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,RNAinterference(RNAi):
在进化过程中高度保守、由双链RNA(dsRNA)诱发并导致同源mRNA高效特异性降解的现象。
3.siRNA造成的RNAi机制,的mRNA结合,使mRNA被RNA酶裂解9。
起始阶段,效应阶段,扩增扩散阶段,RNAi机制中siRNA发挥的基因沉默作用,10,RISC由siRNA、解旋酶、ATP、核酸内切酶、核酸外切酶等多种成分组成。
活化的RISC在单链siRNA引导下识别互补的mRNA,并在RISC中的核酸内切酶作用下从siRNA引导链中心所对应的靶基因位置切割靶mRNA,最后可能再被核酸外切酶进一步降解,从而干扰基因表达。
sRNA合成过程中的蛋白因子RISC(RNA-inducedsilencingcomplex),11,起始阶段,第一步(起始阶段)是较长dsRNA在ATP参与下被特异核酸酶Dicer切割加工成2123nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)。
12,RISC,效应阶段,13,RISCbindingtargetedRNA,siRNA在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链,并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC),并通过碱基配对结合到靶基因的序列上。
扩增扩散阶段(放大效应),模板:
靶mRNA切割片段引物:
siRNA产物:
长链dsRNA依次循环:
新合成的长链dsRNA同样可被Dicer切割、降解生成大量的次级siRNA。
次级siRNA又可进入合成-切割的循环过程,进一步放大RNAi作用。
smallRNAs可以在转录水平或转录后水平精细的调节基因表达,作用几乎涉及所有的生命活动过程,如抗病毒、细胞增值、分化和死亡,发育和代谢调节、转座子沉默及胁迫反应等。
RNAi途径中siRNA作用.movie,14,高效性浓度依赖性,7.放大效应,8.作用广泛性,高稳定性遗传性,高特异性影响性,RNAi作用特征,siRNAs介导的RNAi作用特点:
15,高效性:
相对很少量的dsRNA分子(数量远远少于内源mRNA的数量)就能产生强烈的RNAi效应,有效地抑制基因表达,产生类似基因“剔除”的效果。
浓度依赖性:
dsRNA诱导的RNA干扰效应的强度随着其浓度的增加而增强。
siRNAs介导的RNAi作用特点:
16,3.高特异性:
dsRNA能够非常特异地诱导与之序列同源的mRNA(靶基因)降解,而无关基因不受影响。
4.RNAi对细胞调控机制的影响性:
RNA干扰在有效地沉默靶基因的同时,对细胞本身的调控系统没有影响。
17,5.高稳定性:
以3端突出TT或UU碱基的双链RNA比较稳定,不再需要进行其他任何的修饰。
6.遗传性:
在Fire等人发现线虫,果蝇等RNAi效应可以在生物体内传播,并可传给子代。
18,7.放大效应:
少量的dsRNA能够使大量的靶基因沉默,即便细胞增殖50-100倍仍可保持RNAi效应,这表明RNAi存在扩增机制。
19,8.作用广泛性:
dsRNA介导RNAi不仅在导入部位产生抑制效应,而且可以跨越细胞界限在不同细胞间长距离传递和维持。
cell,20,RNAi,cell,cell,cell,miRNA概念及发现miRNA的合成miRNA介导靶基因沉默作用机制4.miRNA产生特点5.miRNA功能研究思路,21,miRNA的功能,MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,其大小长约2025个核苷酸。
通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA,并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。
22,1.microRNA概念,第一个被发现的miRNA(lin-4)由哈佛大学的VictorAmbros发现的(1993)第二个被发现的miRNA(let-7)由哈佛大学的博士后FrankSlack(Ruvkun实验室)发现的(2000),VictorAmbros,GaryRuvkun,miRNA的发现,近年来被鉴定的miRNAs越来越多,至今超过17000miRNAs已被发现,23,miRNA基因通常是在核内由RNA聚合酶II(polII)转录的,最初产物为具有帽子结构(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的pri-miRNA。
