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多糖提取实验综述
综述
摘要:
一、什么是多糖
多糖(polysaccharide)是由糖苷键结合的糖链,至少要超过10个以上的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物,可用通式(c6h10o5)n表示。
多糖不是一种纯粹的化学物质,而是聚合程度不同的物质的混合物。
二、多糖的结构
多糖(polysaccharide)是由多个单糖分子缩合、失水而成,是一类分子机构复杂且庞大的糖类物质。
凡符合高分子化合物概念的碳水化合物及其衍生物均称为多糖。
多糖
多糖在自然界分布极广,亦很重要。
有的是构成动植物骨架结构的组成成分,如纤维素;有的是作为动植物储藏的养分,如糖原和淀粉;有的具有特殊的生物活性,像人体中的肝素有抗凝血作用,肺炎球菌细胞壁中的多糖有抗原作用。
多糖的结构单位是单糖,多糖相对
分子质量从几万到几千万。
结构单位之间以苷键相连接,常见的苷键有a-1,4-、p-1,4-和a-1,6-苷键。
结构单位可以连成直链,也可以形成支链,直链一般以al,4-苷键(如淀粉)和(3-1,4-苷键9如纤维素)连成;支链中链与链的连接点常是a-1,6-苷键。
由一种类型的单糖组成的有葡萄糖、甘露聚糖、半乳聚糖等,由二种以上的单糖组成的杂多糖(heteropolysaccharide)有氨基糖的葡糖胺葡聚糖等,在化学结构上实属多种多样。
就分子量而论,有从0.5万个分子组成的到超过106个的多糖。
比10个少的短链的称为寡糖。
不过,就糖链而论即使是寡糖,在寡糖上结合了蛋白质和脂类的,就整个分子而论,如果是属于高分子,则从广义上来看也属于多糖,因此特称为复合多糖(conjugatedpolysaccharide,complexpoly-saccharide)或复合糖质(glycoconjugate)(糖蛋白、糖脂类、蛋白多糖)。
[1]
三、多糖的功能
通常具有贮藏生物能和支持结构的作用。
不均一多糖通过共价键与蛋白质构成蛋白聚糖发挥生物学功能,如作为机体润滑剂、识别外来组织的细胞、血型物质的基本成分等。
多糖类化合物广泛存在于动物细胞膜和植物、微生物的细胞壁中,是由醛基和酮基通过苷键连接的高分子聚合物,也是构成生命的四大基本物质之一。
细胞膜和细胞壁的多糖成份不仅是支持物质,而且还直接参与细胞的分裂过程,在许多情况下成为细胞和细胞,细胞和病毒,细胞和抗体等相互识别结构的活性部位。
生物合成通常是由结合在细胞膜质(高尔基体、原生质膜、粗面内质网等)上的转糖基酶进行,利用各种糖苷作为前体。
在细菌细胞壁和聚多糖的生物合成中,多萜醇衍生物(特别是称为细菌萜醇的)作为中间体参与反应。
另一方面,在分解过程中,有对糖链的糖排列次序和键的性质有特异性的多种糖苷酶参与。
动物细胞中则多以溶酶体系统的酶存在。
此外,常能看到因缺损这些酶中的某种所导致的遗传病。
这是显示多糖代谢重要性的典型例子。
⑴
20世纪50年代发现真菌多糖具有抗癌作用,后来又发现地衣、花粉及许多植物均含有多糖类化合物,并进行分离提纯,确定了其化学结构、物理化学性质、药理作用,尤其对多糖类化合物的抗肿瘤和免疫增强作用进行深入研究。
四、多糖的性质
多糖无甜味,在水中不能形成真溶液,只能形成胶体,无还原性,无变旋性,但有旋光性。
五、多糖的提取方法(柚子皮)
1、试验目的
通过本试验,掌握多糖的性质,测定方法的基本原理,熟悉S54紫外可见分光光度计,KQ5200超声波清洗器的使用方法。
2、试验原理
植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚
糖。
苯酚法测定可溶性糖的原理是:
糖在浓硫酸作用下,脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物,在10-100mg
范围内其颜色深浅与糖的含量成正比,且在485nm波长下有最大吸
收峰,故可用比色法在此波长下测定。
苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定,方法简单,灵敏度高,实验时基本不受蛋白质存在的影响,
3、设备
3.1试剂:
葡萄糖,苯酚,碳酸氢钠,浓硫酸,乙醇等。
3.2仪器:
粉碎机、S54紫外可见分光光度计,电子分析天平,KQ5200超声波清洗器。
3.3提取:
称曲=取粉碎饮片20.0027g,加入300ml蒸馏水浸泡
4h,加热回流提取2次(300|次),1.5h|次。
