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格式用HPLC法的从中药中筛选血管紧张素转化酶抑制剂
用HPLC法从中药中筛选血管紧张素转化酶抑制剂
天然产物研究与开发NatProdResDev2008,20:
728-730,755
文章编号:
1001—6880(2008)04-0728-04
用HPLC法从中药中筛选血管紧张素转化酶抑制剂
洪韫嘉,肖晓峰,陈波,姚守拙
湖南师范大学化学生物学及中药分析省部共建教育部重点实验室,长沙410081
摘要:
本文发展了一种从中药中筛选血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂的高效液相色谱法.以马尿酰一组氨酰一
亮氨酸为反应底物,人体血浆中内生的ACE作为反应用酶,反应所生成的马尿酸为检测指标,未加酶抑制剂的
反应为空白对照.用阳性药物卡托普利对本方法进行了验证.应用本方法对中药提取物进行了ACE抑制活性
的筛选,其中地龙的ACE抑制活性最强,其Ic卯值为2.57mg/mL.用HPLC法筛选中药ACEI且有很好的精密
度和准确性.
关键词:
血管紧张素转化酶;抑制剂;高效液相色谱;中药提取物
中图分类号:
R284.2;Q946.91文献标识码:
A
ScreeningofAngiotensin—convertingEnzymeInhibitorsin
TraditionalChineseMedicinebyHPLC
HONGYun-jia,XIAOXiao—feng,CHENBo,YAOShou—zhuo
KeyLaboratoryofChemicalBiology&TraditionalChineseMedicineResearch.
MinistryofEducation,HunanNormalune,Changsha410081,China
Abstract:
Amethodforscreeningangiotensin—conveningenzyme(ACE)inhibitorsfromtraditionalChinesemedicineby
HPLChasbeenimproved.TakingN—hippuryl—His—LeutetrahydrateandendogenousACEinhumanplasmaassubstrate
andcatalystrespectively,insituhippuricacidisquantitatedasanalyticalindexwiththereactionwithoutaddinginhibi—
totsasablankcontro1.ThesensitivityofthemethodWastestedbydeterminationofthecompetitiveinhibitorcaptopril.
ExtractionoftraditionalChinesemedicineforangiotensin—conveningenzymeinhibitorswasscreenedbythismethod.Ex—
tractionofthelowestIC50valueswas2.57mg/mLfromPheretima.Thepresentapproachhasgoodprecisionandaccura—
cy-
Keywords:
angiotensin—conveningenzyme;inhibitor;HPLC;extractionoftraditionalChinesemedicine
血管紧张素转化酶(angiotensin2convertingen
zyme,简称ACE)是肾素一血管紧张素系统的重要酶
类,其作用主要使血管紧张素I水解并转化为血管
紧张素Ⅱ,后者是维持血压的重要因子,血管紧张素
转化酶活性升高导致血管紧张素Ⅱ的生成增加以及
钝化缓激肽均是高血压的主要诱因卫].抑制ACE
活性并以此筛选ACE抑制剂是研究和评价降压药
物的重要方法.目前,对ACE抑制活性的检测主要
有分光光度法和高效液相色谱法(HPLC)E24].
前者与后者相比操作复杂准确性低.这些方法选用
的ACE一般从兔肺中制得,而实验室自制兔肺ACE
工作量大,难以保障酶的活力,从国外进口费用高,
收稿日期~2007-04-20接受日期:
2007-06-25
基金项目:
”973”“中药药性成因研究”课题(2006CB504701)
$通讯作者Tel:
86-7314865515
增加了实验成本.为解决这一问题,本文以人类空
白血浆作为ACE的来源,建立了HPLC检测ACE抑
制活性的方法,并将此法用于传统中药的筛选.我
国许多传统中药对治疗高血压等心血管疾病已有很
好的疗效,但从中药中筛选ACEI的文献报道不多,
因此,本文希望为从中药中筛选出ACEI做一些前
期的工作.
