抗氧化酶活力测定方法sun0516.docx
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抗氧化酶活力测定方法sun0516
植物组织抗氧化酶活的测定方法
(修订版2020年5月7日)
一、待测样品预处理
称取鲜样0.5g于预冷的研钵(提前放冰箱)中,加1mL预冷的磷酸缓冲液(0.05mol/L,pH=7.8),冰浴研磨后再加1mL缓冲液,倒入离心管中,再用2mL缓冲液清洗研钵,倒入离心管中,平衡,低温(0-4℃)离心20min(10500rpm),收集上清液,冷藏保存。
磷酸缓冲液配制:
A液(0.2mol/L磷酸氢二钠溶液)的配制:
称取Na2HPO4·2H2O35.61g或Na2HPO4·7H2O53.65g或Na2HPO4·12H2O71.64g用蒸馏水定容至1000mL。
B液(0.2mol/L磷酸二氢钠溶液)的配制:
称取NaH2PO4·H2O27.6g或NaH2PO4·2H2O31.21g用蒸馏水定容至1000mL。
磷酸缓冲液(0.05mol/L,pH=7.8)配制:
45.75mLA+4.25mLB定容至200mL。
磷酸缓冲液(0.1mol/L,pH=7.0)配制:
61mLA+39mLB定容至200mL。
磷酸缓冲液(100mmol/L、pH7.5)配制:
84mLA+16mLB定容至200mL。
磷酸缓冲液(50mmol/L、pH7.5)配制:
42mLA+8mLB定容至200mL。
pH
5.8
6.0
6.5
6.8
7.0
7.5
7.6
7.7
7.8
7.9
8.0
x(mL)A
8.0
12.3
31.5
49.0
61.0
84.0
87.0
89.5
91.5
93.0
94.7
y(mL)B
92.0
87.7
68.5
51.0
39.0
16.0
13.0
10.5
8.5
7.0
53
二、SOD(超氧化物歧化酶)活力测定——氮蓝四唑(NBT)法
1.1原理
超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)普遍存在于动、植物体内,是一种清除超氧阴离子自由基的酶,它催化下列反应:
。
本反应产物H2O2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。
本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基,超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙,后者在560nm处有最大吸收。
而SOD可清除超氧阴离子自由基,从而抑制了甲腙的形成。
于是,光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。
据此可以计算出酶活性大小。
1.2试剂配制
2.2.1磷酸缓冲液配制
A:
0.2mol/L磷酸氢二钠溶液(A液)的配制:
称取Na2HPO4·2H2O35.61g或Na2HPO4·7H2O53.65g或Na2HPO4·12H2O71.64g用蒸馏水定容至1000mL。
B:
0.2mol/L磷酸二氢钠溶液(B液)的配制:
称取NaH2PO4·H2O27.6g或NaH2PO4·2H2O31.21g用蒸馏水定容至1000mL。
2.2.2反应液的配制(测定前现配现用)
反应液——水:
磷酸:
Met:
NBT:
EDTA-Na2:
FD(核黄素)=5:
30:
6:
6:
6:
6;
49mL反应液组成:
水5mL,50mM磷酸缓冲液30mL,Met6mL,NBT6mL,EDTA-Na26mL,FD6mL。
其中:
1 130mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液的配制:
称取1.9399gMet用pH7.8磷酸缓冲液定容至100mL,摇匀备用。
2 750umol/L氮蓝四唑(NBT)溶液的配制:
称取0.06133gNBT用pH7.8磷酸缓冲液定容至100mL,摇匀备用,避光保存。
3 100µmol/LEDTA-Na2溶液的配制:
称取0.03721gEDTA-Na2,用磷酸缓冲液定容至1000mL,摇匀备用。
4 20µmol/L核黄素溶液:
称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000mL,摇匀,避光保存。
1.3方法
取相同型号的试管,试管中加入50µL上清液(空白对照加磷酸缓冲液50µL),分别加3mL反应液,其中2支对照试管置于暗处,其余各管于4000lx日光下反应20-30min(要求各管受光情况一致,温度高时反应时间短,温度低时延长),反应结束后,以不照光的对照试管作空白,于560nm下比色测定吸光度值。
