藻类生物学实验室新生培训手册.docx
- 文档编号:12955259
- 上传时间:2023-06-09
- 格式:DOCX
- 页数:21
- 大小:531.36KB
藻类生物学实验室新生培训手册.docx
《藻类生物学实验室新生培训手册.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《藻类生物学实验室新生培训手册.docx(21页珍藏版)》请在冰点文库上搜索。
藻类生物学实验室新生培训手册
藻类光生物学实验室新生培训手册
欢迎各位新生来到藻类光生物学实验室,在这里你们将度过你们的研究生生涯。
为了使你们尽快融入实验室这个大家庭,为了使你们今后能够更好的进行科学研究,本实验室将对所有来到这里的新生进行为期2周的培训,希望大家能够积极参与,enjoyit!
【培训内容】
●了解实验室规章制度及研究生须知
●掌握基本实验技术
●培训总结
一了解实验室规章制度及研究生须知
为了使实验室能够高效、有序的运转,藻类光生物学实验室制定了自己实验室的规章制度,每位在这个实验室学习工作的人员都必须遵守这些规章制度,同时,各位研究生还需要遵守研究生守则,以保证自己能够顺利毕业。
培训方式:
抄写并熟知相关规则。
培训时间:
入学第一周第一天
二掌握基本实验技术
为了能够进行科学研究,一些基本实验技术的掌握是必须的,新生将在实验室技术人员的指导下对实验技术进行熟练操作、掌握。
以下是藻类光生物学实验室必须掌握的实验技术,新生在进行实际操作前,必须先对实验原理及步骤进行预习。
培训时间:
开学第一、二周
1.海水二氧化碳系统各分量的计算:
气态CO2溶入海水后,一方面服从亨利定律(在一定温度下,气体在液体中的饱和浓度与液面上该气体的平衡分压成正比):
CO2(g)←→CO2(aq),因此CO2的平衡溶解度[CO2]与CO2的平衡分压pCO2之间的线性关系可表示为[CO2](aq)=KH*pCO2,KH是海水中二氧化碳的溶解度系数与温度、盐度和压力有关;另一方面,CO2还和水反应生成碳酸,CO2+H2O←→H2CO3,然后,H2CO3分两步电离
H2CO3←K1’→H++HCO3--←K2’→CO32-+2H+
K1’=aH+[HCO3-]/[H2CO3]
(1)
K2’=aH+[CO32-]/[HCO3-]
(2)
K1’、K2’、分别是碳酸的第1、第2表观解离常数,
其中[HCO3-]+2[CO32-]=Ac(3)
Ac为碳酸盐总碱度,它跟海水总碱度(AT)有如下关系:
Ac=AT-2.206×10-5×Cl‰×KB’/(KB’+aH+)
=AT–B
Cl‰是海水氯度,KB’是硼酸的解离常数
当海水温度、盐度确定时,KH、K1’、K2’、B值都可查表得到,这样通过测定海水的pH和总碱度,按下列方程即可计算碳酸盐体系各组分(HCO3-、CO32-、CO2*、∑CO2)的浓度和pCO2。
由公式
(1)
(2)和(3)可得碳酸系统各组分计算公式:
[HCO3-]=Ac/(1+2K2’/aH+)
[CO32-]=Ac×(K2’/aH+)/(1+2K2’/aH+)
[CO2*]=(Ac×aH+/K1’)/(1+2K2’/aH+)
∑CO2=[HCO3-]+[CO3-]+[CO2*]
=Ac×[(1+K2’/aH++aH+/K1’)/(1+2K2’/aH+)
pCO2=[CO2*]/KH
因为海水中CO2(aq)和H2CO3是无法区分的,所以用CO2*表示两者的总和,
以上各参数计算在软件CO2SYS完成(By:
Lewis,E.,andD.W.R.Wallace.1998.ProgramDevelopedforCO2SystemCalculations.ORNL/CDIAC-105.CarbonDioxideInformationAnalysisCenter,OakRidgeNationalLaboratory,U.S.DepartmentofEnergy,OakRidge,Tennessee.)。
计算题:
当温度是10℃时,pH值为8.3的海水总碱度为2.5×10-3mol/L,盐度是31‰,查表得B值为8×10-5mol/L,CO2溶解系数为4.621×10-2mol/L/atm,pK1’和pK2’分别是5.98和9.10,求海水中各种DIC组分的含量。
2细胞色素的定量
2.1叶绿素a(chla)、叶绿素c(chlc)和类胡萝卜素
【实验原理】