1材料与方法
1.1材料与仪器
卡托普利(>99%)和马尿酸(>99%)标准品
均购于中国生物药品鉴定所;马尿酰一组氨酰一亮氨
酸(N—hippuryl,His—Leutetrahydrate,简称HHL)购于
Sigma公司;地龙,黄芪,瞿麦,山栀子,茜草,丹参购
于长沙市麓谷大药房;色谱纯乙睛购于Tedia公司;
其他试剂均为国产分析纯;水为实验室自制双蒸水;
洪韫嘉等:
用HPLC法从中药中筛选血管紧张素转化酶抑制剂729
肝素抗凝的新鲜血浆由长沙中心血站提供,使用前
置于4O℃冰箱中保存.
银河501型超级恒温器(中国重庆);ZK一82B
型真空干燥箱(中国上海);Eppendorf5804RMulti—
purpose高速低温离心机(美国纽约);岛津10AD高
效液相色谱仪(配有ShimadzuLC—solution工作站);
岛津10AVP紫外检测器.
1.2实验方法
1.2.1色谱条件
采用ODS—C分析色谱柱(250mmx4.6I13In,5
m,大连江申分离科学技术公司),检测波长设为
228nm,柱温室温;流动相(0.1%甲酸,0.1%三乙
胺)水:
(O.1%甲酸,0.1%三乙胺)乙腈=78:
22.
1.2.2试剂的配置
HHL溶液:
取HHL适量,以0.1mol/L硼酸缓
冲液(pH=8.3,含0.3mol/LNaC1)配成4.0retool/
LHHL溶液
卡托普利溶液:
按所需浓度,取适量卡托普利样
品,用0.1mol/L硼酸缓冲液(pH=8.3,含0.3mol/
LNaC1)溶解,再用同种缓冲液稀释到所需浓度.
马尿酸标准液:
取马尿酸标准品适量用双蒸水
配制成不同浓度的马尿酸标准液.
中药提取物溶液:
将以上中药粉碎,以1:
10(W:
v)的比例加入双蒸水,水浴回流2h,离心后过滤,
保留清液,继续向残渣中加入同样量的双蒸水,平行
提取三次,合并滤液,水浴蒸干.用0.1mol/L硼酸
缓冲液(pH=8.3,含0.3mol/LNaC1)溶解蒸干后
的各中药提取物,并用同种缓冲液稀释到所需浓度.
1.2.3ACEI活性的检测
HHL溶液与空白血浆反应的总体积为100.
空白对照组的组成为:
50LHHL溶液,2OL缓冲
溶液和5OL空白血浆;对应实验组的组成为:
5O
IxLHHL溶液,2OL抑制剂溶液(卡托普利或中药
提取物溶液),5OL空白血浆.在37℃恒温水浴
中反应40rain后,加入120IxL乙腈终止反应,震荡
10S后,离心10rain(10000rpm),取上清液进样lO
L.
1.2.4测定原理
HHL和ACE恒温水浴时,能在ACE的催化下
水解生成马尿酸.实验组的ACE活性受到ACEI的
抑制作用要比对照组生成的马尿酸的量要少.因
此,可以通过检测马尿酸的生成量来评价ACEI对
ACE活性的抑制率.计算公式为:
R=(1一B/A)X100%
式中,为ACEI样品对ACE活性的抑制率,A
为对照组生成马尿酸的峰面积,B为实验组生成马
尿酸的峰面积.
2结果与讨论
2.1HPLC法分析
在1.2.1的条件下,ACE活性抑制反应体系的
HPLC色谱图如图1所示,在8rain中之内反应底物
HHL和反应产物马尿酸得到了完全的基线分离.
这比文献4.上所报道的时间缩短,可相对快速地用
于ACEI筛选.图1a空白对照与图1b实验对照相
比,生成的马尿酸峰面积明显减小,说明加入抑制剂
后,ACE的活性受到了抑制.
175
150
125
>1OO
E75
5O
25
0
0.01.02.03.04o5.06.07.08.00,01.02.03.04.05.06.07.08,0
rainrain
图1HPLC测定反应体系的色谱图
Fig.1ThechromatogramsofreactiondeterminedbyHPLC
Mobilephase:
aeeonitrile—distilledwater(22:
78,v/v),botheontai—
ning0.1%formicacidand0.1%triethylamine;flowrate:
1mL/
min;detection:
228nm.
