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生物药物分析实验指导
生物药物分析实验指导
药物分析实验指导 玉林师范学院生命科学与技术学院 制药工艺学教研室2012年5月 实验一药物的杂质检查 一、目的 1.了解药物杂质检查的意义。
2.掌握杂质检查的原理和方法。
3.掌握杂质限量的计算方法。
二、实验内容
(一)标准溶液的配制 1.标准氯化钠溶液的制备 称取氯化钠,置1000ml量瓶中,加水适量使溶解并稀释至刻度,摇匀,作为贮备液。
临用前,精密量取贮备液10ml置100ml瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,即得(每1ml相当于10μg的Cl)。
2.标准硫酸钾溶液的制备 称取硫酸钾,置1000ml量瓶中,加水适量使溶解并稀释至刻度,摇匀,即得(每1ml相当于100μg的SO4)。
3.标准铁溶液的制备 称取硫酸铁铵[FeNH4(SO4)2·12H2O],置1000ml量瓶中,加水溶解后,加硫酸,用水稀释至刻度,摇匀,作为贮备液。
临用前,精密量取贮备液10ml,置100ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,即得(每1ml相当于10μg的Fe)。
4.标准铅溶液的制备 称取硝酸铅g,置于1000ml量瓶中,加硝酸5ml与水50ml溶解后,用水稀释至刻度,摇匀,作为贮备液。
临用前精蜜量取贮备液10ml,置100ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,即得(每1ml相当于10μg的Pb)。
配制与贮存用的玻璃容器均不得含有铅。
5.标准砷溶液的制备 称取三氧化二砷,置1000ml量瓶中,加20%氢氧化钠溶液5ml溶解后,用适量的稀硫酸中和,再加稀硫酸10ml,用水稀释至刻度,摇匀,作为贮备液。
临用前,精密量取贮备液1ml,置100ml量瓶中,加稀硫酸1ml,用水稀释至刻度,摇匀,即得(每1ml相当于μg的As)。
(二)氯化钠的杂质检查 1.酸碱度 取本品,加水50ml溶解后,加溴麝香草酚蓝指示液2滴。
如显黄色,加氢氧化钠液(/L),应变为蓝色;如显蓝色或绿色,加盐酸液(/L),应变为黄色。
2.溶液的澄清度 取本品,加水25ml溶解后,溶液应澄清。
3.碘化物 取本品的细粉,置瓷蒸发皿内,滴加新配制的淀粉混合液[取可溶性淀粉, 加水2ml,搅匀,再加沸水至25ml,随加随搅拌,放冷,加硫酸液(/L)2ml,亚硝酸钠试液3滴与水25ml,混匀]适量使晶粉湿润,置日光下(或日光灯下)观察,5分钟内晶粒不得显蓝色痕迹。
4.溴化物 取本品,加水10ml使溶解,加盐酸3滴与氯仿1ml,边振摇边滴加2%氯胺T溶液(临用新制)3滴,氯仿层如显色,与标准溴化钾溶液(精密称取在105℃干燥至恒重的溴化钾,加水使溶解成100ml,摇匀)用同一方法制成的对照液比较,不得更深。
5.硫酸盐 取本品,加水溶解成约40ml(溶液如显碱性,可滴加盐酸使成中性),溶液如不澄清,应滤过,置50ml纳氏比色管中,加稀盐酸2ml,摇匀,即得供试溶液。
另取标准硫酸钾溶液置50ml纳氏比色管中,加水使成约40ml,加稀盐酸2ml摇匀,即得对照溶液。
于供试溶液与对照溶溶中,分别加入25%氯化钡溶液5ml,用水稀释使成50ml,充分摇匀,放置10分钟,同置黑色背景上,从比色管上方向下观察、比较、供试品管浊度不得更浓。
6.钡盐取本品,加水20ml,溶解后,滤过,滤液分为两等份,1份中加稀硫酸2ml,另一份中加水2ml,静置15分钟,两液应同样澄清。
7.钙盐 取本品,加水10ml使溶解,加氨试液1ml,摇匀,加草酸铵试液1ml,5分钟内不得发生浑浊。
8.镁盐 取本品,加水20ml使溶解,加氢氧化钠试液与%太坦黄溶液,摇匀,产生的颜色与标准镁溶液(精密称取在800℃炽灼至恒重的氧化镁,加盐酸与水适量使溶解成1000ml,摇匀),用同一方法制成的对照液比较,不得更深。
9.钾盐 取本品,加水20ml溶解后,加稀醋酸2滴,加四苯硼钠溶液(取四苯硼钠,置乳钵中,加水10ml研磨后,再加水40ml,研匀,用质密的滤纸滤过,即得)2ml,加水使成50ml,如湿浑浊,与标准硫酸钾溶液用同一方法制成的对照液比较,不得更浓。
10.干燥失重 取供试品,混合均匀(如为较大的结晶,应先迅速捣碎,使成2mm以下的小粒)。
分取约lg,平铺在130℃干燥至恒重的扁形称瓶中,厚度不超过5mm,精密称定。
将瓶盖取下,置称瓶旁,或将瓶盖半开,置烘箱内于130℃干燥约2~3小时后,将称瓶盖好,取出,置干燥器中放置40分钟后,精密称定重量。
再按上述方法自“将瓶盖取下?