计算公式:
以抑制NBT光化学还原50%所需酶量为1个酶活单位(U),按下式计算SOD活性。
SOD总活性(U·g-1FW)=(Ack-As)×V/(Ack×0.5×FW×V1)
式中:
Ack——照光对照管的吸光度
As——样品管的吸光度
V——样品总体积(本试验中为4mL),mL
FW——样品鲜重(本试验中为0.5g)
V1——测定时样品的用量,mL
1.4注意事项
(1)核黄素产生
,NBT还原为蓝色的化合物都与光密切相关,因此,测定时要严格控制光照的强度和时间。
(2)植物中的酚类对测定有干扰,制备粗酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP),尽可能除去植物组织中的酚类等次生代谢物质。
(3)测定SOD活性时加入的酶量,以能抑制反应的50%为佳。
三、POD(过氧化物酶):
愈创木酚法
1.测定方法
取上清液20µL加入比色杯中(对照加20µL磷酸缓冲液),加3mL反应液,马上读470nm下的OD值并计时,每隔1分钟读一次(读0,1,2,3min的OD值)。
反应液的配制:
0.1mol/LpH=6.0的磷酸缓冲液50ml,加愈创木酚28µl,于磁力搅拌器上加热溶解,冷却后加30%双氧水19µL存于冰箱中备用。
2.计算公式
(1)以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小,即以ΔOD470·min-1·g-1FW表示之。
POD总活性(ΔOD470·min-1·g-1FW)=(ΔOD470×V)/(V1×FW×t)
式中:
V——样品总体积(本试验中为4mL),mL
FW——样品鲜重(本试验中为0.5g)
V1——测定时样品的用量(本实验为0.02mL),mL
ΔOD470/t——每分钟吸光度变化值。
(2)也可以用每 min 内 A470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位( U )表示。
POD总活性(U·g-1FW)=(ΔOD470×V)/(V1×FW×t×0.01)
式中:
V——样品总体积(本试验中为4mL),mL
FW——样品鲜重(本试验中为0.5g)
V1——测定时样品的用量(本实验为0.02mL),mL
ΔOD470/t——每分钟吸光度变化值。
3.相关标准
GB/T32131-2015辣根过氧化物酶活性检测方法比色法
四、CAT酶活性测定
1.试验原理
植物体内CAT酶的作用是把植物体SOD酶歧化产生的过氧化氢进一步还原为水和氧气,过氧化氢在240nm波长下有强烈吸收,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。
根据测量吸光率的变化即可测出过氧化氢酶的活性。
4.实验步骤
取上清液100µl加入比色杯中(对照加100µl磷酸缓冲液),加3mL反应液,马上读下240nm下的OD值并计时,每隔1分钟读一次(读0,1,2,3min的OD值)。
反应液的配制:
0.1mol/LpH=7.0的磷酸缓冲液20ml,加0.1mol/L双氧水5ml备用。
0.1mol/LH2O2的配制:
用移液枪移取568µL30%H2O2于100ml容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,摇匀备用。
5.计算公式
(1)以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小,即以ΔOD240·min-1·g-1FW表示之。
CAT总活性(ΔOD240·min-1·g-1FW)=(ΔOD240×V)/(V1×FW×t)
式中
V——样品总体积(本试验中为4mL),mL
FW——样品鲜重(本试验中为0.5g)
V1——测定时样品的用量(本实验为0.1mL),mL
ΔOD240/t——每分钟吸光度变化值。
(2)以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位(U)。
CAT总活性(U·g-1FW)=(ΔOD240×V)/(V1×FW×t×0.1)
式中
V——样品总体积(本试验中为4mL),mL
FW——样品鲜重(本试验中为0.5g)
V1——测定时样品的用量(本实验为0.1mL),mL
ΔOD240/t——每分钟吸光度变化值。
6.相关标准
GB/T23195-2008蜂花粉中过氧化氢酶的测定方法紫外分光光度法.