根据chla甲醇提取液在665nm处有最大吸收峰,利用分光光度计法测定chla的含量。
【实验步骤】
1)将藻体置于一定量的甲醇中,放置于4℃的冰箱内过夜处理。
2)1500g离心10min,取上清,用分光光度计测定其在750、665、652的OD值。
3)按照Porra提供的公式,[Chla](μg/ml)=16.29*(A665-A750)-8.54*(A652-A750),计算其含量。
采用Jeffrey&Haxo的公式计算chlc含量:
chlc(μg/ml)=67.3×A635-14.1×A668
A635和A668代表波长为635和668的吸收值。
采用Strickland&Parsons的公式计算类胡萝卜素含量:
Carotenoids(μg/ml)=7.6*[(A480-A750)-1.49*(A510-A750)]
2.2藻红(PE)和藻蓝蛋白(PC)
1)取约为0.2g的藻体,在研钵内加入一定量的石英砂和少量的磷酸缓冲液(pH=6.8)将藻体研碎,
2)加约10ml的磷酸缓冲液10000r/min离心10分钟,取上清液,将沉淀物继续研磨,并重复上面的步骤,
3)最后将溶液定容为25ml,然后用分光光度计测定A455、A564、A592、A618和A645值。
PE和PC的含量按下列公式计算:
[PE]=[(A564-A592)-(A455-A592)*0.2]/0.12
[PC]=[(A618-A645)-(A592-A645)*0.51]/0.15
注意事项:
1.藻体研磨要尽量充分,直至离心沉淀物基本无颜色。
计算题:
已知培养液中藻体的浓度是105cells/ml,取10ml培养液,离心,用5ml甲醇过夜处理后,离心取上清,测得其在750、665、652的OD值分别是0.001、0.0082、0.0026,求单位细胞藻体中叶绿素含量。
问答题:
1.为什么在测定叶绿素定量或扫描吸收光谱时,通常需要测定750nm的吸光值?
2.色素定量的公式较多,采用不同计算公式,验证差别的大小。
3.色素的提取,是定量的关键,如何确定提取是完全的?
对于组织结构负责的藻体,需将其研磨碎后提取,应注意那些步骤?
3.光合作用速率的测定
3.1C14测定方法
【实验原理】
浮游植物光合固碳速率(初级生产力)依照SteemanNielsen(1952)发明的14C同位素标记法来进行测定。
浮游植物进行光合作用需要固定海水中的无机碳(DIC),海水中碳元素是以HCO3-、CO32-、CO2和H2CO3等形式存在,它们之间存在动态平衡,可以相互转化,这样当加入H14CO3-时,经过培养之后,通过液闪计数可以计算浮游植物固定了多少14C,再乘以溶液中DIC和H14CO3-的比例,可以推算浮游植物总共固定了多少DIC。
【实验步骤】
1)进行光合固碳速率测定时,将取得的水样用180µm孔径的筛绢滤去浮游动物,分装到体积为20ml的石英管中。
2)然后用连续加样器(eppendorf)吸取一定体积的14C液体,按每管100µl(放射活度为5µCi)的加样量加入,盖上塞子摇匀后到室外接受阳光照射(或在太阳模拟器下)。
3)石英管盖上或包裹上不同的膜以接受不同的阳光辐射处理,膜的类型因实验目的的不同而不同,培养过程中用流水水浴控温(当以模拟器为光源时,用空调控温),范围为±2℃,培养时间一般至少4小时。
4)培养完毕后将石英管拿回实验室内,每个石英管中的水样过滤到一张GF/F直径为25mm的玻璃纤维滤膜上,然后放入20ml的液闪瓶中。
5)最后将液闪瓶连同滤膜一起放入到一个密闭的塑料盒中,同时在盒中放一小瓶约15ml的浓盐酸过夜,利用浓盐酸形成的酸雾将滤膜上未被浮游植物利用的无机14C(即NaH14CO3)转化为气体形式去除。
6)第二天将液闪瓶取出放入45℃烘箱中烘干,储存。
7)每个液闪瓶中加入闪烁液(OptiphaseHisafe3)3ml。
8)放置2-3h后,置于液体闪烁计数仪(ScintillationCounter,BeckmanCoulter,LS6500)中测定。
浮游植物固碳量用下列公式计算:
μgC/L=[(CPML-CPMD)/Ce]×If×DIC/A
CPML为接受阳光辐射处理样品中被固定的放射性物质的放射量(每分钟计数的数目);
CPMD为对照样品(暗瓶)中被固定的放射性物质的放射量;
Ce为计数效率,液闪计数仪的计数效率通过测定14C的标准样品获得;
If为同位素差别因子,在CO2的固定过程中,细胞对14C和12C的利用率存在差异,12C与14C相比,其同化率快6%,故If为1.06;