?
”起,继续干燥1~2小时,依法操作,至恒重为止。
从减失重量和取样量计算供试品的干燥失重(规定不得超过%)。
11.铁盐 取本品,加水溶解成25ml,置50ml纳氏比色管中,加稀盐酸4ml与过硫酸铵50mg,用水稀释成35ml后,加30%硫氰酸铵溶液3ml,再加水适量稀释成50ml,摇匀。
如显色,立即与标准铁溶液用同一方法制成的对照液比较,不得更深。
12.重金属 取本品,加水20ml溶解后,置25ml纳氏比色管中,加醋酸盐缓冲液()2ml与水适量使成25ml,加硫代乙酰胺试液2ml,摇匀,放置2分钟,置白纸上,自上向下透视。
如显色,立即与标准铅溶液用同一方法的对照液比较,不得更深。
13.砷盐 仪器装置:
如图1,A为100ml标准磨口锥形瓶,B为中空的标准磨口塞,上连导气管C(外径,内径),全长约180mm。
D为具孔的有机玻璃旋塞,其上部为圆形平面,中央有一圆孔,孔径与导气管C的内径一致,其下部孔径与导气管C的外径相适应。
将导气管C的顶端导入旋塞下部孔内,并使管壁与旋塞的圆孔恰相吻合,粘合固定,E为中央具有圆孔(孔径)的有机玻璃旋塞盖,与D紧密吻合。
测试时,于导气管C中装入醋酸铅棉花60mg(装管高度约60~80mm),再于旋塞D的顶端平面上放一片溴化汞试纸(试纸大小以能覆盖孔径而不露出平面外为宜),盖上旋塞E并旋紧,即得。
标准砷斑的制备:
精密量取标准砷溶液2ml,置A瓶中,加盐酸5ml与水21ml,再加碘化钾试液5ml与酸性氯化亚锡试液5滴,在室温放置10分钟后,加锌粒2g,立即照上法装妥的导气管C密塞于A瓶上,并将A瓶置25~40℃水浴中,反应45分钟后,取出溴化汞试纸,即得。
检查法,取本品,置A瓶中,加水23ml溶解后,加盐酸5ml,照标准砷斑的制备,自“加碘化钾试液5ml”起,依法操作,将生成的砷斑与标准砷斑比较,不得更深。
(三)蒸馏水的杂质检查1.酸碱度 取本品10ml,加甲基红指示液2滴,不得显红色;另取10ml,加溴麝香草酚蓝指示液5滴,不得显蓝色。
2.氯化物、硫酸盐与钙盐 取本品,分置3支试管中,每管各50ml。
第一管中,加硝酸5滴与硝酸银试液1ml;第二管中,加氯化钡试液2ml,第三管中,加草酸铵试液2ml,均不得发生浑浊。
3.硝酸盐与亚硝酸盐 取本品15ml,加醋酸液(6mol/L)18ml,对氨基苯磺酸-α-萘胺试液2ml,锌粉,摇匀,放置15分钟,不得显粉红色。
4.氨 取本品50ml,加碱性碘化汞钾试液2ml,放置15分钟;如显色,与氯化铵溶液(取氯化铵,加无氨蒸馏水适量使溶解并稀释成1000ml),加无氨蒸馏水48ml与碱性碘化汞钾试液2ml制成的对照液比较,不得更深。
5.二氧化碳 取本品25ml,置50ml具塞量筒中,加氢氧化钙试液25ml,密塞振摇,放置,1小时内 不得发生浑浊。
6.易氧化物 取本品100ml,加稀硫酸10ml,煮沸后,加高锰酸钾溶液(/L),再煮沸10分钟,粉红色不得完全消失。
7.不挥发物取本品100ml,置105℃恒重的蒸发皿中,在水浴上蒸干,并在105℃干燥至恒重,遗留残渣不得超过1mg。
8.重金属 取本品40ml,加醋酸盐缓冲液()2ml,硫代乙酰胺试液2ml,摇匀,放置2分钟,与本品42ml与醋酸盐缓冲液()2ml的混合液比较,颜色不得更深。
