蛋白质相互作用.ppt
- 文档编号:8834204
- 上传时间:2023-05-15
- 格式:PPT
- 页数:49
- 大小:5.76MB
蛋白质相互作用.ppt
《蛋白质相互作用.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《蛋白质相互作用.ppt(49页珍藏版)》请在冰点文库上搜索。
Protein-proteinInteraction蛋白质-蛋白质相互作用,03/27/2009,Protein-ProteinInteractions-ACommonThemeinCellBiology蛋白质-蛋白质相互作用细胞生物学领域的普遍主题,*DNA*RNA*Protein,Cellassemblyandfunction/细胞组装与功能,Messenger,Headquarter,Executor,Stable,DNAmutation,Stable/Versatile,rRNA,tRNA,mRNA,Versatile,ProteinmodificationProtein-ProteininteractionProtein-Othercomponentinteraction,Protein-ProteinInteractions,SingleproteinProteincomplexProteincomplexinteractionProteincomplexnetworkCell,Versatile,Dynamic,Accurateregulation,Cellassemblyandfunction,Protein-ProteinInteractions,InteractionDomain-Structuralbasisforproteininteraction相互作用区域是蛋白质相互作用的结构基础,*信号蛋白,调节蛋白以及大多数其他的蛋白质都具有包括相互作用区域在内的好几个结构域;*有些多肽仅由相互作用区域组成,从而充当蛋白质复合物的核心。
InteractionDomain-Structuralbasisforproteininteraction相互作用区域是蛋白质相互作用的结构基础,*SH2domain:
phosphotyrosine-containingpeptidesrecognitiondomain。
SH2分布最为广泛,识别特定的含有磷酸化Tyr的多肽模块。
SH3,SH2,Ykinase,SH3,SH2,SH3,pYEEI,pYVNV,SrcSH2domain:
Grb2SH2domain:
InteractiondomainandProteininteractionSignalingtransductionpathway,PhysiologicalfunctionsofproteininteractionsLocalization蛋白质的亚细胞定位,*蛋白质的亚细胞定位与其功能密切相关;*涉及:
蛋白质-蛋白质相互作用;蛋白质与磷脂的相互作用;*蛋白质的组织特异性与亚细胞定位的研究是蛋白质功能研究的起始步骤,Protein-proteininteractioncanbeusedtobuildcomplexbiologicalsystems.蛋白质-蛋白质相互作用是功能复合物形成的基础。
(如线粒体内膜呼吸链),PhysiologicalfunctionsofproteininteractionsLocalizationandTrafficking,Aberrantinteractionscancontributetopathogenesis;错误的相互作用可能导致病理形象的出现。
如Alzheimersdisease,beta-淀粉样结构的堆积;,PhysiologicalfunctionsofproteininteractionsLocalizationandTrafficking,Inducibleproteininteraction&posttranslationalmodifications可诱导的蛋白相互作用与翻译后修饰,Dynamicbehaviorofcellsinresponsetochangingconditionsishighlydependentonposttranslationalmodifications;细胞面对不断改变的环境表现出来的动态行为有赖于蛋白质的翻译后修饰以及它带来的蛋白质相互作用的变化。
Techniquesandcomputation,ElucidationofProtein-ProteinInteractions,BiophysicalTechniquesMassSpectrometrySurfacePlasmonResonanceAtomicForceMicroscopyNMRX-rayCrystallography,HighThroughputTechniquesLibraryScreeningDegeneratePeptideLibrariesSpotBlotsCo-IPsGST-pulldownsYeast2-HybridPhageDisplay,StandardTechniquesCo-IPsGST-pulldownsYeast2-HybridPhageDisplay,InvivoImagingFRETBRET,ProteinInteractionNetworks,Techniques:
Principle,Process,AdvantageandDisadvantageGST-Pulldown,Principle:
