SV40大T抗原对人皮肤成纤维细胞生物学行为的阻碍.docx
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SV40大T抗原对人皮肤成纤维细胞生物学行为的阻碍
SV40大T抗原对人皮肤成纤维细胞生物学行为的阻碍
王新文,金岩,刘源,王军琳,赵宇,董蕊
【关键词】大T抗原
【Abstract】AIM:
ToinvestigatetheroleofSV40largeT(LT)antigenonhumanskinfibroblaststransformationandtoobservethebiologicalalterationofthecells.METHODS:
Humanskinfirbroblastswereculturedandtransfectedwitheukaryoticexpressingplasmidpsv3neowhichcontainingthelargeT.AfterselectionbyG418tostabilizethetransfection,thelargeTmRNAandphenotypicalchangesofthetransformantswereexamined.RESULTS:
LTcDNAtransformedcellcolonieswereisolatedandweresubcultured.LTmRNAexpressedwithinthecytoplasminmosttransformedcellswhendeterminedbyinsituhybridization.Afteraperiodoftime,however,thetransfectedcellsgraduallyenteredcrisisanddied.CONCLUSION:
TheabilityofLTtoenablethenormalhumanskinfibroblastsimmortalizedislimited.SoitisimpossibletoestablishimmortalizedhumanskinfibroblastcelllineonlybylargeT.
【Keywords】SV40;largeTantigen;skin;fibroblasts
【摘要】目的:
研究SV40大T抗原(LT)基因对人正常皮肤成纤维细胞体外转化作用,和转化后细胞生物学特性的改变.方式:
采纳脂质体介导的方式,利用含有LTcDNA的质粒psv3neo转染人正常皮肤成纤维细胞.G418挑选后,挑选阳性克隆扩大培育,观看基因及蛋白在细胞内的表达,和对细胞增殖等生物学特性的改变情形.结果:
分离取得转化细胞克隆,原位杂交显示LTmRNA在转染细胞胞质中表达.免疫组化结果显示,细胞质中有SV40大T抗原表达.细胞计数、BrdU、流式细胞仪检测说明,通过一段时刻的旺盛生长,在转染后第16代,细胞即进入危机期,以一种比衰老细胞更快的速度死亡.结论:
LT能够增进正常皮肤成纤维细胞增殖,但这种能力是有限的,在转染后期乃至会增进细胞死亡.因此要令人的正常皮肤成纤维细胞永生化,单纯利用LT的转染是不够的,还需要结合其它的转化方式.
【关键词】SV40;大T抗原;皮肤;成纤维细胞
0引言
成纤维细胞是皮肤真皮部份的要紧细胞成份,对皮肤起营养、支持和免疫作用.皮肤成纤维细胞作为正常体细胞的一种,生命期有限,通常在40代左右即显现衰老[1],继而增殖缓慢,慢慢死亡.LTcDNA的转染一直是非造血细胞永生化最经常使用的方式.为取得性状稳固、能够长期培育的皮肤成纤维细胞,更好地知足基础研究和相关疾病的医治,咱们预备利用LT能使细胞向永生化趋势转变的特点,应用基因转染技术,研究LT对人皮肤成纤维细胞体外转化作用和转化后细胞生物学特性的改变.
1材料和方式
材料含有LTcDNA的质粒(psv3neo由Berg教授惠赠),皮肤组织(流产胎儿背部),DMEM培育基、胎牛血清(Gibco),LipofectAMINE2000Reagent转染试剂盒(Invitrogen),Biotek凝胶回收试剂盒(Omega),原位杂交标记和检测试剂盒(BoehringerMannheim),SV40大T抗原抗体(SantaCruz),免疫组化检测试剂盒(DAKO),BrdU检测试剂盒(Sigma),EcoRⅠ和PvuⅡ内切酶(Promega).
方式
细胞培育参照鄂征[2]所描述的方式,将真皮成纤维细胞制成细胞悬液后,离心.用含有100mL・L-1胎牛血清的DMEM培育基重悬细胞,按(2~4)×107・L-1细胞密度将成纤维细胞接种到上述培育基中.12h后换1次液体,以后3d换1次液体,观看细胞形态.细胞长到80%后,用g・L-1胰酶消化,按14传代.
