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ELISA检测
ELISA检测
在病原体急性感染的诊断中,通常需检测IgM抗体,如急性甲型肝炎诊断的血清抗HAVIgM检测、急性乙型肝炎病毒感染的血清抗HBclgM检测和TORCH项目的系列IgM检测等。
IgM抗体也有使用间接法测定的,如目前在市场上可见到的有些TORCH系列的IgM检测试剂盒。
在使用间接法测IgM抗体时,由于临床血清样本中含有高浓度的IgG抗体,其中部分特异IgG抗体将与IgM抗体竞争与固相抗原结合,从而干扰IgM抗体的检测。
因此,在使用间接法测定IgM抗体时,通常须将血清样本用抗人IgG抗体或SPA预处理,以去除IgG的干扰。
如此不但测定较为繁琐,而且阻碍测定的特异性和灵敏度。
目前,常用的IgM抗体检测方法为捕捉法,即以抗人IgM抗体(抗人u链)作为固相抗体,当加入血清标本时,其中的IgM类抗体(特异的和非特异的)即可被固相抗体捕捉,再加入特异抗原,其与固相上捕捉的IgM抗体结合后,加入酶标抗特异抗原的抗体,最后加入底物显色。
具体操作步骤如下:
1.第一将抗人IgMbt链抗体于碳酸盐缓冲液中40c下过夜包被聚苯乙烯等固相,形成固相抗体,洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后,用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭,洗涤去除未结合的部分及杂质。
2.加入含待测IgM抗体的临床样本如血清等,温育一定时刻后洗板;现在,待测样本中的IgM抗体就会与固相上的抗P链抗体反应而吸附于固相上。
3.加入特异的抗原如HAV抗原、HBcAg等,温育一定时刻后洗板;现在,特异抗原就会与固相上的特异IgM抗体发生反应。
4.加入酶标记的抗特异抗原的抗体,温育一定时刻后洗板;现在,在固相上即形成相应的抗原抗体复合物。
5.加入酶底物,温育显色测定
本方法要着重注意的是RF(1gM类)及其他非特异IgM的干扰。
RF(1gM类)由于其能与固相抗人u链抗体结合,并可与随后加入的酶标抗体(动物IgG)反应,从而导致假阳性反应。
而非特异IgM由于其在第一步温育中,可与特异IgM竞争与固相抗体结合,因此会阻碍测定的灵敏度。
因此,使用本法测IgM,必须对临床样本进行适当稀释。
样本稀释后,上述产生干扰作用的非特异IgM含量减少,而特异IgM由于处于相应病原体的急性感染期,滴度专门高,一定稀释后,可不能有明显阻碍,况且,在某些病原体如HBV的慢性感染时期,IgM类特异抗体也能连续存在,只只是滴度要低专门多。
因此,如不对血清样本稀释,就直截了当检测,即使是没有非特异IgM的干扰,阳性测定结果也没有急性感染的诊断价值。
现在,有些试剂生产厂家,为了迎合临床实验室减轻劳动强度、简便操作的要求,生产了不需对样本进行稀释的抗HAVIgM和抗HBclgMELISA试剂盒,现有许多实验室也在使用。
鉴于上面提到的缘故,我们建议临床实验室在做抗HAVIgM和抗HBclgM等类检测时,应使用对样本进行稀释的试剂盒,以保证检测的临床价值。
酶联免疫吸附测定ELISA结果判定的常用缩写
ELISA测定按其表示测定结果的方式分为定性和定量测定两大类。
定性测定只是对标本中是否含有待测抗原或抗体作出“有”或“无”的结论,分别用“阳性”和“阴性”来表示。
可见定性测定通常是用于传染性病原体的抗原或抗体的测定,以判定特定病原体感染的存在与否。
而定量测定则是对标本中待测抗原的多少进行量值测定,以具体数值表示。
定量测定差不多上是用于非病原体抗原物质的测定,如激素、细胞因子、肿瘤标志物、小分子药物等。
目前国内应用的ELISA试剂盒绝大部分是用于传染性病原体的抗原或抗体的定性测定,也有少部分用于。
FP,hCG、细胞因子等的定量测定。
ELISA定性测定的“阴性”和“阳性”的判定依据是试剂盒所确定的阳性判定值(cut-off)。
定量测定的“量值”依据是试剂盒中所带标准品同时测定得出的剂量反应曲线(又称标准曲线)。
实验室进行室内质控时使用。
下面再说明一下在ELISA定性测定结果判定中常用的一些缩写:
(1)S/CO:
其中S为sample(样本)或specimen(标本)的简写,表示的是标本测定的吸光度值,CO为cut-off值的简写。
除竞争抑制法外,其他ELISA定性测定模式中,当S/CO值大于或等于1时,标本的测定为阳性,小于1时为阴性。
(2)S/N或P/N:
其中S同
(1),N为negative(阴性对比)的简写,P为patient(患者)的简写。
较早的试剂盒专门多都使用S/N或P/N≥2.1为阳性判定标准,现仍有一些试剂盒使用这种方式。
这种方式与S/CO方式无全然性区别,只只是是前者将阴性对比(N)的2.1倍视为cut-off值而已.