pri-miRNA在核酸酶Drosha和其辅助因子Pasha的作用下被处理成70个核苷酸组成的pre-miRNA。
RANGTP和exportin5将pre-miRNA输送到细胞质中。
随后,另一个核酸酶Dicer将其剪切产生约为22个核苷酸长度的miRNA:
miRNA*双链。
这种双链很快被引导进入沉默复合体(RISC)复合体中,其中一条成熟的单链miRNA保留在这一复合体中。
成熟的miRNA结合到与其互补的mRNA的位点通过碱基配对调控基因表达。
24,2.miRNA的合成,3.miRNA介导靶基因沉默机制,25,切割,26,抑制,切割or抑制,miRNARISC对靶基因mRNA的抑制主要取决于它与靶基因转录体序列互补的程度,有3种方式。
microRNA对靶基因的抑制,植物中,大部分microRNA都以这种方式,靶基因mRNA断裂后,无poly(A)的分子的3端加上多个U并很快降解,含poly(A)的分子能稳定存在一段时间(如拟南芥miR-171)。
27,第一种是切断靶基因的mRNA分子。
miRNA与靶标基因完全互补结合,作用方式和功能与siRNA非常类似,最后切割靶mRNA,第二种是抑制靶基因的翻译作用时与靶标基因不完全互补结合,进而阻遏翻译而不影响mRNA的稳定性,这种miRNA是目前发现最多的种类(线虫lin-4).在动物体内,大部分miRNA不能与靶基因的转录体完全配对,故被认为主要通过翻译抑制的方式来调控靶基因。
在植物中极少数的microRNA通过此方式来抑制靶基因。
28,具有以上两种作用模式:
当与靶标基因完全互补结合时,直接靶向切割mRNA;
当与靶标基因不完全互补结合时,起调节基因表达的作用。
第三种是结合抑制,let-7,Targetknockdown,29,30,4.miRNAs产生特点,miRNA前体通过RNA聚合酶II转录生成.具有mRNA的结构特征。
具有多顺反子结构.即一条pri-miRNA包含多个成熟miRNA的信息。
miRNA可来源于外显子,也可来源于内含子和非编码序列。
miRNA在基因组座位上常成族分布,处于同一族的miRNA常共表达。
对于同一家族miRNA,其功能常具有互补作用。
不同miRNA可同时调节同一靶mRNA。
小RNA都有其相同的生物学特征,根据miRNAs和siRNAs的合成途径,我们发现小RNA之间又有其特异性。
第一,miRNA是由具有发夹结构的初级转录本经过一系列加工过程,包括核酸内切酶DCL1加工后生成。
siRNA则是通过核酸内切酶DCL2,DCL3和DCL4对对具有较好互补结构的长双链RNA前体进行加工形成的(Vazquezetal,2006)。
第二,成熟的小RNA需要不同的DCL内切酶切割产生。
第三,不同小RNA的编码基因不同。
第四,虽然miRNA和siRNA生成过程中所需要的蛋白相同或相关,但在很多生物中,miRNA和siRNA行使功能时所需的蛋白是不同的。
miRNA与siRNA的区别:
31,miRNA与siRNA的区别:
miRNA与siRNA的联系:
均为Dicer的产物:
长度均为22nt左右,5端是磷酸基3端是羟基,均需Argonaute家族蛋白的存在同为RISC的组分,二者进化关系上可能的两种推论:
siRNA是miRNA的补充miRNA在进化过程中替代了siRNA,沉默机制有重叠,33,5.植物miRNA的功能研究思路,miRNA的正常表达是植物正常生长发育所必需的,如何研究miRNA对靶标基因的调控作用?
改变植物体中miRNA的表达量导入外源片段竞争miRNA,使其不能结合内源性靶基因通过转基因手段改变植物中靶mRNA的序列使其具有抗miRNA降解的能力,1.改变植物体中miRNA的表达量,35S:
miR156b,overexpress,Phenotype,function,+,The35S:
miR156bplant,whichisabout7monthsold,hasmanymore,butsmaller,leaves.SchwabR,DevCell.2005,35S:
MIMI156b,WTMIM156ArticialtargetmimicsofmiR156Franco-ZorrillaJM,NatGenet.2007,2.导入外源片段竞争miRNA,使其不能结合内源性靶基因,+,3.通过转基因手段改变植物中靶mRNA的序列使其具有抗miRNA降解的能力,改变靶基因重要碱基(同义突变),miRNA不能识别靶基因,lncRNA的发现及概念。
lncRNA作用机制lncRNA作用特点lncRNA的研究方法。