质粒转染及细胞克隆的分离将传至第16代的皮肤成纤维细胞,接种到6孔板,每孔细胞数为2×105.第二天进行转染(转染进程按说明书进行).转染后培育24h,细胞接近汇合时,按110密度传代,继续培育.待密度接近50%-70%时,加g・L-1的G418进行挑选,未转染细胞作为对照.6d后,对照细胞全数死亡,将挑选液浓度降至g・L-1,2~3wk显现抗性克隆分离细胞克隆,从头接种培育.别离取未转染和转染细胞进行检测.
mRNA表达检测EcoRⅠ/PvuⅡ双酶切质粒psv3neo后,10g・L-1琼脂糖凝胶电泳后,分离片段,用凝胶回收试剂盒,取得kb大小的LTcDNA,用随机引物法对该片段进行标记.取转染后第3代和第16代细胞爬片,进行原位杂交,检测LTmRNA的表达情形.正常细胞作为阴性对照.
大T抗原检测取转染后第3代细胞爬片,利用免疫组化SABC法进行SV40大T抗原表达检测.步骤按说明书进行.
细胞生长曲线别离取第3,19,32代未转染细胞和转染后第3,16代细胞,按1×103・cm-2的密度接种到24孔板,隔日进行细胞计数.别离取3个孔,取平均数.持续检测5次,绘制细胞生长曲线.
检测别离取第3,19,32代未转染细胞和转染后第3,16代细胞.实验前1d接种细胞到放有玻片的培育板中,持续培育,到细胞密度50%-80%时,吸弃培育液,加入含1mL・L-1BrdU的培育液,继续培育4h,掏出细胞爬片用抗-BrdUmAb检测,每一组取10个标本进行阳性细胞计数,组间进行统计学分析.
流式细胞仪检测别离取第3,19,32代未转染细胞和转染后第3,16代细胞进行检测.用g・L-1胰酶消化细胞,搜集1×105的细胞,离心.1×PBS重悬细胞,离心,750mL・L-1乙醇固定后送检.
2结果
细胞克隆的分离转染了psv3neo质粒的人正常皮肤成纤维细胞,在加G418后第3日开始显现死亡,第6日未转染细胞全数死亡,转染组的阳性细胞继续存活.G418降至g・L-1维持挑选,2wk后显现阳性克隆.滤纸片转移后,进行扩大培育.
光镜观看体外培育的皮肤成纤维细胞光镜下观看(Fig1),正常状态时(第3,19代),细胞体较小,细胞呈梭形,少分支,细胞边缘滑腻.当细胞处于衰老期时(第32代),胞体变大,扁平,分支增多.转化初期(即转染后第3代)的细胞,胞体较正常细胞大、而且长,但较为规那么.转染后第16代的成纤维细胞,胞体细长,常见单支状突起,胞核明显,胞质中颗粒增多.
A:
P3normalfibroblasts;B:
P32normalfibroblasts;C:
P16transformedfibroblasts.
图1相差显微镜下不同时期体外培育的皮肤成纤维细胞(略)
Fig1Skinfibroblastsofdifferentpassageculturedinvitrobyphasecontrastmicroscorpe×100(略)
原位杂交原位杂交检测取得,未转染细胞中无阳性表达,转染后第3,16代细胞胞质蓝色,呈阳性表达,胞核无表达或弱表达(Fig2),说明LTcDNA已被稳固转入成纤维细胞中.
免疫组织化学对转染后第3,16代细胞进行SV40大T抗原检测,胞质均呈棕黄色阳性表达,胞核那么无着色(Fig3).
生长曲线细胞生长曲线显示,正常培育条件下,从第19代开始细胞的增殖速度慢慢变慢,直至第32代左右,细胞已经显现衰老状态.转染后第3代成纤维细胞增殖较快,明显快于同期的未转染第19代细胞,乃至超过了正常第3代成纤维细胞.而转染后第16代成纤维细胞,增殖最为缓慢,速度明显低于与之相对应的未转染第32代衰老细胞,大体处于停滞状态(Fig4).
图2转染细胞原位杂交(略)
Fig2InsituhybridizationoftransfectedcellP3transformedfibroblasts×400(略)
图3转染细胞免疫组化结果(略)
Fig3ResultofimmunocytochemistryoftransfectedcellP3transformedfibroblasts×100(略)
■:
p3transformedcells;▲:
p3normalcells;●:
p19normalcells;○:
p32normalcells;:
p16transformed.
