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叶绿素实验报告
叶绿素铜钠的合成、分离、分析及结构测定
食品092
一、实验目的:
1、从蚕沙中提取叶绿素并计算提取率。
2、初步研究叶绿素合成叶绿素铜钠的工艺条件。
3、分析叶绿素铜钠产品的纯度并计算其产率。
4、通过试验提高综合能力及练习巩固各种相关操作。
二、产品验收指标
项目和指标
───────────────┬──────────
项目│指标
───────────────┼──────────
pH│9.0~10.7
1%│
E405nm≥│568
1cm│
消光比值│3.2~4.0
总铜(Cu),%│4.0~6.0
游离铜(Cu),%≤│0.025
砷(As),%≤│0.0002
铅(Pb),%≤│0.0005
干燥失重,%≤│4.0
硫酸灰分,%≤│36.0
───────────────┴──────────
三、实验原理:
叶绿素是一种含有卟吩环的天然色素,它与蛋白质结合存在于植物的绿叶和绿色的茎中,是植物进行光合作用所必须的催化剂,叶绿素难溶于水,而易溶于极性有机溶剂。
叶绿素有a和b两种,a为蓝黑色结晶
叶绿素是一种含有卟吩环的天然色素,在叶绿素的结构中,含有一个由四个吡咯环和四个次甲基交替相联形成的卟吩环.卟吩环闭合的共轭体系提供了包围镁离子(或其它相似离子)的刚性平面.
叶绿素的结构如图l所示:
蚕沙中含有丰富的叶绿素,其纯含量达0.8—1.0%,居所有天然色素之首,故可用蚕沙来提取叶绿素,由于叶绿素易溶于乙醚、苯、丙酮、乙醇的脂性溶剂,故可用乙醇、丙酮混合液来提取。
所得的叶绿素由于遇热、光、酸、碱等易分解,且又不溶于水。
110度左右会分解,故把叶绿素制备成叶绿素铜钠,其性质更稳定溶解性也会有所提高。
叶绿素分子中的镁原子和四个吡咯上的氮原子相结合,环上是双羧酸的酯,一个被四所酯化,另一个被叶醇基所酯化,故可以发生皂化反应生成钠盐:
C55H72O5N4Mg+2NaOH=C34H30O5N4MgNa2+CH3OH+C20H39OH
C55H70O6N4Mg+2NaOH=C34H28O6N4MgNa2+CH3OH+C20H39OH
在酸性条件下,叶绿素钠盐分子中的镁极易被氢原子取代生成褐色的叶绿酸:
C34H30O5N4MgNa2+4H+=C34H34O5N4+Mg2++2Na+
C34H28O6N4MgNa2+4H+=C34H32O6N4+Mg2++2Na+
叶绿酸可与铜盐在加热条件下生成叶绿素铜酸析出,将叶绿素铜酸溶于丙酮,再与碱反应生成叶绿素铜钠:
C34H34O5N4+Cu2+=C34H32O5N4Cu+2H+
C34H32O6N4+Cu2+=C34H30O6N4Cu+2H+
C34H32O5N4Cu+2NaOH=C34H30O5N4CuNa2+2H2O
C34H30O6N4Cu+2NaOH=C34H28O6N4CuNa2+2H2O
蚕粪叶绿素铜钠盐的光谱特性蚕粪叶绿素铜钠盐水溶液在360~700之间有2个吸收峰在波长440处有一最大吸收峰,其吸光度为114;在630处有一较小的吸收峰,其吸光度为017"在波长440的吸收峰为叶绿素铜钠盐特有,而在630处的吸收峰为叶绿素特有,叶绿素铜钠盐的含量约是蚕粪中叶绿素含量的2倍,所以试验中均采用440的波长测定叶绿素铜钠盐的稳定性。
下图是蚕粪叶绿素铜钠盐的光谱特性[5]。
四、仪器和试剂
(一)、试剂:
1、蚕沙(50克)2、95%乙醇3、NaOH溶液4、稀盐酸5、丙酮6、石油醚7、CuSO4溶液8、蒸馏水9、40%乙醇(纯乙醇与蒸馏水按2:
3配)10、5%NaOH-乙醇溶液11、pH试纸12、磷酸盐缓冲液(pH=7.5)取0.15mol/L磷酸氢二钠与同浓度的磷酸氢二钾以21:
4混合
(二)、仪器:
A、叶绿素的提取叶绿素铜钠合成
1、温度计1支回流冷凝管1支500ml圆底烧瓶1个
恒温槽1台滤瓶及漏斗1个胶头胶管1个
玻璃棒1支100mL量筒1个铁架台1台电热恒温水浴装置1套