DIC为培养液总溶解无机碳浓度;
A为所加14C的每分钟裂变数(DPM)(等于所加14C活度(μCi)×2.2×106);
固碳速率(µgC(µgchla)-1h-1)由该固碳量除以叶绿素浓度及培养时间得到。
【注意事项】:
1)由于NaH14CO3在溶液中是一个平衡体系,所以样品尽量保存在低温下(4oC)以防止溶液中CO2气体挥发,污染环境并影响测定结果。
2)使用C-14进行实验操作时尽量远离,尽量少呆在有污染的空间内,并保持操作空间通风良好,以尽量减少呼吸吸入造成内辐射。
3)样品处理是关键,否则会影响实验结果,甚至看到的实验现象为假象。
得到的样品酸化一定要充分(酸不能重复使用,一般2-3次就要更换;酸化时间足够,一般酸化过夜);野外实验时,酸化后样品一般要烘干(或-20oC)保存,烘干温度不能超过60oC(50-60oC),烘干时间>6h。
样品带回实验室测定时,加入闪烁液后最好放置2-3h后测定,以便使样品充分消化,然后再进行计数。
4)加入C14的量与叶绿素浓度的关系(参考数值):
<0.1μgchla/L加10μCi;
0.1~5μgchla/L加5μCi;
>5μgchla/L加1μCi
5)14C(AmershambioscienceUKLimited),为NaH14CO3浓缩液(12.5ml,总活度25mCi即2mCi/ml),使用前稀释到50µCi/ml。
具体操作为:
先用普通滤纸预先过滤一定体积的海水,再用直径50mm孔径0.47µm的微孔滤膜反复过滤。
为防止在接下来的灭菌过程中海水发生结晶,加蒸馏水将其稀释到80%,然后用此80%的海水将NaH14CO3浓缩液稀释,115℃下灭菌20分钟,保存于4℃冰箱中备用。
计算题:
在20ml海水中加入5μCiC-14,培养6小时后,过滤、酸化、烘干、加入液闪计数,到得的数值是CPML是9754.4,CPMD是1034.8,已知液闪计数仪的计数效率为0.96,海水中叶绿素浓度为0.32μg/L,DIC浓度为2.2mM,求海水中浮游植物的固碳速率(µgC(µgchla)-1h-1)。
3.2氧电极法(开放系统法,封闭系统法,原理与测CO2一样,见下)
测定一段时间反应槽中溶解氧浓度的变化,根据溶解氧浓度的变化、引起变化所需要的时间以及反应槽的容积可以计算光合作用速率。
【注意事项】
1)需要保持温度的恒定,并进行搅拌。
2)通常测定是在封闭系统中完成的,因此反应容器中溶解氧的浓度随反应时间的延长而增大,考虑到氧气对光合作用的阻碍作用,需要按时用氮气充气,使得反应液中溶解氧的浓度不超过30%,反应器中细胞浓度不能过高。
3)大型海藻的光合作用应该采用开放系统的流水测定法,以消除“瓶效应”。
3.2.1P-Ccurve测定
1)将细胞悬浮于无碳海水中后,取一定体积量注入反应容器,在400μmolm-2s-1光强下,使细胞进行光合作用
2)当细胞体内的“CO2”耗竭(净放氧速率为零)之后,添加NaHCO3溶液,在各种“CO2”浓度下测定藻类的光合作用速度。
Km(DIC或CO2)根据Michaelis-Menten方程拟合求得:
V=Vm*[S]/(Km+[S])
V:
给定无机碳浓度下的净光合放氧速率
Vm:
饱和无机碳浓度下的净光合放氧速率
[S]:
DIC或CO2浓度
Km:
达到最大光合速率(Vm)一半时的无机碳(DIC或CO2)浓度
注意事项
1)无CO2缓冲液的配制不当或藻类材料的清洗不完全,都会使得藻类光合放氧达到零所需的时间拉长。
这种情况下,细胞在强光照和低CO2浓度下容易受损伤,导致光合作用活性降低;同时也会增加细胞对低CO2浓度的适应性,影响光合作用对CO2亲和程度的判断。
使细胞内“CO2”耗竭所需的时间一般不能超过30min。
如果超过30min,应该重新配制无CO2缓冲液和实验材料。
2)测定条件的确定
除了CO2以外影响光合作用速度的主要因子有光照强度、光质、温度、溶解氧浓度及水流等。
因此,在测定某种藻类光合作用与CO2浓度关系之前.首先需要确定光合作用速度饱和时的光照强度,然后在此光照条件下确定其最适温度。
在测定过程中,必须保持光照与温度条件的恒定,进行搅拌,在短时间内完成测定。
通常测定是在封闭系统中进行的,因此反应容器中的溶解氧浓度随着时间延长而增大。
为了获得具有可重复性、可靠的数据,考虑到氧气对光合作用的阻碍作用,需要按时用氮气充气,使得反应液中的溶解氧浓度不超过30%。
