位素标记DNA,被标记的DNA和被检血清的抗DNA抗体结合,经50%硫酸铵饱和液沉淀,然后比较沉淀物和上清液中的放射活性,从而得出DNA结合活性,一般结合率大于20%为阳性。
②过滤法是在分离结合物时用纤维素酯薄膜滤器(孔径为μm)进行过滤,游离的DNA被滤去而与抗体结合的复合物被阻留在滤膜上。
3.ELISA临床上主要是应用间接ELISA检测抗dsDNA抗体,其重复性及敏感性均较对流免疫电泳及双扩散为高。
已有试剂盒供应。
4.免疫印迹(immunoblotting)先将混合抗原作凝胶电泳,分离开不同的区带,然将这些带转印到硝酸纤维素膜上,最后用酸标抗体或放射性同位素标记抗体进行检测和分析。
由于该试验不需纯化的单个抗原,可在同一固相上作多项分析检测,灵敏度高,特异性强。
故已广泛用于自身免疫病患者血清中多种自身抗体的检测,如检测抗Sm抗体、抗RNP抗体、抗SS-A抗体及SS-B抗体等。
另外,还可用传统的琼脂双向扩散法、对流免疫电泳法、间接血凝法和补体结合试验等。
PAS染色法
概况
PAS染色法(PeriodicAcid-Schiffstain)在组织学上,主要用来检测组织中的糖类。
过碘酸把糖类相邻两个碳上的羟基氧化成醛基,再用Schiff试剂和醛基反应使呈现紫红色。
原理
PAS染色又称过碘酸雪夫染色,糖原染色。
一般用来显示糖元和其它多糖物质。
原理:
过碘酸能使细胞内的多糖乙二醇基氧化成二醛,再与Schiff氏液的无色品红结合,红色,定位于胞浆上。
应用
随着医学实验技术的发展,糖原染色应用的范围更加广泛,如用以证明与鉴别细胞内空泡状的性质,心肌病变及其他心血管疾病的诊断,糖原累积病诊断和研究,糖尿病的诊断和研究,用于某些肿瘤的诊断等。
除用于糖原的鉴定和黏液的显示外,还可以观察肾小球基底膜、结肠杯状细胞中性黏液物质、阿米巴滋养体和霉菌的着色。
临床诊断、分类和治疗提供了重要的依据
方法
固定液
Carnoy固定液:
纯酒精60ml 冰醋酸10ml氯仿30ml,也可以选用75%酒精.
液配制
1)过碘酸酒清夜配法:
过碘酸(HIO.2HO) 95%酒精35ml M/5醋酸钠+蒸馏水100ml)5ml蒸馏水10ml
保存于冰箱内,用棕色瓶,可用两周.
2)Schiff氏液:
克碱性品红加入100毫升蒸馏水中,时时摇动三角瓶5分钟,使之充分溶解.冷却至50℃后过滤加入10毫升1N盐酸.冷却至25℃,加入克偏重硫酸钠,在室温中至少静置24小时,然后密封冰箱保存.
3)Schiff氏酒精液配置 Schiff氏液 1NHCI 纯酒精23ml
4)亚硫酸水1%偏重亚硫酸钠10ml 1NHCI10ml 蒸馏水180ml的树胶溶解。
5)哈瑞或迈耶苏木精略
染色步骤
1.石蜡切片脱蜡至水(细胞涂片,冰冻切片直接水洗)
2.蒸馏水洗
3.过碘酸酒清夜10min
4.自来水冲洗10min
5.Schiff氏液10min
6.流水冲洗5min
7.用哈瑞苏木精或迈耶苏木精染核3min(细胞核染色过深可用盐酸酒精分化)
8.流水冲洗5min
9.常规脱水、透明、封固
结果
PAS阳性为红色,细胞核蓝色。
实验效果
准备
1、10g/L过碘酸液
2、Schiff染液:
碱性品红
DH2O100ml
煮沸后,待片刻,加入碱性品红,振荡数分钟使品红溶解,冷至50℃加入1M的盐酸20ml,混匀。
待冷
却至25℃加入偏重亚硫酸钠,混合,置于带塞的棕色瓶中,放于暗处24小时,染液为无色,如为微红则
加活性炭1-2g,混合过滤,如过滤液仍有红色,应再加少许活性炭,时红色完全被吸收为止。
制成后置于棕色
瓶内保存在冰箱备用,如变为红色,则不能使用。
4、苏木素液:
苏木素
95%乙醇10ml
铵(钾)明矾20g
DH2O200ml
将苏木素溶于95%的乙醇,钾明矾溶于水(可加热),然后将苏木素液加入明矾液中混合,用强火煮
沸后加氧化汞,迅速搅拌,成深紫色,迅速移入冷水中,次日过滤,临用时取此液95ml加冰醋酸
5ml,可使细胞着色清楚。
方法
1、将新鲜血片或骨髓片用95%乙醇固定10分钟。
2、10g/L过碘酸液作用20分钟
3、DH2O洗涤几次,晾干
4、Schiff染液,60分钟
5、用自来水洗涤15分钟(细水长流冲洗)
6、苏木素染液10分钟。
7、自来水冲洗15分钟,待干。
结果
阳性反应,胞浆呈红色,阴性反应,胞浆呈无色;
在正常血片中RBC不染色;
PLT染成深红色;
中性粒细胞胞浆染成红色或深红色,有些细胞有阳性颗粒;
单核细胞的胞浆染成淡红色,可含有细小或粗大阳性颗粒;
少数淋巴细胞的胞浆内含有少许小的淡红色或红色颗粒;
正常骨髓的幼稚细胞和有核RBC都不染色;
巨核细胞的胞浆内呈弥散红色或深红色。
巨核细胞的胞浆内呈弥散红色或深红色。
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