2、减压蒸馏装置1台
3、台氏天平1台
4、PH试纸若干
B、叶绿素铜钠质量分析
1、751分光光度计1台
2、台式天平、分析天平各1台
3、玻棒1支胶头滴管1支10mL、50mL量筒各一个100mL、50mL容量瓶各1个25mL、1mL吸量管各一支
4、试纸若干吸耳球一个
五、实验步骤
(一)叶绿素铜钠的合成
1、叶绿素的提取:
(1)在500ml圆底烧瓶中,先加入50g干蚕沙,再加入95%乙醇100ml。
(2)将反应瓶用水浴加热,使水浴温度在60℃(防止叶绿素a和b分解),浸泡提取2小时,滤出提取液。
(3)按步骤2用乙醇重复2次。
(4)合并3次提取液,在减压、不超过60摄氏度下蒸出乙醇。
趁热倾出瓶中液体,冷却至室温,得到墨绿色膏状物(叶绿素粗品,不宜久置)。
2、皂化:
将浓缩液置于带搅拌子三口烧瓶中,用5%NaOH-C2H5OH溶液调节使其pH=11,用水浴加热在60℃下皂化回流1小时。
3、萃取:
将皂化液冷却后转入分液漏斗加入等量石油醚萃取除去杂质(黄色)静置分层,下层为可溶性叶绿酸盐(绿色),取上层液检验是否完全皂化:
取上层液少许置于小烧杯中,加入2—3倍石油醚静置,用玻棒沾取上层液去试纸上,呈绿色则不完全皂化。
取下层溶液,上层溶液用旋转蒸发器蒸发回收石油醚。
平行萃取3次。
4、调酸铜代:
将下层溶液装入三口烧瓶中,往其中慢慢加入稀盐酸溶液调节pH=7后,加入10%的硫酸铜10ml,搅拌均匀后,再用盐酸将溶液调节pH为2-3,在水浴60℃下保温搅拌1小时。
趁热过滤,用95%乙醇洗涤3次后抽干。
合并滤液和洗液,加入4倍的蒸馏水,析出叶绿素铜,静置过夜后过滤,滤饼依次用适量的纯水、40%乙醇及石油醚洗涤3次至石油醚层变为浅绿色,以除去其中的H+、
及残留的叶黄素和其他有机杂质。
5、成盐:
洗涤结束后滤干,滤饼用丙酮溶解,加入5%NaOH-乙醇溶液,调节pH=11,搅拌,成盐(用滤纸法检验成盐情况:
用玻棒点少许溶液放在滤纸上,滤纸不显绿色则说明完全成盐),将其在60℃下加热蒸发以除去水分得墨绿色结晶物,然后再在60℃下烘箱中烘干结晶物,即制得墨绿色光泽的成品(略有胺味)。
流程图:
溶剂 NaOH溶液不皂化物溶剂酸CuSO4溶液滤渣
↓ ↓ ↑ ↓ ↓↓↓
蚕砂→预处理→浸提→皂化→分离→萃取→调pH值→铜化→过滤→
水稀酒精NaOH
↓ ↓↓
→离析→沉淀→烘干→纯化→成盐→ 过滤→ 干燥→ 成品
(二)、纯度分析:
1、标准叶绿素铜钠盐的标准曲线
称取标准样品0.01克(精确至0.0002克),加水溶解,移入10mL容量瓶中,加水至刻度,摇匀。
准确取1mL溶液以pH=7.5磷酸盐缓冲液定容为100mL,摇匀,即为0.001%溶液,用分光光度计测定,在15分钟内用1cm的比色杯,在405nm波长处测定吸光值(A),以缓冲液作空白对照。
类似地配制0.0005%溶液、0.0015%溶液、0.002%溶液、0.0025%溶液,用分光光度计测定,在15分钟内用1cm的比色杯,在405nm波长处测定它们的吸光值(A),以缓冲液作空白对照,并绘制标准曲线。
2、标准叶绿素铜钠盐的吸收曲线
称取标准样品0.01克(精确至0.0002克),加水溶解,移入10mL容量瓶中,加水至刻度,摇匀。
准确取1mL溶液以pH=7.5磷酸盐缓冲液定容为100mL,摇匀,即为0.001%溶液,此液最大吸收峰为405nm与630nm,吸光比A405nm/A630nm为3.2~4.0。
用分光光度计测定,用1cm的比色杯,在400nm-700nm波长处测定溶液吸光值A(每隔5nm或10nm测定一次),以缓冲液作空白对照,并绘制吸收曲线。
3、产品叶绿素铜钠盐的吸光比测定
称取烘干成品0.01克(精确至0.0002克),加水溶解,移入10mL容量瓶中,加水至刻度,摇匀。
从容量瓶中准确取2mL溶液移入50mL容量瓶,用pH=7.5磷酸盐缓冲液定容至刻度,摇匀,即为0.004%溶液,此液最大吸收峰为405nm与630nm。