酶免疫试验的优点及局限性
酶免疫试验之因此能成为临床免疫检验中的主导技术,是与它的方法上的特异性和灵敏性、操作上的简便性以及试剂的稳固性分不开的,还有专门重要的一点是,其对环境没有污染威逼。
尽管如此,作为一项免疫检验技术,酶免疫试验依旧有其局限性的,不但所检测的生物学体液样本如血清中有可能存在各种干扰实验的因素,而且在实验过程中,阻碍结果的因素也专门多,专门是进行手工的ELISA测定时。
此外,在定性ELISA测定中,阳性判定值(CUT-OFF)的建立,是在一定的统计学基础上的,相关于某个具体的受检者来说,其有可能并不具备正确性。
例如,使用ELISA方法检测抗HCV及抗HIV或HBsAg,有时候,检测所得的阳性结也许并不是真正的阳性,而需要使用其他方法如重组免疫印迹(recombinantimmunoblotas—say,RIBA)、蛋白印迹(Westernbl。
t,WB)或中和试验来确认,才能报告阳性。
那个地点抗HCV和抗HIV的检测均使用病毒部分的基因工程抗原,其他一些病毒如流感病毒、腮腺炎病毒和水痘病毒等感染人体后,亦或一些自身抗体,也有可能会导致假阳性反应。
HBsAg的测定要紧是弱阳性的问题,这与ELISA测定的“灰区”有关系,处于cut-off值周围亦即“灰区”的结果的可靠性通常较差,阳性因此需要确认,阴性却也未必是真,这一点在血站筛检献血员血液时是专门重要的,必须引起注意,并采取适当的措施,防止此类严峻阻碍人们健康的传染性疾病经输血传播,本书后面的有关章还会对此问题做详细论述。
此外,免疫测定的基础是抗原抗体的特异反应,因此,如检测抗原,除了要求抗体(单抗或多抗)是特异的外,还要求待测抗原上必须存在有能与所用抗体结合的抗原决定簇,假如因为基因突变导致某些位点的不表达,或者结合位点因为某些缘故被封闭或阻断,都会阻碍抗体与抗原的结合,造成假阴性结果。
如检测抗体,则要求所用包被抗原应尽可能包含所有的特异抗原决定簇,同时又尽可能不含有非特异的成分,这一点往往由于技术水平的限制而难以完全做到,因此,从某种意义上来说,假阳性假阴性是不能完全幸免的,尽管通过努力,能够将其降至专门低的程度。
这也是建立临床免疫检验方法所努力的方向.