合并水提液,过滤减压浓缩至100ml,静置,离心,上清液减压浓缩至100ml,再向其中加入3倍量95%的乙醇,于4度冰箱中静置18h,离心弃上清液,收集白色沉淀物,冷冻干燥,得粗多糖。
4多糖含量的测定
4.15%苯酚试剂的配制
取苯酚100.0422g,加铝片0.1057g和NaHCO30.0499g,常压蒸馏,收集182度馏分,称取7.5g,加水150ml溶解,置棕色瓶内放冰箱备用。
4.2葡萄糖标准液储备液的配制
精确称取150度干燥恒重的葡萄糖50.00mg,加适量水溶解,转移至50ml容量瓶中,加水至刻度,摇匀配成浓度为1mg|ml葡萄
糖标准储备液备用。
4.3标准曲线的制备
葡萄糖标准储备液1mg|ml,移取0,0.5,1.0,2.0,
3.0,4.0,5.0,6.0ml分别定容于50ml容量瓶中,制备成标准使用溶液,分别取1ml标准使用溶液置试管中,加入1ml5%苯酚溶液,迅速加入5ml浓硫酸,振荡放置15min,置于沸水浴中加热30min,冷水冷却至室温。
用紫外分光光度计测定吸光度A,以吸取光度对浓度做图校准曲线,计算回归方程。
4.4最大吸收波长的选择
精密移取1ml|ml,葡萄糖标准液3ml,加入1ml5%苯酚溶液,迅速加入5ml浓硫酸,振荡,放置15min,置于沸水浴中加热30min,冷却至室温,采用蒸馏水同法做空白参比溶液,分别在480,485,495,500nm处测定吸收光度,绘制曲线,找出最大吸收波长。
4.5换算因子的测定
取粗多糖样品10mg置100ml容量瓶中,加蒸馏水稀释摇匀,精密吸取1ml于50ml的容量瓶中,加入1ml5%苯酚溶液,迅速加入5ml浓硫酸,振荡摇匀放置15min,置于沸水浴中加热30min,冷却至室温,采用水同法做空白参比溶液。
于490nm处比色测定吸光度
A,利用公式f=w|c*d计算换算因子(w为多糖含量mg,c为多糖稀释
液中葡萄糖浓度mg|ml,d为多糖的稀释因素)
4.6样品溶液的配制
精密称取柚子皮粉末20.0027mg,用80%的乙醇浸泡24h,回流提取1h,抽滤弃去滤液,洗涤后连同滤纸于烧杯中加热蒸馏水,在沸水浴回流1h,过滤反复洗涤,合并滤液定容于100ml的容量瓶中,移取1ml,溶液与试管中备用如2.4方法进行操作,记录吸光度的值。
再由下式计算柚子皮中多糖的含量:
多糖的含量(%)=CDf|W(C为样品中葡萄糖的含量,D为样品的稀释因素,f为换算因子,W为样品质量)。
4.7稳定性试验
精密吸取样品,按照2.4方法分别于0,0.5,1.0,1.5,2.0H通过标准曲线的方法测定吸光度A,并记录。
4.8精密度试验
精密吸取同一样品,按照2.4方法重复测定吸光度6次,记录吸光度A数值并计算。
5试验结果
5.1最大吸收波长的测定
通过紫外分光光度计进行扫描后,以选择波长为横坐标,以吸光度为纵坐标绘制曲线,确定最佳吸收波长为490nm,
5.2标准曲线的绘制
通过紫外分光光度计测定,对葡萄糖溶液含量(X)和吸光度(Y)进行回归处理,得到回归方程为y=10.97x+0.1082,R=0.9969。
表明
在0—6ml范围内葡萄糖的含量和吸光度成良好的线性关系。
5.3换算因子计算结果
通过标准曲线的方法测定吸光度,从回归方程计算换算因子样
品中葡萄糖的含量,利用公式f=w|c*d=0.21。
5.4样品多糖的含量计算结果
通过标准曲线的方法测定吸光度,测得的吸光度值带入回归方程算出柚子皮中葡萄糖含量,得出柚子皮中粗多糖的含量(%)
二CDf|W=2.71%
5.5稳定性试验
柚子皮多糖的稳定性试验表明,在2h测得,吸光度A值无明
显变化,RSD=0.26%,稳定性较好。
五、多糖的测定
植物体内的碳水化合物营养状况以及农产品的品质性状,常以可
溶性糖和淀粉的含量作为重要指标,本实验学习几种定量测定可溶性糖和淀粉的方法。
(一)苯酚法测定可溶性糖
【实验原理】植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。
苯酚法测定可溶性糖的原理是:
糖在浓硫酸作用下,脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物,在10
-100mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比,且在485nm波长下有最大吸收峰,故可用比色法在此波长下测定。
苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定,方法简单,灵敏度高,实验时基本不受蛋白质存在的影响,并且产生的颜色稳定160min以上。
【实验仪器及试剂】1.仪器:
分光光度计、电炉、铝锅、20mL刻度试管、刻度吸管、记号笔、吸水纸适量。
2.试剂:
(1)90%苯酚溶液:
称取90g苯酚(AR),加蒸馏水10mL溶解,在室温下可保存数月。
(2)9%苯酚溶液:
取3mL90%苯酚溶液,加蒸馏水至30mL,现配现用。
(3)浓硫酸(比重1.84)。
(4)1%蔗糖标准液:
将分析纯蔗糖在80C下烘至恒重,精确称取1.000g。
加少量水溶解,移入100mL容量瓶中,加入0.5mL浓硫酸,用蒸馏水定容至刻度。
(5)100ug/L蔗糖标准液:
精确吸取1%蔗糖标准液1mL加入100mL容量瓶中,加水定容。
【实验步骤】1.标准曲线的制作:
取20mL刻度试管11支,从0-10分别编号,按表27-1加入溶液和水,然后按顺序向试管内加入1mL9%苯酚溶液,摇匀,再从管液正面以5-20s。
加入5mL浓硫酸,摇匀。
比色液总体积为8mL,在恒温下放置30min。
显色。
然后以空白为参比,在485nm波长下比色测定,以糖含量为横坐标,光密度为纵坐标,绘制标准曲线,求出标准直线方程。
2.可溶性糖的提取取新鲜植物叶片,擦净表面污物,剪碎混匀,称
取0.10-0.30g,共3份,分别放入3支刻度试管中,加入5-10mL蒸馏水,塑料薄膜封口,于沸水中提取30min(提取2次),提取液过滤入25mL容量瓶中,反复冲洗试管及残渣,定容至刻度。
3.测定吸取0.5mL样品液于试管中(重复2次),加蒸馏水1.5mL,同制作标准曲线的步骤,按顺序分别加入苯酚、浓硫酸溶液,显色并测定光密度。
由标准线性方程求出糖的量,按下式计算测试样品中糖含量。
(二)蒽酮法测定可溶性糖
【实验原理】糖在浓硫酸作用下,可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛,生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物,在一定范围内,颜色的深浅与糖的含量成正比,故可用于糖的定量。
该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物,不但可以测定戊糖与己糖,而且可以测所有寡糖类和多糖类,其中包括淀粉、纤维素等(因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应X所以用愈酮法测出的碳水化合物含量,实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。
在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下,用意酮法可以一次测出总量,省去许多麻烦,因此,有特殊的应用价值。
但在测定水溶性碳水化合物时,则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中,不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与意酮试剂发生反应而增加了测定误差。
此外,不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同,果糖显色最深,葡萄糖次之,半乳糖、甘露糖较浅,五碳糖显色更浅,故测定糖的混合物时,常因不同糖类的比例不同造成误差,但测定单一糖类时,则可避免此种误差。
糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为630nm,故在此波长下进行比色
实验仪器及试剂】1.仪器:
分光光度计、电炉、铝锅、20ml刻度试管、刻度吸管、记号笔、吸水纸适量。
2.试剂:
(1)蒽酮乙酸乙酯试剂:
取分析纯蒽酮1g,溶于50mL乙酸乙酯中,贮于棕色瓶中,在黑暗中可保存数周,如有结晶析出,可微热溶解。
(2)浓硫酸(比重1.84)
【实验步骤】1.标准曲线的制作:
按方法一标准曲线的制作方法加入标准的蔗糖溶液,然后按顺序向试管中加入0.5mL蒽酮乙酸乙酯试剂和5mL浓硫酸,充分振荡,立即将试管放入沸水浴中,逐管准确保温1min取出后自然冷却至室温,以空白作参比,在630nm波长下测其光密度,以光密度为纵坐标,以糖含量为横坐标,绘制标准曲线,并求出标准线性方程。
2.可溶性糖的提取同方法一第二步。
3.显色测定:
吸取样品提取液0.5mL于20mL刻度试管中(重复2次),加蒸馏水1.5mL,以下步骤与标准曲线测定相同,测定样品的光密度。
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