用分光光度计测定,用1cm的比色杯,在400nm-700nm波长处测定溶液吸光值A(每隔5nm或10nm测定一次),以缓冲液作空白对照,并绘制吸收曲线。
六、实验现象
试验操作
试验现象
备注
称取蚕沙50g
墨绿色
加入去离子水浸润和95%乙醇
60℃搅拌回流2h
蚕沙部分溶解
抽滤,保存滤液
得到呈墨绿色的液体
剩余蚕沙用95%乙醇再次回流2次
抽滤,混合三份滤液
得到呈墨绿色的液体
提高产率
水浴,减压蒸馏,把合并滤液放入旋转蒸发仪,并在55℃水浴中
加热蒸馏回收95%乙醇
得约50mL左右溶液,溶液成糊状,蒸发液呈无色
防止污染
循环利用
在浓缩液中加5%NaOH-乙醇调PH值到11,在温度为60℃,
皂化时为1h
溶液出现小气泡
皂化过程
皂化后,并洗涤加HCl调,PH=7加入10%CuSO4调PH=2--3,在搅拌下温度60℃,保持1h左右
PH试纸变红色此时慢慢出
现胶状墨色悬浮物
叶绿素铜酸
趁热过滤,滤渣先用水洗去,再用95%乙醇洗涤3次后抽干。
合并滤液和洗液,加入4倍的蒸馏水,静置过夜后过滤
得墨绿色物质
洗涤液呈绿色
固体溶解得绿色液体
得墨绿色粉末
叶绿素铜钠
滤饼依次用适量的纯水、40%乙醇及石油醚洗涤3次,放进烘箱中烘干
石油醚层变为浅绿色
以除去其中的H+
及残留的叶黄素和其他有机杂质。
称取0.010g叶绿素铜钠溶于蒸
馏水配成0.1%溶液,再稀释25倍,测其pH值
除去水分得墨绿色结晶物
略有胺味
结晶物0.0483g
七、实验数据与处理
一、标准叶绿素铜钠盐标准曲线
标准曲线的测定方法:
取标准样品配制0.1%叶绿素铜钠盐溶液,用移液管分别精确量取2.5mL;2.0mL;1.5mL;1.2mL;1.0mL;0.5mL移至5个加入100mL的容量瓶中,向其中各加入pH=7.5的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液,摇匀定容至刻度,即0.0025%;0.002%;0.0015%;0.001%;0.0005%。
以缓冲液作空白对照,分别测以上溶液在波长405nm下的吸光度值A405。
如表1、图1所示。
表1叶绿素铜钠盐标准曲线的测定数据表(光波长405nm)
溶液百分数(%)
0.00050.198
0.0010.362
0.00150.552
0.0020.716
0.00250.924
二、叶绿素铜钠盐的吸收曲线
(一)标准样品:
取标准样品配制0.001%叶绿素铜钠盐溶液,用分光光度计测定,用1cm的比色杯,在400nm-700nm波长处测定溶液吸光值A(每隔5nm或10nm测定一次),以缓冲液作空白对照。
测定数据如表2所示,吸收曲线如图2所示。
表2标准样品叶绿素铜钠盐吸收曲线的测定数据表
波长/nm
350
355
360
365
370
375
380
385
390
吸光度
0.142
0.150
0.157
0.166
0.177
0.197
0.217
0.259
0.292
波长/nm
395
400
405
410
415
420
425
430
435
吸光度
0.327
0.357
0.379
0.377
0.338
0.272
0.213
0.169
0.139
波长/nm
440
445
450
455
460
465
470
475
480
吸光度
0.119
0.104
0.092
0.083
0.074
0.067
0.060
0.055
0.050
波长/nm
485
490
495
500
505
510
515
520
525
吸光度
0.047
0.044
0.042
0.041
0.040
0.039
0.038
0.037
0.037
波长/nm
530
535
540
545
550
555
560
565
570
吸光度
0.038
0.039
0.039
0.039
0.039
0.037
0.036
0.040
0.043
波长/nm
575
580
585
590
595
600
605
610
615
吸光度
0.040
0.042
0.043
0.043
0.043
0.041
0.043