酶联免疫吸附测定操作要点
1标本的采取和储存
可用作ELISA测定的标本十分广泛,体液(如血清)、分泌物(唾液)和排泄物(如尿液、粪便)等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。
有些标本可直截了当进行测定(如血清、尿液),有些则需经预处理(如粪便和某些分泌物)。
大部分ELISA检测均以血清为标本。
血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外,其他成份均同等于血清。
制备血浆标本需借助于抗凝剂,而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。
除专门情形外,在医学检验中均以血清作为检测标本。
在ELISA中血浆和血清可同等应用。
血清标本可按常规方法采集,应注意幸免溶血,红细胞溶解时会开释出具有过氧化物酶活性的物质,以HRP为标记的ELISA测定中,溶血标本可能会增加非特异性显色。
血清标本宜在新奇时检测。
如有细菌污染,菌体中可能含有内源性HRP,也会产生假阳性反应。
如在冰箱中储存过久,其中的可发生聚合,在间接法ELISA中可使本底加深。
一样说来,在5天内测定的血清标本可放置于4℃,超过一周测定的需低温冰存。
冻结血清融解后,蛋白质局部浓缩,分布不均,应充分混匀宜轻缓,幸免气泡,可上下颠倒混和,不要在混匀器上强烈振荡。
混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤,澄清后再检测。
反复冻融会使抗体效价跌落,因此测抗体的血清标本如需储存作多次检测,宜少量分装冰存。
储存血清自采集时就应注意无菌操作,也可加入适当防腐剂。
2试剂的预备
按试剂盒说明书的要求预备实验中需用的试剂。
ELISA中用的蒸馏水或去离子水,包括用于洗涤的,应为新奇的和高质量的。
自配的缓冲液应用pH计测量较正。
从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平稳后使用。
试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱储存。
3加样
在ELISA中一样有3次加样步聚,即加标本,加酶结合物,加底物。
加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部,幸免加在孔壁上部,并注意不可溅出,不可产动气泡。
加标本一样用微量加样器,按规定的量加入板孔中。
每次加标本应更换吸嘴,以免发生交叉污染,也可用一次性的定量塑料管加样。
有此测定(如间接法ELISA)需用稀释的血清,可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。
也可在板孔中加入稀释液,再在其中加入血清标本,然后在微型震荡器上震荡1分钟以保证混和。
加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器,使加液过程迅速完成。
4保温
在ELISA中一样有两次抗原抗体反应,即加标本和加酶结合物后。
抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时刻,这一保温过程称为温育(incubation),有人称之为孵育,在ELISA中似不恰当。
ELISA属固相免疫测定,抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。
以抗体包被的夹心法为例,加入板孔中的标本,其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会,只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直截了当与抗体接触。
这是一个逐步平稳的过程,因此需经扩散才能达到反应的终点。
在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。
这确实是什么缘故ELISA反应总是需要一定时刻的温育。
温育常采纳的温度有43℃、37℃、室温顺4℃(冰箱温度)等。
37℃是实验室中常用的保温温度,也是大多数抗原抗体结合的合适温度。
在建立ELISA方法作反应动力学研究时,实验说明,两次抗原抗体反应一样在37℃经1-2小时,产物的生成可达顶峰。
为加速反应,可提高反应的温度,有些试验在43℃进行,但不宜采纳更高的温度。
抗原抗体反应4℃更为完全,在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜,以形成最多的沉淀。
但因所需时刻太长,在ELISA中一样不予采纳。
保温的方式除有的ELISA仪器附有特制的电热块外,一样均采纳水浴,可将ELISA板置于水浴箱中,ELISA板底应贴着水面,使温度迅速平稳。
为幸免蒸发,板上应加盖,也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔,现在可让反应板漂浮在水面上。
若用保温箱,ELISA板应放在湿盒内,湿盒要选用传热性良好的材料如金属等,在盒底垫湿的纱布,最后将ELISA板放在湿纱布上。
湿盒应先放在保温箱中预温至规定的温度,专门是在气温较低的时候更应如此。
不管是水浴依旧湿盒温育,反应板均不宜叠放,以保证各板的温度都能迅速平稳。
室温温育的反应,操作时的室温应严格限制在规定的范畴内,标准室温温度是指20-25℃,但具体操作时可依照说明书的要求操纵温育。
室温温育时,ELISA板只要平置于操作台上即可。
应注意温育的温度和时刻应按规定力求准确。
为保证这一点,一个人操作时,一次不宜多于两块板同时测定。
5洗涤
洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤,但却也决定着实验的成败。
ELSIA确实是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。