五、MDA丙二醛
1.测定方法
取上清液1mL(对照加1ml水),加2mL0.67%TBA(硫代巴比妥酸),封口沸水浴15min,迅速冷却(用冷水冲泡),倒入指形管中,4000rpm下离心20min,取上清液于600nm,532nm,450nm下比色。
7.试剂配制
(1)0.67%TBA:
称0.67gTBA,加少量1mol/L的NAOH溶液溶解,再用10%三氯乙酸定容至100ml。
(2)10%三氯乙酸:
称10g三氯乙酸定容于100ml。
8.计算公式
CMDA(µmol/L)=6.45(A532-A600)-0.56A450(消除糖类物质的干扰作用)
MAD(mmol·g-1FW)=CMDA*V/W=0.1548(A532-A600)-0.01344A450(V=0.012L,W=0.5g)
9.相关标准
GB5009.181-2016食品安全国家标准食品中丙二醛的测定
六、APX-抗坏血酸过氧化物酶活性的测定
1.目的要求
学习果蔬组织中抗坏血酸过氧化物酶活性的测定原理和方法。
2.基本原理
抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbateperoxidase,APX:
AsA-POD)是以抗坏血酸为电子供体的专一-性强的过氧化物酶。
APX能催化抗坏血酸与H2O2反应而被氧化形成单脱氢抗坏血酸。
随着抗坏血酸被氧化,溶液在波长290nm处的吸光度值下降,根据单位时间内吸光度值的减少,可以计算出APX活性。
3.材料、仪器及试剂
3.1材料
梨、桃、番茄等。
3.2仪器及用具
高速冷冻离心机、紫外分光光度计、研钵、试管、计时器、容量瓶(100mL、200mL、1000mL)、电子天平。
3.3试剂
(1)100mmol/L、pH7.5磷酸缓冲液:
参加本材料第一部分。
(2)提取缓冲液(含0.1mmol/LEDTA、1mmol/L抗坏血酸和2%PVPP)
称取2.9mgEDTA,17.6mg抗坏血酸和2gPVPP,用100mmol/L、pH7.5磷酸缓冲液溶解、定容至100mL。
4°C预冷保存。
(3)反应缓冲液(含0.1mmol/LEDTA和0.5mmol/L抗坏血酸)
称取2.9mgEDTA和8.8mg抗坏血酸,用50mmol/L、pH7.5磷酸缓冲液溶解、定容至100mL,4°C预冷保存。
(4)2mmol/LH2O2
取1.14mL30%H2O2,用蒸馏水稀释至100mL,混匀,即得200mmol/LH2O2溶液。
再取1.0mL该溶液,稀释至100mL,即为2mmol/LH2O2溶液。
4.实验步骤
4.1酶液制备
称取5.0g果蔬组织样品置于经预冷的研钵中,加入5.0mL经4°C预冷的提取缓冲液,冰浴研磨匀浆后,于4℃、10500rpm离心20min,收集上清液即为酶粗提液。
4.2活性测定
在比色皿中,依次加入2.6mL反应缓冲液和0.1mL酶提取液,最后加入0.3mL2mmol/LH2O2启动酶促反应,立即混匀,并开始计时。
从启动后15s开始记录反应体系290nm的吸光度值,每隔30s记录一次,连续测定2min,至少获取6个点的数据。
以蒸馏水为参比对分光光度计进行调零。
重复三次。
5.计算结果
记录反应体系在波长290nm处的吸光度值,制作OD290值随时间变化曲线,根据曲线的初始线性部分计算每分钟吸光度变化值△OD290。
然后以每克鲜重(FW)样品每分钟OD290值变化0.01时为一个酶活性单位(U),则∪=0.01△OD290.min-1.g-1FW。
计算公式:
样品酶活力(∪/g)=△OD290*V/0.01*△t*Vs*W
式中:
△OD290:
反应混合液在290nm处吸光度变化值
△t:
酶促反应时间,min
V:
样品提取液总体积,mL
Vs:
测定时所取样品提取液体积,mL
W:
样品重量,g
参考文献
SOD测定
Chen W., Zhang Z., Shen Y., Duan X.and Jiang Y.. Effect of tea polyphenols on lipid peroxidation and antioxidant activity of litchi (Litchi chinensis Sonn.) fruit during cold storage . Molecules., 2014, 19 (10):
16837-16850
POD测定
FuH.Y..InfluencesofTreatmentsby6-BAandWateratDifferentTemperaturesonthePeroxidaseActivityinHarvestedBroccoli[J].JournalofAnhuiAgriculturalSciences.,2008,36(12):
4852-4853
CAT测定