三、说明 1.药物杂质检查必须注意按规定的检查条件,严格遵守平行原则。
平行原则是指样品与标准必须在同一条件下进行反应与比较。
即应尽量选择容积、口径和色泽相同的比色管,在同一光源、同衬底上,以相同的方式(一般是自上而下)观察,所加入的试药种类、用量、加入顺序和反应时间等也应一致。
2.杂质限量是指药物中允许存在杂质的最大量。
其定义式为:
杂质限量= 杂质允许存在量供试品量×100% 3.药物的杂质检查是限度检查,合格者仅说明其杂质量在药品质量标准允许范围内,并不说明药品中不含该项杂质。
四、思考题 1.杂质检查的意义是什么?
2.药物中杂质来源主要有哪些途径?
什么是一般杂质?
什么是特殊杂质?
3.药物杂质检查应严格遵循什么原则?
4.试计算出氯化钠中溴化物、硫酸盐、镁盐、钾盐、重金属和砷盐的限量。
5.某一药物取样进行重金属检查,药典规定限量不得超过10ppm,应取多少毫升标准铅溶液?
6.某一药物规定砷盐限量不得超过4ppm,取标准砷溶液2ml对照,问应取供试品多少克?
实验五异烟肼的溴酸钾法含量测定 一、目的要求 1.掌握溴酸钾法测定异烟肼含量的方法。
2.掌握氧化还原滴定法的原理。
二、主要仪器与试剂 25mL滴定管,100mL容量瓶,25mL移液管,研钵,5cm×20cm硅胶G薄层板,层析缸, 1.异烟肼片 2.溴酸钾固体 3.硫代硫酸钠滴定液(/L) 4.丙醇 5.丙酮 6.盐酸 7.乙醇制对二氨基苯甲醛试液 8.甲基橙指示液 9.碘化钾固体 10.稀硫酸 11.淀粉指示液 12.浊度标准贮备液 13.浊度标准原液 14.1号浊度标准液 15.比色用重铬酸钾液 16.比色用硫酸铜液三、实验方法、步骤 异烟肼 本品为4-吡啶甲酰肼。
按干燥品计算,含C6H7N3O应为标示量的%~%。
1.性状本品为无色结晶,或白色至类白色的结晶性粉末;无臭,味微甜后苦;遇光渐变质。
2.检查溶液的澄清度与颜色取本品,加水10mL溶解后,溶液应澄清无色;如显浑浊,与1号浊度标准液比较,不得更浓;如显色,与同体积的对照液比较,不得更深。
游离肼取本品,加水制成每1mL中含50mg的溶液,作为供试品溶液。
另取硫酸肼加水制成每1mL中含的溶液,作为对照溶液。
照薄层色谱法试验,吸取供试品溶液10μL与对照溶液2μL,分别点于同一硅胶薄层板上,以异丙醇-丙酮为展开剂,展开后,晾干,喷以乙醇制对二甲氨基苯甲醛试液,15分钟后检视。
在供试品主斑点前方与硫酸肼斑点相应的位置上,不得显黄色斑点。
干燥失重取本品,在105℃干燥至恒重,减失重量不得过%。
3.含量测定 原理:
取本品20片,精密称定,研细,精密称取适量,置100mL量瓶中,加水适量,振摇使异烟肼溶解并稀释至刻度,摇匀,用干燥滤纸滤过,精密量取续滤液 25mL,加水50mL、盐酸20mL与甲基橙指示液1滴,用溴酸钾滴定液缓缓滴定至粉红色消失。
每1mL溴酸钾滴定液相当于的C6H7N3O。
四、注意事项 1.指示剂褪色是不可逆的,滴定过程中必须充分振摇,以避免滴定剂局部过浓而引起指示剂提前褪色,可补加1滴指示剂以验证终点是否真正到达。
2.过滤前必须充分振摇,使异烟肼完全溶解。
3.过滤用漏斗、烧杯必须干燥,弃去初滤液。
五、思考题 1.写出异烟肼与溴酸钾的滴定反应式和滴定度的计算过程。
2.当游离肼不合格时,对测定有何影响?