通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质,以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。
聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的,而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。
能够说在ELISA操作中,洗涤是最要紧的关键技术,应引起操作者的高度重视,操作者应严格按要求洗涤,不得马虎。
洗涤的方式除某些ELISA仪器配有专门的自动洗涤仪外,手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种,过程如下:
(1)浸泡式a.吸干或甩干孔内反应液;b.用洗涤液过洗一遍(将洗涤液注满板孔后,即甩去);c.浸泡,立即洗涤液注满板孔,放置1-2分钟,间歇摇动,浸泡时刻不可随意缩短;d.吸干孔内液体。
吸干应完全,可用水泵或真空泵抽吸,也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干;e.重复操作c和d,洗涤3-4次(或按说明规定)。
在间接法中如本底较高,可增加洗涤次数或延长浸泡时刻。
微量滴定板多采纳浸泡式洗涤法。
洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。
聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的,非离子型洗涤剂既含疏水基团,也含亲水基团,其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合,从而削弱蛋白质与固相载体的结合,并借助于亲水基团和水分子的结合作用,使蛋白质回复到水溶液状态,从而脱离固相载体。
洗涤液中的非离子型洗涤剂一样是吐温20,其浓度可在0.05%-0.2%之间,高于0.2%时,可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。
(2)流水冲洗式流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤,洗涤液仅为蒸馏水甚至可用自来水。
洗涤时附接一专门装置,使小珠在流水冲击下不断地滚动淋洗,连续冲洗2分钟后,吸干液体,再用蒸馏水浸泡2分钟,吸干即可。
浸泡式犹如盆浴,流水冲洗式则好比淋浴,其洗涤成效更为完全,且也简便、快速。
已有实验说明,流水冲洗式同样也适用于微量滴定板的洗涤。
洗涤时设法加大水流量或加大水压,让水流冲击板孔表面,洗涤成效更佳.
ELISA检测-----竞争法测抗体
抗体的测定一样不使用竞争法。
当抗原中杂质难以去除或抗原的结合特异性不稳固时,可采纳这种模式测定抗体。
如乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBe•Ab)的测定,由于e抗原较核心抗原仅多29个氨基酸,e抗原专门容易转变为核心抗原,因此,HBcAb和HBeAb的测定均采纳竞争法。
但其测定具体模式有区别。
抗原的固相化既能够直截了当进行,亦能够通过相应特异抗体而间接固相化。
下面就HBcAb和HBeAbELISA测定具体操作步骤分述如下。
1.HBcAb的竞争法测定
(1)先将HBcAg在碳酸盐缓冲液中4~C过夜包被,形成固相抗原,洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后,用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭,洗涤去除未结合的部分及杂质。
(2)同时加入待测样本和酶标的特异抗体,温育一定时刻后洗板;此步中,待测样本的抗体将与酶标抗体竞争与固相上特异抗原结合。
(3)加入酶底物,温育显色测定,显色的强弱与待测样本中的相应抗体的含量成反比
2.HBeAb的竞争法测定
(1)先将HBeAb在碳酸盐缓冲液中4℃过夜包被,形成固相抗体,洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗原后,用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭,洗涤去除未结合的部分及杂质;
(2)同时加入待测样本和中和抗原HBeAg,温育一定时刻后洗板;此步中,待测样本的抗体将与固相抗体竞争结合与中和抗原HBeAg,待测样本中HBeAb浓度越高,则与固相HBe—Ab结合的HBeAg越少,反之亦然;
(3)加入酶标的特异抗体,温育一定时刻后洗板;此步中,酶标抗体将与结合于固相抗体上的特异抗原结合;
(4)加入酶底物,温育显色测定,显色的强弱与待测样本中的相应抗体的含量成反比
HBeAb之因此要采纳此种模式测定,要紧是HBeAg的不稳固所致,如在固相直截了当包被HBeAg,则会因为HBeAg向HBcAg的易转变性,而导致测定误差。
抗体的竞争法测定不同于只有单个抗原决定簇的小分子抗原的竞争法测定,其测定的可靠性,在专门大程度上受竞争抗体的特异性和亲和力大小的阻碍,竞争抗体与待测抗体在结合的特异性及亲和力越接近一致,则测定的可靠性越强,但竞争用抗体均为相应抗原免疫动物所得,与机体感染病毒后所产生的抗体确信会有所差异,因而,在目前HBeAb和HBcAb的临床检测中,常有难以说明的测定结果显现,这与其在方法学上的固有缺陷是分不开的。
ELISA检测 ----- 竞争法测抗原
大分子抗缘故其具有两个以上的抗原决定簇,而可用双抗体夹心法测定,小分子半抗原如地高辛、茶碱等药物以及T3,T4及睾酮等激素因其只有一个抗原决定簇,从而无法使用双抗夹心方法测定,只能采纳竞争抑制法测定。
具体步骤如下:
1.先用抗小分子的特异抗体如双抗体夹心法一样包被固相并封闭;
2.同时加入待测样本和酶标的小分子,温育一定时刻后洗板;此步中,待测样本的小分子将与酶标小分子竞争与固相上特异抗体结合;
3.加入酶底物,温育显色测定,显色的强弱与待测样本中的小分子含量成反比.