2.2校准曲线以及检测限
在0.01~0.5mmol/L范围内,马尿酸的峰面积
Y与浓度x(o.01~0.5mmol/L)的线性回归方程为:
Y=1.0118XlO+6132,r=0.9998,说明马尿酸的
浓度与检测出的峰面积成线性关系,因此可以用
表1空白组反应液中马尿酸的回收率(n=9)
Table1Recoveriesofhippuricacidinblankreaction(n=9)
730天然产物研究与开发
HPLC外标法来对马尿酸进行定量检测;将马尿酸
进行稀释,得出马尿酸的最低检测限为10p~mol/L
(S/N=3).
2.3方法的精密度与准确性
在未经反应的对照组溶液中,分别加入浓度为
0.01,0.1,0.5mmol/L的标准马尿酸溶液,再按
1.2.3的方法处理样品,通过检测并计算马尿酸的
平均回收率来考察该方法处理样品的准确性,结果
如表1所示.马尿酸的回收率在95.8—105.0之
间,相对标准偏差(RSD)为1.82%(=9).
将对照组反应液中马尿酸的峰面积重复测定6
次,其RSD为1.82,说明本方法精密度良好.
2.4卡托普利对ACE抑制活性的检测
用1.2.3的方法对不同浓度的卡托普利标准液
进行检测,其结果如图2所示.随着卡托普利浓度
的不断提高,对ACE的抑制率也呈上升趋势,经计
算其Ic.值为24.31nmoVL.不同文献报道卡托普
利对ACE的活性抑制率是不同的J,其Ic.值范围
在7.5×10.一2.2×10一mol/,L之间,本方法所得到
的卡托普利的Ic.值也在这个范围之内,说明本方
法具有可行性.
表2中药提取物溶液的Ic.值
Table2TheIC5ovaluesoftraditionalChineSemedicineextracts
提取物
Exffact
Ic50值
IC5Ovalue
地龙
丹参
山栀子
瞿麦
黄芪
茜草
2.57
33.32
33.19
36.42
59.31
52.99
3结论
国内目前对ACE活性的检测,ACE的来源主要
有两种,或是由国外进口,或是从动物组织中自制.
从国外进口一般费用较高,实验室自制需要很大的
工作量,并且还很难保证ACE的活性.人类的空白
血浆易得,费用低,用HPLC对反应体系进行分析,
操作简单,速度快,准确性高.用本方法对强抑制剂
卡托普利进行了检测,得出抑制活性的Ic.值与文
献值相近J,说明本方法具有一定的可行性,可用
于ACEI的筛选.
本文对几种中药提取物进行了ACE活性的初
步筛选,山栀子,瞿麦,黄芪和茜草对ACE的抑制活
性还是首次报道,其结果可以证实这几种中药都对
ACE活性都具有抑制作用,因此从中药中筛选
ACEI是很有意义的,一方面可以从抑制ACE活性
的角度探讨中药的降压机理,另一方面还可以为开
发新型的ACEI类降压药物奠定基础.
一
图2不同浓度卡托普利对ACE抑制曲线参考文献
Fig.2InhibitionofACEbycaptoprilatdifferntconcentration’.
2.5中药提取物对ACE抑制活性的检测
几种中药提取物溶液对ACE的抑制活性的
Ic.值如表2所示.高小平等报道丹参对ACE抑
制活性的主要有效成分是丹酚酸B,而其他中药对
ACE的抑制作用还是初次报道.其中山栀子,瞿麦
与丹参提取物的Ic.值比较接近,因此有必要对这
两种中药进行更深入的研究.大量文献报道了
地龙的降压功效,但其降压机理还不十分明确,耿秀
芳仅做了地龙低温水浸液对ACE活性的抑制率,
没有给出抑制活性的Ic.值.本文检测出地龙提取
物的Ic.值为2.57mg/mL,这一值比某些蛋白酶解
物的Ic.值还要低¨,因此可以说明在地龙提取物
中含有很强的ACEI.
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