AsghariM.,KhaliliH.,RasmiY.andMohammadzadeh,A.InfluenceofpostharvestnitricoxideandAloeveragelapplicationonsweetcheeryqualityindicesandstoragelife.[J].InternationalJournalofAgronomy&PlantProduction.,2013:
2393-2398
APX测定
YangY.,DongC.,YangS.,LiX.,SunX.andYangY..PhysiologicalandproteomicadaptationofthealpinegrassStipapurpureatoadroughtgradient.PlosOne.,2015,10
(2):
e0117475.1-27
MDA测定
赵世杰.植物生理学实验指导。
中国农业科技出版社。
2002,47-57
曹健康,姜微波,赵玉梅。
果蔬采后生理生化实验指导(M)。
中国轻工业。
2007
附录——其他参考方法(来源于网络)
1.NBT法测定SOD活力
1.1原理
超氧化物岐化酶(superoxidedismutase,SOD)普遍存在于动、植物体内,是一种清除超氧阴离子自由基(O2.-)的酶,它催化下列反应:
2O2.-+2H+→H2O2+O2
反应产物H2O2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。
实验中依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2.-,O2.-可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙,后者在560nm处有最大吸收。
而SOD可清除O2.-,从而抑制了甲腙的形成。
于是光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。
据此可计算出酶活性大小。
1.2试剂
50mM,PH7.8磷酸缓冲液(57.1875mLA+5.3125mLB定容至250mL)
130mM甲硫氨酸,0.1940g→10mL,磷酸缓冲液配制
750µMNBT,0.0061g→10mL,磷酸缓冲液配制
100µMEDTA-Na2,0.0037g→100mL,磷酸缓冲液配制
20µM核黄素,0.00753g→100mL,蒸馏水配制,避光保存
附录:
不同pH磷酸缓冲液的配制
母液:
A:
0.2MNa2HPO4溶液:
Na2HPO4.12H2O71.64g用蒸馏水溶至1L
B:
0.2MNaH2PO4溶液:
NaH2PO4.2H2O15.60g用蒸馏水溶至500mL
100mM磷酸缓冲液配法:
x(mL)A+y(mL)B稀释至200mL
pH
5.8
6.0
6.5
6.8
7.0
7.5
7.6
7.7
7.8
7.9
8.0
x(mL)A
8.0
12.3
31.5
49.0
61.0
84.0
87.0
89.5
91.5
93.0
94.7
y(mL)B
92.0
87.7
68.5
51.0
39.0
16.0
13.0
10.5
8.5
7.0
5.3
1.3实验步骤
(1)酶液粗提
称取一定量的实验材料于预冷的研钵中,加入适量磷酸缓冲液,冰浴充分研磨后定容(1mL/0.1g)。
取1.5mL匀浆于4℃,10000rpm离心15min,上清液即为酶粗提液。
(POD,CAT,MDA,可溶性蛋白等的测定均按此方法提取)
(2)反应液配制
取透明度好的指形管或离心管,按下表依次加入各溶液:
试剂(酶液)
用量/µL
终浓度/比色时
50mM磷酸缓冲液
600
130mMMet
120
13mM
750µMNBT
120
75µM
100µMEDTA-Na2
120
10µM
20µM核黄素
120
2.0µM
酶液
20
对照以缓冲液代替酶液
蒸馏水
100
总体积
1200
混匀后将1只对照管放在暗处,其它各样品于4000lx日光下反应20min(各管受光必须一致,温度高则缩短时间,低则延长)。
(3)SOD活性测定与计算
反应结束后,以不照光的对照管作空白,分别测定560nm波长下的吸光值。
以SOD抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位,按下式计算SOD活性:
SOD总活性=[(Ack-AE)×V]/[0.5×Ack×W×Vt]
SOD比活力=SOD总活力/蛋白质含量
式中:
SOD总活性以每克鲜重酶单位表示;比活力以酶单位/mg蛋白表示;Ack为照光对照管的吸光值;AE为样品管的吸光值;V为样品液总体积,mL;Vt为测定时样品用量,mL;W为样品鲜重,g;蛋白质含量单位为mg蛋白/g鲜重
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