这种测定模式中,需要得到小分子与酶的结合物,而小分子酶结合物一则在制备上不如抗体酶结合物简便,二则其纯化亦颇为困难,结合有小分子的酶与游离酶之间难于分离。
因此,有人尝试在合成二或多聚体小分子的基础上,建立双抗夹心竞争ELISA方法测定小分子,测定的灵敏度和特异性均有所提高.
ELISA检测 ----- 间接法测抗体
差不多方法的操作如下:
1.将病原体的抗原在碳酸盐缓冲液中4~C过夜包被,形成固相抗原,洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗原后,用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭,洗涤去除未结合的部分及杂质;
2.加入含待测抗体的临床样本如血清等,温育一定时刻后洗板;现在,待测抗体就会与固阳上特异抗原反应而吸附于固相上;
3.加入酶标记的抗人IgG抗体,温育一定时刻后洗板;现在,在固相上即形成固相抗原—待测抗体—酶标二抗复合物;
4.加入酶底物,温育显色测定.
间接法测抗体在目前应用最多的是丙型肝炎病毒抗体(抗HCV)、人免疫缺陷病毒抗体(抗HIV)以及梅毒螺旋体抗体等的测定。
从上述的测定模式可见,间接法测抗体,严格地讲,所测定的仅为抗体的IgG类,不涉及IgM和IgA类,这是由酶标二抗体所决定的。
阻碍间接法测定抗体的一个较大的因素是包被抗原的纯度。
现在间接法测抗体中所使用的抗原一样均为基因工程重组抗原,如HCV的NS3,NS4,NS5,HIV的gp41和gpl20和梅毒螺旋体TpNl5,TpNl7,TpN47等。
基因工程抗原在纯化时应尽量去除用来表达的宿主如大肠杆菌的抗原,以免由于机体存在对这种宿主抗原的抗体而引起假阳性反应。
此外,由于机体的IgG类抗体浓度较高,其中绝大部分为机体接触外界环境刺激所产生的非特异IgG,因此,为幸免这些高浓度非特异IgG对固相的吸附所致的假阳性反应,通常需对待测样本做一定程度的稀释.
临床ELISA测定常用模式 ----- 双抗体夹心法测抗原
关于含多个抗原决定簇的大分子蛋白,使用双抗体夹心ELISA模式测定相当简便,现有的商品试剂盒差不多上都采纳此种测定模式。
具体测定方法如下:
1.第一以双抗体之一于碳酸盐缓冲液中4℃下过夜包被聚苯乙烯等固相,形成固相抗体,洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后,用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭,洗涤去除未结合的部分及杂质;
2.加入含待测物的临床样本如血清等,温育一定时刻后洗板;现在,待测抗原就会与固相上特异抗体反应而吸附于固相上;
3.加入酶标记的双抗体之二,温育一定时刻后洗板;现在,在固相上即形成双抗体与特异抗原的夹心产物;
4.加入酶底物,温育显色测定.