实验三附录 1.中国药典2005年版二部附录ⅤB薄层色谱法 薄层色谱法,系将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上,成一均匀薄层。
待点样、展开后,与适宜的对照物按同法所得的色谱图作对比,用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法。
1.仪器与材料
(1)玻板除另有规定外,用5cm×20cm,10cm×20cm或20cm×20cm的规格,要求光滑、平整,洗净后不附水珠,晾干。
(2)固定相或载体最常用的有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254,其次有硅藻土、硅藻土G、氧化铝、氧化铝G、微晶纤维素、微晶纤维素F254等。
其颗粒大小,一般要求直径为10~40μm。
薄层涂布,一般可分无黏合剂和含黏合剂两种,前者系将固定相直接涂布于玻板上,后者系在固定相中加入一定量的黏合剂,一般常用10%~15%煅石膏(在140℃加热4小时),混匀后加水适量使用,或用羧甲基纤维素钠水溶液(%~%)适量调成糊状,均匀涂布于玻板上。
也有含一定固定相或缓冲液的薄层。
(3)涂布器应能使固定相或载体在玻板上涂成一层符合厚度要求的均匀薄层。
(4)点样器同纸色谱法项下。
(5)展开室应使用适合薄层板大小的玻璃制薄层色谱展开缸,并有严密的盖子,除另 有规定外,底部应平整光滑,应便于观察。
2.操作方法
(1)薄层板制备除另有规定外,将1份固定相和3份水在研钵中向一方向研磨混合,去除表面的气泡后,倒入涂布器中,在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布,取下涂好薄层的玻板,置水平台上于室温下晾干,后在110℃烘30分钟,即置有干燥剂的干燥箱中备用。
使用前检查其均匀度。
(2)点样除另有规定外,用点样器点样于薄层板上,一般为圆点,点样基线距底边,样点直径及点间距离同纸色谱法,点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。
点样时必须注意勿损伤薄层表面。
(3)展开展开缸如需预先用展开剂饱和,可在缸中加入足够量的展开剂,并在壁上贴二条与缸一样高、宽的滤纸条,一端浸入展开剂中,密封缸顶的盖,使系统平衡或按正文规定操作。
将点好样品的薄层板放入展开缸的展开剂中,浸入展开剂的深度为距薄层板底边~,密封缸盖,待展开至规定距离(一般为10~15cm),取出薄层板,晾干,按各品种项下的规定检测。
(4)如需用薄层扫描仪对色谱斑点作扫描检出,或直接在薄层上对色谱斑点作扫描定量,则可用薄层扫描法。
薄层扫描的方法,除另有规定外,可根据各种薄层扫描仪的结构特点及使用说明,结合具体情况,选择吸收法或荧光法,用双波长或单波长扫描。
于影响薄层扫描结果的因素很多,故应在保证供试品的斑点在一定浓度范围内呈线性的情况下,将供试品与对照品在同一块薄层上展开后扫描,进行比较并计算定量,以减少误差。
各种供试品,只有得到分离度和重现性好的薄层色谱,才能获得满意的结果。
2.乙醇制对二氨基苯甲醛试液取对二甲氨基苯甲醛1g,加乙醇与盐酸使溶解,再加乙醇至100mL,即得。
甲基橙指示液取甲基橙,加水100mL使溶解,即得。