0.046
0.052
波长/nm
620
625
630
635
640
645
650
655
660
吸光度
0.059
0.067
0.071
0.069
0.064
0.057
0.049
0.044
0.039
波长/nm
665
670
675
680
685
690
695
700
吸光度
0.035
0.032
0.029
0.026
0.024
0.021
0.019
0.017
(二)产品:
取产品配制0.004%叶绿素铜钠盐溶液,用分光光度计测定,用1cm的比色杯,在400nm-700nm波长处测定溶液吸光值A(每隔5nm或10nm测定一次),以缓冲液作空白对照。
测定数据如表3所示,吸收曲线如图3所示。
数据记录:
1、产品的质量是0.0483g(借第12组:
冯奕淇和雷春雨的实验结果)
2、产品产率:
W=0.0483/50*100%=0.0966%
3、吸光比=A410nm/A630nm=0.065/0.037=1.8
表3产品叶绿素铜钠盐吸收曲线的测定数据表
波长/nm
350
360
370
380
390
400
410
420
430
吸光度
0.068
0.064
0.060
0.058
0.061
0.062
0.065
0.064
0.057
波长/nm
440
450
460
470
480
490
500
510
520
吸光度
0.051
0.047
0.043
0.039
0.038
0.036
0.035
0.033
0.034
波长/nm
530
540
550
560
570
580
590
600
610
吸光度
0.034
0.034
0.033
0.033
0.032
0.033
0.035
0.035
0.035
波长/nm
620
630
640
650
660
670
680
690
700
吸光度
0.035
0.037
0.037
0.035
0.036
0.035
0.038
0.037
0.035
八、实验分析
本实验所测得的吸光值相对较小,对比于标准的吸光曲线,在波峰(405nm与630nm)处的值仅为0.065和0.037,比标准吸光曲线的值小了4--5倍。
其中的原因可能为:
所制备的产品的原因:
一个原因是产品的纯度较低;二个是可能产品没
有完全烘干,实际用于配制溶液的产品的质量小于称量的质量。
配制溶液的原因:
由于产品纯度较低,所以相应的用于配制溶液的产品的质量也应该增多,而配的溶液的含量较小,这可能就造成了所测得的吸光度较小的原因。
实验失败的原因:
1、蚕沙不过粉碎,可能导致叶绿素溶解不过充分,加乙醇回流时,时间2小时每次,因浸提不充分,浸提时间不够会导致提取率过低。
2、皂化1小时后,用石油醚萃取,上层杂质还是绿色,可能是皂化时间不够,这步导致了大量叶绿素的流失,以致最终产率只有微量而无法配置叶绿素溶液测吸光度。
3、整个实验过程中洗涤与过滤次数较多,而叶绿素盐粘稠易粘附在滤纸上,很不容易取下,且在洗涤过程也有叶绿素盐的损失。
以上两项操作直接影响到产率的高低。
4、调酸铜代这步时,由于保温后趁热过滤时过滤速度比较慢,还没过滤完就用95%的乙醇边洗涤变过滤,乙醇作用是析出叶绿素的,这就导致了大量的叶绿素留在滤渣里,而我们实验要的是滤液。
5、调酸铜代这步时,由于静置过夜后进行减压过滤,由于叶绿素铜分子太小,滤纸并不能完全的保留住其在滤饼里而流失过多,使最终产率很少。
6、在成盐这步时,加入缓冲液调pH时,由于滴加速度控制不好,使pH超过12,后又用稀盐酸调到PH=11.55;成盐时静置半个钟以上不定期检测是否完全成盐,可是用玻棒点些许溶液放在滤纸一直都是显淡淡的绿色,这两方面可能导致成盐效果不好。
这也是产率低的关键因素之一。
九、参考文献:
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化学工业出版社1989.314-315
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