在该测定模式中,有两步温育和板孔洗涤步骤,假如将上述测定步骤2和3并为一步,立即待测样本和酶标抗体同时加入,从而仅有一步温育和洗板过程,即为通常所说的“一步法”。
最初的双抗夹心ELISA试剂盒,均采纳两步法。
后来,人们为了节约时刻,简化操作步骤,试剂生产厂家逐步推出了“一步法”试剂盒。
目前在我们的临床实验室中,测定大分子抗原如HBsAg、。
FP和hCG等,差不多上都采纳一步法。
一步法相比于两步法,尽管操作简单‘但有其固有的缺陷,处理不行,对ELISA测定结果有严峻阻碍。
在通常的两步温育洗涤方法中,抗原抗体反应将遵循下述规律,即在第一步中加入的待测标本中抗原(Ag)浓度逐步增加时,将使固相抗体(Ab)与抗原的结合逐步达到饱和[
(1)式],如此当随后加入一定浓度的酶标抗体(Ab’)后,a复合物的形成将直截了当与在第一步中形成的b复合物相关[
(2)式],因此,待测抗原浓度的逐步增加导致了显色的逐步加深,当抗原浓度增加到一定程度时,反应显色达到平台,而呈S形变化曲线.
而一步法双抗夹心ELISA的反应曲线则为钟形曲线。
也确实是说测定显色随着待则标本中抗原浓度的增加而升高至一定程度后,测定吸光度即随抗原浓度的增加而开始下降直至不显色,即所谓的“钩状效应”(hookeHect),也确实是我们在免疫沉淀试验中所称的“带现象”(zonephen。
menon)。
一步法的反应平稳式如(3)式
此外,b和c复合物的增加亦使得“双抗体夹心复合物”难以形成。
但假如 固相单抗和标记单抗采纳针对抗原的不同且空间距离较远的决定簇的抗体,即包被使用一种 单抗,酶标记使用另一种单抗,同时充分混匀反应液,并适当延长反应温育时刻,则可使b,。
和 d复合物减少至最低程度,而大大减轻“钩状效应”。
我们曾使用本室能得到的含最高浓度(约2mg/m1)HBsAg的血清样本对目前国内较大的试剂生产厂家的“一步法”HBsAg测定ELISA试剂盒的“钩状效应”进行了评判,尽管大部分有在HBsAg最高浓度下的测定显色较次高浓度(1:
lo稀释)显色要浅的现象,但均未显现该份样本测定为阴性的情形。
尽管如此,在临床实际工作中,仍有可能遇到“钩状效应”较严峻的HBsAg测定ELISA试剂盒,我们也经常听到基层实验室同行在这方面的反映。
因此,大伙儿还应该重视这方面的问题·,当发觉测定结果明显与临床不符或与相关测定指标互有矛盾,如HBeAg阳性样本HBsAg测定为阴性时,就应考虑HBsAg测定可能存在的“钩状效应”问题。
综上所述,一步法ELISA试剂盒作为迎合临床实验室简便快速要求的产物,有着庞大的市场,其虽有潜在缺陷,易导致含高浓度待测物的标本检测为阴性(假阴性),但精心的实验设计,对包被和酶标记抗体认真选择,完全能够将“钩状效应”显现的可能性降至最低。
此外,建议生产HBsAg,aFP和hCGELISA"一步法”测定试剂盒的厂家,应对所产的试剂在出厂前对其“钩状效应"(hookeffect)进行充分的研究,并提醒用户在使用时应注意之处。
双抗体夹心法测抗原另一个所需要注意的是类风湿因子(RF)的干扰。
我们明白,RF是一种抗变性IgG的自身抗体,要紧为19S的IgM类抗体,也可见7S的IgG及IgA类抗体。
这种自身抗体的特性是其是能与多种动物的变性IgG的Fc部分结合。
因此,假如血清标本中含有RF,在双抗夹心ELISA检测时,其即可作为固相抗体和酶标抗体(均为IgG)之间的桥接抗原,而产生假阳性反应。
因此,假如使用抗体的Fab2:
或Fab片段作为酶标记用抗体,则可幸免RF的干扰.
ELISA测定 ----- 双抗原夹心法测抗体
接法测抗体实
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