大型藻类的光合作用可以采用开放系统的流水测定法川。
用此方法进行光合作用测定时,新鲜的海水不断地流过藻体,不易发生“瓶效应”(封闭系统测定时氧浓度增高、无机碳浓度降低等导致光合作用低下的现象)。
3)无CO2缓冲液(反应液)的配制
通常将具有缓冲作用的培养液作为光合作用测定时的反应液。
如果测定能在短时间内完成的话,只用缓冲液作为反应液也可以。
无CO2(CO2-free)缓冲液在调配各种CO2浓度反应液时是必需的。
测定海产藻类时用低浓度的盐酸将海水处理到酸性(pH<5),将HCO3-与CO32-离子转化为CO2后,再以N2充气将CO2驱出水面。
充N2的时间控制在10-20min就行,水量多时可适当延长。
将海水中的CO2除掉之后,边充氮气,边向海水中添加缓冲剂,再以NaOH溶液(将过饱和的NaOH溶液用带密封盖子的离心管离心,离心后取上清液作为无CO2的NaOH溶液)调节pH。
碱性溶液中通常溶解有很多CO32-,但在过饱和NaOH溶液中“CO2”在离心时沉淀下去。
测定淡水藻类可直接用N2向蒸馏水充气,驱逐蒸馏水中少量的“CO2”,然后如上所述,边充气、搅拌边添加缓冲剂,最后以NaOH溶液调节pH。
因为调配好的缓冲液中还会有极少量的CO2溶入,所以最好用吸气器再进行脱气。
光合作用测定时的反应液,通常使用浓度为25-50mmol/L的缓冲液(根据设定pH值的不同,选择MES,HEPES,Bis-Tris-Propane,Tricine,PIPES等)。
这些缓冲液均不被细胞吸收,所以对细胞的生理活性不产生影响。
3.2.2P-Icurve测定
通过调节光源与反应槽的距离而获得不同水平的光照强度(0,50,100,300,600,900μmol·m-2·s-1),光照强度用光量子计测定。
在P-I曲线中,最大净光合速率(Pmax)、暗呼吸速率(Rd)从曲线中直接读出,光合效率(ɑ)是P-I曲线的初始斜率(即光合作用在光限制部分的斜率)。
光补偿点及光饱和点的计算公式为:
Ic=-Rd/ɑ,Ik=(Pmax+Rd)/ɑ(Henley1993)。
3.3红外气体分析法
开放系统法:
用叶室分析仪开放气路系统法测定大型海藻在空气中的CO2吸收速率。
测定时所采用的温度水平通过调节空调房中的温度而控制(在分析仪上可以显示叶室中藻体的温度)。
测定呼吸速率时使叶室处于黑暗之中。
根据光合仪上“△C”值(气路经过叶室所造成的CO2浓度差)及所用的藻量(最后的干重)和气流量而计算光合(或呼吸)速率。
其计算公式为:
Pn=△C×F×60×273/[(273+T)×22.4×DW],其中F表示气体流速(Lmin-1);T为光合反应温度(oC);DW为藻样干重(g)。
计算题:
从海水中取一片藻体,吸干其表面水分称得其重量是0.7g,放入叶室分析仪测其光合作用速率,维持环境温度为25oC,在一定光强条件下,其恒定△C为40ppM,气体流速为0.2L/min,求该藻体的光合作用速率(μmoleCg-1(d.w.)h-1),已知该海藻的干湿比为1:
7。
4微藻常用培养法
4.1分批培养(batchculture)
在一个相对独立密闭的系统中,一次性投入培养基对微生物进行接种培养的方式一般称为分批培养(batchculture)。
由于它的培养系统的相对密闭性,故分批培养也叫密闭培养(closedculture)。
分批培养特点:
1)操作简单。
培养系统属于封闭式,培养过程中除了控制温度和光强外,不进行其他任何控制。
2)直观反映细胞生长代谢的过程。
分批培养中,细胞的生长分为4个阶段:
迟缓期,对数期、稳定期及衰亡期。
3)培养周期短,染菌和细胞突变的风险小。
4.2半连续式培养(semi-continuousculture)
半连续式培养又称为重复分批式培养或换液培养,在细胞增长和产物形成过程中,每间隔一段时间,从中取出部分培养物,再用新的培养液补充,使维持细胞浓度恒定或培养液总体积不变。
半连续培养特点:
1)细胞可持续指数生长,并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平,培养过程可延续到很长时间。
2)可进行多次收获。
5常用培养基的配置
5.1f/2Medium
f/2Medium
(Guillard&Ryther1962,Guillard1975)
向950mL过滤海水中加入下列物质:
Quantity
Compound
StockSolution