4.lncRNA(长链非编码RNA)的功能-基因组的暗物质,38,4.1lncRNA的发现及概念,LongNoncodingRNAs,起初被认为是基因组转录的“噪音”,是RNA聚合酶II转录的副产物,不具有生物学功能。
然而,近年来的研究表明,lncRNA参与了X染色体沉默,基因组印记以及染色质修饰,转录激活,转录干扰,核内运输等多种重要的调控过程,这些调控作用也开始引起人们广泛的关注。
39,JohnL.RinnandHowardY.Chang.,Annu.Rev.Biochem.,2012,LongncRNAs的发现,新近的研究发现,有一类序列比较长的非编码RNA(longnoncodingRNA)具有调节基因表达的功能。
另外,longncRNA还可能参与基因组印记以及染色质修饰,转录激活,转录干扰,核内运输等多种重要的调控过程。
例如小鼠中的macroRNAXist和Air,其大小分别为18和108kb。
Xist通过与染色体作用引起失活的X染色体上的大部分基因沉默,而Air与父本Igf2r/Slc22a2/Slc22a3基因簇的沉默有关。
40,LongNoncodingRNAs定义,41,长链非编码RNA(longnoncodingRNA,lncRNA)长度200个核苷酸缺少特异完整的开放阅读框序列保守性差(物种特异性)表达量低和组织特异性无蛋白质编码功能longncRNAs的特征:
长度大于200bp,没有蛋白编码能力,通过多种机制调控基因表达;
序列的不保守性;
相比蛋白编码基因,更严格的功能限制;
进化速度快,比编码基因可塑性更大。
LongncRNAs的来源,编码蛋白的基因结构中断而转变为LongncRNAs染色质重组的结果,即两个未转录的基因与另一个独立的基因并列而产生含多个外显子的LongncRNAs由非编码基因复制过程中的反移位产生LongncRNAs由局部的串联复制子产生邻近的非编码RNA基因中插入一个转座成分而产生有功能的非编码RNAPossibleOriginsoflncRNAs(ChrisP.Ponting,PeterL.Oliver,andWolfReik,2009)42,4.2lncRNA作用机制,43,LncRNA产生位置及作用方式:
(1)在编码蛋白基因的上游启动子区转录,从而干扰邻近蛋白编码基因的表达;
(2)抑制RNA聚合酶,或介导染色质重构和组蛋白修饰,而影响基因表达;
与编码蛋白基因的转录本形成互补双链,进而干扰mRNA的剪切,产生不同的剪切形式;
与编码蛋白基因的转录本形成互补双链,在Dicer酶作用下产生内源性的siRNA,调控基因的表达水平;
(5)结合在特定蛋白质上调节相应蛋白的活性;
(6)作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体;
(7)结合在特定蛋白上从而改变该蛋白的胞质定位;
(8)可作为小分子RNA(如miRNA、piRNA)的前体分子。
lncRNAs促使染色体成核反应并在成核区域聚集大量染色质修饰因子lncRNA在具体染色体位点招募染色质修饰因子单个lncRNA可作为染色质修饰因子的脚手架,改变组蛋白marker通过CTCF形成Higher-order染色质looplncRNA可作为相关蛋白的脚手架,促使核动态组装,NaganoandFraser.,Cell.,2011,ModesoflncRNAActivity,44,lncRNAs通常为长度200个核苷酸的RNA分子。
具有mRNA样结构,经过剪接,具有polyA尾巴与启动子,多数由RNA聚合酶转录,发育过程中有动态的表达与不同的剪接方式,比编码基因可塑性更大。
进化速度快,序列的不保守性与编码基因相比,lncRNA序列保守性差,进化快,但启动子区域相当保守。
同样可以结合转录因子,局部染色质组蛋白同样具有特征性的修饰方式与结构特征。
分析发现,哺乳动物体内lncRNA达1000多种,可通过蛋白质编码序列转变为非编码序列后转录而得到,或由去除了外显子的基因序列转录而来,其表达具有组织和时空特异性。
与编码蛋白质的基因相比,lncRNA序列的保守性较差。
相比蛋白编码基因,更严格的功能限制大多数的lncRNAs在组织分化发育过程中,都具有明显的时空表达特异性,如有人针对小鼠的1300个lncRNAs进行研究,发现在脑组织中的不同部位,lncRNAs具有不同的表达模式。
45,4.3.lncRNA作用特点,46,种类、数量、功能都不明确在20世纪80年代,人们首次鉴定出lncRNAs。
当前人们已经在多种哺乳动物组织中研究了大约100种lncRNAs。
虽然近年来关于lncRNA的研究进展迅猛,但是绝大部分的lncRNA的功能仍然是未知的。
lncRNA在多个水平上参与调控lncRNA可通过多种途径、在多个水平调节基因的表达。