变色范围~。
3.溴酸钾滴定液(/L) KBrO3= →1000mL 【配制】取溴酸钾,加水适量使溶解成1000mL,摇匀。
【标定】精密量取本液25mL,置碘瓶中,加碘化钾与稀硫酸5mL,密塞,摇匀, 在暗处放置5分钟后,加水100mL稀释,用硫代硫酸钠滴定液(/L)滴定至近终点时,加淀粉指示液2mL,继续滴定至蓝色消失。
根据硫代硫酸钠滴定液(/L)的消耗量,算出本液的浓度,即得。
室温在25℃以上时,应将反应液及稀释用水降温至约20℃。
4.稀硫酸取硫酸57mL,加水稀释至1000mL,即得。
本液含H2SO4应为%。
5.淀粉指示液取可溶性淀粉,加水5mL搅匀后,缓缓倾入100mL沸水中,随加随搅拌,继续煮沸2分钟,放冷,倾取上层清液,即得。
本液应临用新制。
实验六苯甲酸钠的含量测定 一、目的 掌握双相滴定法测定苯甲酸钠含量的原理和操作 二、操作取本品,精密称定,置分液漏斗中,加水约25ml,乙醚50ml与甲基橙指示液2滴,用盐酸滴定液(/L)滴定,随滴随振摇,至水层显持续橙红色,分取水层,置具塞锥形瓶中,乙醚层用水5ml洗涤,洗涤液并入锥形瓶中,加乙醚20ml,继续用盐酸滴定液(/L)滴定,随滴随振摇,至水层显持续橙红色,即得,每1ml的盐酸滴定液(/L)相当于的C7H5O2Na。
本品按干燥品计算,含C7H5O2Na不得少于% 三、说明 1.苯甲酸钠为有机酸的碱金属盐,显碱性,可用盐酸标准液滴定。
COONaCOOH+HCl 在水溶液中滴定时,于碱性较弱(Pkb=)突跃不明显,故加入与水不相溶混的溶剂乙醚提除反应生成物苯甲酸,使反应定量完成,同时也避免了苯甲酸在瓶中析出影响终点的观察。
2.滴定时应充分振摇,使生成的苯甲酸转入乙醚层。
3.在振摇和分取水层时,应避免样品的损失,滴定前,应用乙醚检查分液漏斗是否严密。
四、思考题 1.乙醚为什么要分两次加入?
第一次滴定至水层显持续橙红色时,是否已达终点?
为什么?
2.分取水层后乙醚层用5ml水洗涤的目的是什么?
+NaCl实验七诺氟沙星(氟哌酸)胶囊含量测定 一、目的 1.掌握非水滴定法的原理及操作;2.熟悉非水滴定在药物分析中的应用。
二、操作 1.诺氟沙星的鉴别
(1)取本品内容物适量(约相当于诺氟沙星)置干燥试管中,加丙二酸与醋酐2ml,振摇,并在80-90℃水浴中加热10-15mm,显红棕色。
(2)取本品内容物适量,加%氢氧化物溶液适量,振摇使诺氧沙星溶解,稀释成每1ml中含诺氟沙星5μg,滤过,充去初滤液,取续滤液,在273,325与336nm波长处测定有最大吸收。
2.含量测定精密称取本品内容物适量(约相当于诺氟沙星),加冰醋酸30ml,振摇使诺氟沙星溶解,加橙黄Ⅳ指示液10滴,用高氯酸液(/L)滴定,至溶液显紫红色,并将滴定的结果用空白试验校正。
三、说明 版规定本品含诺氟沙星应为标示量的—%,滴定时,每/L的高氯酸液相当于的C16H18FN3O3。
2./L的高氯酸溶液的配制及标定参见ChP1995版附录。
高氯酸不稳定,注意避光保存。
3.水的体膨胀系数较小,一般酸碱标准溶液的浓度受室温改变的影响不 -30 大。
而多数有机溶剂的体膨胀系数较大,例如,冰醋酸的体膨胀系数为其体积随温度改变较大。
所以高氯酸冰醋酸溶液滴定样品时和标定时温度若有差别,则应重新标定或按下式将标准溶液的浓度加以校正:
C1?