AffinitypurificationAffinitybetweenInteractionmotif/polypeptideanditsinteractionproteins;Advantage:
Directinteraction/InvitroProcess:
Interactionmotif,GST,ImmobilizedonGlutathionebeads,AffinitycolumnMaking,Affinitypurificationfromtissueorcelllysate,Techniques:
免疫沉淀,质量作用定律决定IP的成功度,Techniques:
免疫沉淀(非变性),免疫沉淀的灵敏度取决于ProteinA(orG)与IgG的Kd、IgG与抗原的Kd值。
所以增加抗原或抗体的浓度、使用与抗体直接共价偶联的珠子进行免疫沉淀可以提高灵敏度;,ProteinABead,IgG,Antigen,Kd,Kd,*,*,IgG,Kd,Antigen,Co-Immunoprecipitation/共免疫沉淀,Principle:
Affinitypurification/亲和纯化Advantage:
Invivo(Physiologicalstatus)/代表生理状态下的相互作用,X,Y,X,Y,Cell,CellLysisandImmunoprecipitationofproteinX,Z,Z,细胞裂解与蛋白质X的免疫沉淀,Techniques:
免疫沉淀(非变性),生理活性的保持:
a.全程低温操作;b.裂解液中加入蛋白酶抑制剂;2.免疫沉淀的灵敏度取决于ProteinA(orG)与IgG的Kd、IgG与抗原的Kd值。
所以增加抗原或抗体的浓度、使用与抗体直接共价偶联的珠子进行免疫沉淀可以提高灵敏度;,ProteinABead,IgG,X,Kd,Kd,*,*,IgG,X,Kd,Techniques:
免疫沉淀(非变性),免疫沉淀的产物如用于SDS-PAGE及及免疫印迹进一步分析时,*需要去除盐的干扰,PBS或其它洗涤缓冲液应可能去除;大量IgG掺入也影响电泳的效果,如脱尾和扩散。
检测信号十分微弱时,这种条带的扩散可能导致根本无法获得信息;,Techniques:
免疫沉淀(非变性),免疫沉淀的产物如用于SDS-PAGE及及免疫印迹进一步分析时,大量的IgG掺入样品后导致免疫印迹时出现非特异性条带;对免疫共沉淀的结果分析影响尤其大;,IgG,目的蛋白,用目的蛋白的抗体进行免疫沉淀,再用免疫印迹法进行检测;,GFP,WT,YFMut(6),-+,-+,-+,IP:
GFPIB:
4G10(pTyr),MTSS1-GFP,GFP,PDGF,115,93,49.8,35.8,29.2,198,-+,-+,-+,Reblot:
GFP,MTSS1-GFP,GFP,WT,YFMut(6),Techniques:
免疫共沉淀(非变性),操作同非变性免疫沉淀,只是检测的是相互作用蛋白;其效率还涉及复合物中蛋白质X,Y,Z的Kd值。
ProteinABead,IgG,X,Y,Z,ProteinAIgGProteinX*ProteinYProteinZ,Kd,Kd,Kd,Kd,Techniques:
免疫共沉淀(非变性),1.免疫复合物中蛋白质X,Y,Z的Kd值越小,即越稳定,有利于免疫共沉淀的进行;2.免疫沉淀中提高灵敏度的方法同样适用于免疫共沉淀;,X,Y,Z,ProteinAIgGProteinX*ProteinYProteinZ,Kd,Kd,Kd,Kd,Techniques:
免疫共沉淀(非变性),细胞裂解液的几点考虑:
1.复合物的稳定,提高灵敏度,但会降低特异性;2.针对特定的复合物,细胞裂解液中可能加入磷酸酯酶抑制剂或者ATP及一些金属离子以维持复合物的稳定;,Techniques:
免疫共沉淀,免疫共沉淀中的非特异性:
B,A,x,Y,细胞裂解,蛋白质X的抗体进行免疫沉淀,X,Y,X,Y,B,A,X,Techniques:
免疫共沉淀:
基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑(类型I),B,A,x,Y,细胞裂解,蛋白质X的抗体进行免疫沉淀,A,X,原因:
抗体的非特异性,Techniques:
免疫共沉淀:
基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑(类型I),1.抗体的质量:
抗体的特异性;2.尽可能的设置多种阴性对照;一般采用兔子免疫前的血清(pre-immuneserum)同时进行免疫沉淀及后续分析;3.使用目标蛋白的多种抗体进行免疫沉淀并比较;4.采用不表达目标蛋白的细胞裂解物同时进行免疫沉淀并比较;5.增强细胞裂解液的严谨性,降低非特异性;6.检测两种蛋白质的相互作用时,同时用两个蛋白质的抗体进行实验;,B,A,x,Y,细胞裂解,蛋白质X的抗体进行免疫沉淀,X,Y,X,Y,B,X,Techniques:
免疫共沉淀:
基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑(类型II),抗原复合物与其它蛋白质的非特异性相互作用;抗原复合物解离,X,Techniques:
免疫共沉淀:
基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑(类型II),*当X-Y的复合物不很稳定或解离常数大时,可以考虑使用细胞可渗透的交联剂(Cross-linker),X,NH2,Y,NH2,活性基团,活性基团,A,B,A,x,Y,细胞裂解,蛋白质X的抗体进行免疫沉淀,Techniques:
免疫共沉淀:
基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑(类型II),*当X-Y的复合物是瞬间形成的或解离常数大时,可以考虑使用细胞可渗透的交联剂(Cross-linker),X,NH2,Y,NH2,活性基团,活性基团,A,B,A,x,Y,细胞裂解,蛋白质X的抗体进行免疫沉淀,X,Y,Techniques:
免疫共沉淀:
基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑(类型II),研究方案:
Affinitypurification&MS,带Tag的目标蛋白与固相基质偶联,目标蛋白带上Tag,目标蛋白相互作用蛋白的亲和纯化,目标蛋白复合物的SDS-PAGE分离,蛋白质条带的切割和酶解,质谱与生物信息学分析,文献与其他数据库的功能分析,实验验证与功能的探索,MTSS1过量表达促进PDGF诱导的背部变皱膜形成,GFP,MTSS1-GFP,F-actin,F-actin,GFP,GFP,研究方案:
Co-immunoprecipitation&MS,Serumstarvation,MIM-GFPinfectedNIH3T3cell,PDGFstimulation,Crosslinkerstabilizecomplex,ImmunoprecipitationwithGFPantibody,SDS-PAGE,Excisebandsanddigestion,AnalyzebyMSandbioinformatics,核糖体蛋白代谢酶类热休克蛋白泛肽酶高丰度的细胞骨架蛋白血清蛋白(如果使用是IP亲和的方式),MSafteraffinitypurification鉴定结果中通常包含很多非特异的蛋白质信息,去除这些常见的非特异结合的蛋白质(除非它们与你目标蛋白质功能相关),TranscriptionalpatternofofMTSS1andinteractingproteincandidatesidentifiedbyCo-IP&MS,http:
/mouse.brain-map.org/,*利用其他数据库进行的功能分析,质谱鉴定数据的分类(Example),F-actinaffinitypurification(4)按MS鉴定到的蛋白质的生物学功能分类;(5)生物学功能相同或相近的蛋白质聚类,分析复合物组成;(6)根据这些蛋白质在小脑不同发育时期的表达模式聚类;(7)由此将与小脑发育相关的F-actin结合蛋白与小脑特定发育时期的功能相联系。
部分鉴定到的F-actin结合蛋白的功能归属,Proliferation&Celldeath,Cellmigration&differentiation,Dendrogenesis&axogenesis,Synaptogenesis,Postnataldevelopmentstagesofcerebellum,TranscriptionlevelofMTSS1incerebellum,*,*,蛋白质功能研究的策略,信息学,试验分析,新蛋白,序列同源比较,相互作用区域,功能区,功能伙伴的预测,为抗体、siRNA,shRNA等的设计提供预测,试验工具:
抗体,克隆,siRNA,shRNA,生理学背景:
内源表达和组织及细胞定位,筛选相关蛋白,验证相关蛋白:
1.细胞内共定位;2.去除相互作用区域的影响;3.新蛋白与相关蛋白在功能上的一致性;,从找到的新相关蛋白开始,进行新一轮的筛选,建立功能网络,PRD,WH2,CCD,Y397,Y398,IMDdomainF-actinbindingRacbinding,Cortactinbinding,G-actinbinding,SrcSH2binding,利用信息学分析新蛋白的结构和功能区,并进行相互作用蛋白的预测,Yamagishietal,JBiolChem,279,14929,2004;Mattilaetal,JBiolChem,278,8452,2003;Bompardetal,JCellSci,118,5393,2005.Linetal,Oncogene,24,2059,2005.,利用亚细胞定位及蛋白质相互作用等信息进行蛋白质功能归属,例1:
从免疫共沉淀中得到的蛋白质中筛选重要功能相关蛋白:
利用免疫共沉淀方法找到的9个p53(胞浆和核定位)结合蛋白1.GRP-94GRP-942.Alpha-actinin1GRP-78分子伴侣*3.MCM3GRP-754.GRP-785.GRP-752MCM3DNA复制准许因子*6.LaminA/C7.Ezrin/CytovillinAlpha-actinin胞浆8.CD98antigen3LaminA/C核纤层细胞骨架?
9.ProteinkinaseCEzrin/cytovilin胞浆4ProteinKinaseC激酶?
5CD98antigen跨膜糖蛋白X,1,例3Sra1与Nap1参与Rac诱导的片状伪足形成,从牛脑中用传统的柱层析分离到的蛋白质复合物,组分经质谱鉴定,包括Nap1,Sra-1homologue,PIR121,WAVE1andAbi等组分。
免疫共沉淀与GST-Pulldown验证Rac活化时复合物的存在,Rac活化时Sra-1与Nap1在细胞中的重新定位,1.Sra-1与Nap1定位于片状伪足顶部(免疫荧光),RNA干扰Nap1,Sra1的表达对Rac功能的影响,RNA干扰Nap1,Sra1的表达对Rac功能的影响,谢谢!
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 蛋白质 相互作用