lnc可通过干扰转录因子与启动子结合、诱导组蛋白修饰和使染色质发生重构等方式直接抑制邻近蛋白编码基因表达,且lncRNA转录停止后抑制作用依然存在。
lncRNA作为重要的调节因子与靶蛋白结合后影响基因转录,lncRNA可募集聚梳(polycombgroup,PcG)蛋白、胸板(trithoraxgroup,TrxG)蛋白至目的基因,抑制或激活目的基因的表达。
同时有研究显示,lncRNAMR可募集组蛋白甲基转移酶G9a使启动子区组蛋白甲基化,引起转录沉默。
lncRNA可通过与蛋白结合伴侣作用或调节蛋白的亚细胞定位影响蛋白活性。
随着研究的推进,各类lncRNA的大量发现,lncRNA的研究将是RNA基因组研究非常吸引人的一个方向,使人们逐渐认识到基因组存在人类知之甚少的“暗物,质”。
A:
与蛋白作用B:
与DNA作用C:
结构特点,基因组预测构建cDNA文库过表达技术siRNA介导的基因沉默技术,4.4LongncRNAs的研究方法,47MechanismsoflncRNAfunction(Kungetal,2013),随着研究的推进,各类lncRNA的大量发现,lncRNA的研究将是RNA基因组研究非常吸引人的一个方向,使人们逐渐认识到基因组存在人类知之甚少的“暗物质”。
48,4.5当前lncRNA的研究重点主要有:
49,lncRNA的分类。
目前定义lncRNA仅仅是靠非编码RNA的长度(200bp),这种定义显然十分粗糙。
目前研究表明lncRNA功能繁多,多种多样,因此,准确的对lncRNA进行分类对于理解lncRNA具有重要意义。
lncRNA的识别和鉴定。
人类基因组有多少lncRNA?
他们都在什么位置?
序列为什么?
这些问题的解答是我们深入研究lncRNA的基础。
lncRNA和其他生物元素的相互作用的系统生物学研究。
任何事物都不是孤立的,lncRNA也一样,其发挥作用,一定会和其他生物元素相互作用,比如蛋白质,比如DNA,比如microRNA。
这些分子之间如何协调作用也将是研究的重点。
lncRNA在重大疾病发生发展中的作用,lncRNA作为疾病分子标记物和药物靶点的潜力研究。
WeiW,Cell,2012,diRNAs大小为21个核苷酸,在拟南芥和人类细胞中都存在,是DSB修复必需的小分子,小分子RNA可以特异性地从DNA双,链断裂位点的邻近序列产生。
其他sRNA-diRNAs,很多研究表明DSB的发生能触发断裂DNA周围组蛋白的一系列修饰,这些组蛋白修饰可以帮助DSB的有效修复。
推测diRNAs可能作为向导分子,通过其结合的蛋白AGO2,特异性地招募组蛋白修饰酶类或染色质重塑复合体至DSB位点,通过对DSB周围染色质进行修饰从而促进DSB的修复。
diRNAs的另一种可能作用机理是diRNA/AGO2复合体直接与DSB修复蛋白互作并将其招募至DSB位点介导修复.diRNA的产生依赖于PI3激酶ATR,RNA聚合酶IV和DC(Dicer-like),其产生后被AGO2蛋白招募而起作用(WeiW,Cell,2012),50,其他sRNA-piRNAs,51,2006年发现了一类新型的非编码小分子RNA。
该类小分子RNA能够与Piwi蛋白相互作用影响哺乳动物精子的形成与发育,因此科学家将这群新发现的小分子RNA命名为piRNAs(PIWI-interactingRNA),piRNAs的核苷酸长度为2631nt,与miRNAs和siRNAs明显不同。
piRNAs,即重复序列相关小干扰RNA前体由重复元件编码的,大部分都是转座子或反转座子序列,编码的小RNA没有发夹结构,研究发现,rasiRNA在异染色质重塑,稳定方面起作用。
(Rasi-RNAsarecalledpiRNAsince2007),近几十年的研究发现,生物编码生命活动信息的复杂程度远不是中心法则可以简单解释的。
52,过去被认为是“垃圾”或“噪音”的那些非编码RNA,实际上参与了从染色质结构变化,转录启动调节,转录后加工修饰到引导蛋白质识别绑定位点,以及细胞核内外信号交流等等几乎各个层次的细胞生理活动。
事实证明,非编码RNA不仅具有重要的生物学功能,而且该研究领域也正成为生物科学研究中的热点,唤起了科学家们对“RNA世界”的重视。
总结:
非编码RNA代表了几乎所有复杂生物基因组的主要产物,很多的非编码RNA具有重要生物学功能,发现和阐明新的非编码RNA的功能是目前研究的重点,相关研究也正成为生物科学研究中的热点领域,重新唤起了科学家们对“RNA世界”的重视及对“生命起源于RNA分子”这一命题的兴趣。
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