MolarConcentrationinFinalMedium
1mL
NaNO3
75g/LdH2O
8.83x10-4M
1mL
NaH2PO4·H2O
5g/LdH2O
3.63x10-5M
1mL*
Na2SiO3·9H2O*
30g/LdH2O*
1.07x10-4M*
1mL
f/2tracemetalsolution
(seerecipebelow)
-
0.5mL
f/2vitaminsolution
(seerecipebelow)
-
加过滤海水直到最终体积为1L,高压灭菌。
注意:
高压灭菌事会产生大量的硅沉淀,因此,当藻类不需要硅时可以不添加硅元素。
f/2TraceMetalSolution
(Guillard&Ryther1962,Guillard1975)
向950mL蒸馏水中加入下列物质:
Quantity
Compound
StockSolution
MolarConcentrationinFinalMedium
3.15g
FeCl3·6H2O
-
1x10-5M
4.36g
Na2EDTA·2H2O
-
1x10-5M
1mL
CuSO4·5H2O
9.8g/LdH2O
4x10-8M
1mL
Na2MoO4·2H2O
6.3g/LdH2O
3x10-8M
1mL
ZnSO4·7H2O
22.0g/LdH2O
8x10-8M
1mL
CoCl2·6H2O
10.0g/LdH2O
5x10-8M
1mL
MnCl2·4H2O
180.0g/LdH2O
9x10-7M
加蒸馏水至最终体积为1L,高压灭菌。
f/2VitaminSolution
(Guillard&Ryther1962,Guillard1975)
向950mL蒸馏水中加入下列物质:
Quantity
Compound
StockSolution
MolarConcentrationinFinalMedium
1mL
VitaminB12(cyanocobalamin)
1.0g/LdH2O
1x10-10M
10mL
Biotin
0.1g/LdH2O
2x10-9M
200mg
Thiamine·HCl
-
3x10-7M
加蒸馏水至最终体积为1L,4℃保存。
注意:
因为维生素B12和生物素是以结晶形式存在,因此在配制母液的时候,1mg维生素B12只需加0.89mLdH2O,1mg生物素只需加9.6mLdH2O。
5.2KMedium
KMedium
(Kelleretal.1987)
向950mL过滤海水中加入下列物质:
Quantity
Compound
StockSolution
MolarConcentrationinFinalMedium
1mL
NaNO3
75g/LdH2O
8.83x10-4M
1mL
NH4Cl
2.68g/LdH2O
3.63x10-5M
1mL
beta-glycerophosphate
2.16g/LdH2O
1x10-5M
1mL*
Na2SiO3·9H2O*
30g/LdH2O*
1.07x10-4M*
1mL
H2SeO3
1.29mg/LdH2O
1x10-8M
1mL
Tris-base(pH7.2)
121.1g/LdH2O
1x10-3M
1mL
Ktracemetalsolution
(seerecipebelow)
-
0.5mL
f/2vitaminsolution
(seerecipebelow)
-
加过滤海水直到最终体积为1L,高压灭菌。
KTraceMetalSolution
(Kelleretal.1987)
向900mL蒸馏水中加入下列物质:
Quantity
Compound
StockSolution
MolarConcentrationinFinalMedium
41.6g
Na2EDTA·2H2O
-
1x10-4M
3.15g
FeCl3·6H2O
-
1x10-5M
1mL
Na2MoO4·2H2O
6.3g/LdH2O
1x10-8M
1mL
ZnSO4·7H2O
22.0g/LdH2O
1x10-9M
1mL
CoCl2·6H2O
10.0g/LdH2O
1x10-9M
1mL
MnCl2·4H2O
180.0g/LdH2O
1x10-8M
1mL
CuSO4·5H2O
9.8g/LdH2O
1
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 藻类 生物学 实验室 新生 培训 手册