C01?
?
T1?
T0?
式中:
为冰醋酸的体膨胀系数,t0为标定时的温度,t1为测定时的温度,C0为标定时的浓度,C1为测定时的浓度。
4.现行药典对本品含量测定的方法为HPLC法。
四、思考题 非水滴定应用于药物分析有何特点?
哪几类药物适合用非水滴定法测定其含量。
实验八药房制剂的快速检验 一、目的 1.了解快速检验的特点。
2.熟悉容量分析,比色分析在医院药房制剂检验中的应用。
二、实验内容
(一)氯化钠注射液含量的快速检验 精密量取本品10ml,加水40ml,加糊精溶液(1→50)5ml与荧光黄指示液5-8滴,用硝酸银液(/L)滴定,随滴随振摇,至时,应无明显变色,至时,应为微红色,(每/LAgNO3溶液相当于的NaCl)即合格品应耗/LAgNO3溶液的限度为-。
3%硼酸溶液的快速检验 精密量取本品5ml,置25ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,精密量取2ml,加中性甘油5ml,水4ml,酚酞指示液3滴,用氢氧化钠滴定液(/L)滴定,至××ml时,应无明显淡红色;至××ml时,应呈明显淡红色。
5%葡萄糖注射液的快速检验1.旋光法:
精密量取本品适量(约相当于葡萄糖10g),置100ml量瓶中,加氨试液(10%或10%以下规格的本品可直接取样测定),用水稀释至刻度,摇匀,静置10分钟,测定旋光度与相乘,即得供试品量中含有C6H12O6·H2O的重量(g)。
2.碘量法:
精密量取本品2ml,置25ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀。
吸取置碘量瓶中,准确加入碘滴定液(/L)5ml,再分二次加入氢氧化钠滴定液(/L),每次5ml,密塞,振摇约10秒种,加完后,密塞,于暗处放置10分钟,加稀硫酸1ml,用硫代硫酸钠滴定液(/L)滴定,至时,浅黄色不应消失,至时,应为无色溶液。
三、说明 1.为了保证医院药房自配制剂的质量,常采用溶量分析的方法测定制剂中各组分含量,其方法为:
根据各种制剂的处方及上下限要求(一般为±5%),按取样量预先计算出应该消耗标准溶液毫升数的范围,实验时,实际用量在此范围内含量为合格,不必再行计算。
消耗标准溶液毫升数(V)的计算:
V=G/T 下限=V×95% 上限=V×105%G:
供试品中应含被测组分的量,即标示量。
T:
每1ml标准溶液相当于被测组分的重量,即滴定度。
2.硼酸含量测定原理:
C3H5(OH)3+H3BO3→C3H5(OH)HBO3+2H2OKa=×10 Ka=3×10-7 C3H5(OH)HBO3+NaOH→C3H5(OH)NaBO3+H2O 3.葡萄糖含量测定原理I2+2NaOH→NaIO+NaI+H2O -10 CH2OH(CHOH)4CHO+NaIO+NaOH→CH2OH(CHOH)4COONa+NaI+H2O3NaIO(剩余)NaIO3+2NaI NaIO3+6HCl+5NaI→3I2+6NaCl+3H2OI2+2Na2S2O3→2NaI+Na2S4O6 计算公式:
C=100α/[α]d 按药典规定,葡萄糖的[α]tD为~ 四、思考题 1.测定硼酸溶液时,若加NaOH液(/L)至时,呈现明显红色,供试品含量偏低还是高?
对该制剂怎样处理才能得到合格品?
2.今有碘液,浓度为/L,若要配制成/L的碘液100ml应如何制备?
3.述5%葡萄注射液含量测定的原理、条件、并计算供试液消耗标准溶液的上下限范围。
附1中华人民共和国专业标准ZBC10001—10007-8 药品检验操作标准原料药检验报告书 编号:
品名 包装规格 进厂编号 厂牌来源 数量 取样日期 年 月 日取样件数 报告日期 年 月 日 依据 用料车间 检验结果:
判定:
质检科长 复核员 检验员
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