图4成纤维细胞生长曲线(略)
Fig4Growthcurveoffibroblasts(略)
检测细胞增殖活性从强到弱依次为转染第3代细胞、未转染第3代成纤维细胞、未转染第19代成纤维细胞、未转染第32代成纤维细胞和转染第16代成纤维细胞.阳性率别离480±,350±,230±,190±,20±(P<.
流式细胞仪检测反映细胞增殖活力的增殖指数PrI从高到低为转染第3代细胞、未转染第3代成纤维细胞、未转染第19代成纤维细胞、未转染第32代成纤维细胞和转染第16代成纤维细胞(Tab1),与细胞生长曲线、BrdU所反映的结果完全一致.
表1SV40大T抗原对皮肤成纤维细胞增殖周期的阻碍(略)
Tab1SV40largeToncellcycleperiodofskinfibroblasts(略)
3讨论
人的正常皮肤成纤维细胞体外培育时,割裂能力有限,通过必然的时期后,它们就会进入一种生长抑制状态,即所谓的“衰老”(也称M1期)[3].永生化皮肤成纤维细胞的取得,不仅有助于咱们发觉和明白得皮肤肿瘤发生的生物学规律,和细胞的生理、分化机制,还有助于研究皮肤衰老现象发生的机制,为咱们攻克肿瘤,研究干细胞的特性,操纵细胞的增殖分化等许多方面的研究奠定坚实的基础.同时,永生化的皮肤成纤维细胞在体外可多次传代,具有相对稳固的增殖特性和功能状态,将其作为细胞工程和组织工程等研究领域的标准细胞,有助于体外实验的标准化.通过基因转染可使正常哺乳动物细胞长期培育,乃至发生永生化的改变,故该技术被普遍应用于哺乳动物细胞复制和基因表达研究的实验模型.其中SV40,是较为经常使用且有效的体外细胞转化因素之一.SV40是20世纪60年代发觉的一种猴肾细胞病毒,由结构蛋白(VP1,VP2,VP3)和两种抗原LT和st组成[4].其中LT抗原分子分子量为94ku,含708个氨基酸,98%定位于细胞核内,具有ATP酶和DNA解旋酶活性,使蛋白质丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化、ADP核羰基化和乙酰基化.LT抗原还有活化宿主细胞核糖体基因、诱导DNA合成,修饰蛋白质合成起始因子等作用.LT抗原为转化启动所必需的,对转化起决定作用,是非造血细胞永生化最经常使用的成份[5,6].早在1983年,lubbe等[7]选择3例患有LeschNyhan患者的皮肤成纤维细胞培育后,利用SV40大T抗原进行转化,成功将其培育到200代以上.苏映军等[8]用SV40病毒对正常培育的角朊细胞进行永生化工作.但也有研究指出,由LT转染的细胞寿命是有限的,大多数细胞在正常生命期后20~30代内死亡,称之为“危机期”(即M2期)[9-11].还有人将SvtsA58引入已永生化的宫颈癌细胞株时,发觉LT能增进凋亡[12].
本实验利用脂质体介导的基因转染技术,分离取得了由SV40大T抗原转染、增殖较为旺盛的皮肤成纤维细胞.免疫组化及原位杂交证明,转染细胞胞质中有大T抗原及其mRNA的表达,说明LT抗原基因已经稳固转染到了细胞中.细胞生长曲线、BrdU、流式细胞仪的检测都证明了在转染后的一段时刻内,细胞的生长速度明显加速.提示细胞在转染后这一时期内,增殖速度的提高与LT的表达紧密相关.但LT并非能令人正常皮肤成纤维细胞发生永生化改变.在转染后第16代,细胞慢慢进入“危机”状态,停止增殖并显现死亡.说明LT只能发挥短暂的增进成纤维细胞增殖的作用.而同一时期的衰老细胞,仍能以缓慢的速度维持生长,未显现明显的细胞死亡.推测危机的启动可能是由于LT的功能发生了改变,诱导了细胞的增殖抑制,乃至死亡.这一现象是不是与最近几年来研究的与细胞生命周期最为紧密的端粒的转变有必然的关系,仍是存在其他缘故?
有待进一步研究.
永生化的皮肤成纤维细胞系的取得,关于各类皮肤疾病和皮肤组织工程的研究具有重要意义,可是上述研究结果说明要取得永生化的皮肤成纤维细胞,仅仅依托SV40大T抗原的转化是不足的,还需要结合其他的因素,如端粒酶的激活等或开辟其他的途径.
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