16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程.docx
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16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程
1.适用范围
本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增,然后对扩增片段进行序列分析比对,快速获得细菌种属信息的操作规程。
本标准适用于未知细菌的快速种属分析,以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。
2.方法和原理
16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法。
细菌rRNA(核糖体RNA)按沉降系数分为3种,分别为5S、16S和23SrRNA。
16SrDNA是细菌染色体上编码16SrRNA相对应的DNA序列。
16SrDNA由于大小适中,约1.5Kb左右,既能体现不同菌属之间的差异,又能利用测序技术较容易地得到其序列,故被细菌学家和分类学家接受。
在16SrRNA分子中,可变区序列因细菌不同而异,恒定区序列基本保守,所以可利用恒定区序列设计引物,将16SrDNA片段扩增出来,利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。
16SrDNA序列的前500bp序列变化较大,包含有丰富的细菌种属的特异性信息,所以对于绝大多数菌株来说,只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。
针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况,需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序,得到较为全面的16SrDNA的序列信息。
由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列,为了结果的可靠性,通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。
16SrDNA
27F519R
357F1/9
926F3对引物正反向测通后,拼接成1500bp
1115R
1492R
16SrDNA序列。
左右的
设备和材料3.器材1.1;EppendorfMixMate100μL、10μL);涡旋振荡器;μL移液器(1000μL、200、Veriti96WellThermal仪:
离心机;水浴锅;电泳仪;制冰机;低温冰箱;PCRAB3130、凝胶成像仪:
VersaDocMP4000;基因分析仪:
AB3500Cycler;
试剂1.2
TaqTaq试剂:
酶,10×DNA快速提取试剂:
PrepManUltra;琼脂糖;PCR2+,ExoSAP-IT;测序试剂:
BigDyeTerminator,ddHO等;Buffer(MgdNTPs),2;BigDyeXTerminatorPurificationKit5×SequencingBuffer;耗材1.3TMOpticalμL;MicroAmp200200、μL、10μL;离心管:
1.5mL、移液器吸头:
1000μLTMOpticalAdhesiveFilm;MicroAmp96-WellReactionPlate;1.4引物
扩增长度序列16SrDNA
名称
5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
正向引物27F
左右500bp部分第1
5'-GWATTACCGCGGCKGCTG-3'反向引物519R
5'-CTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'
正向引物357F
左右部分第2750bp5'-AGGGTTGCGCTCGTTGC-3'反向引物1115R
2/9
5'-AAACTYAAAKGAATTGACGG-3'
正向引物926F
560bp第3部分左右5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'
反向引物1492R
S=G:
C.W=A:
T;all1:
1
M=C:
A,Y=C:
T.K=G:
T,R=A:
G其中操作流程4.
核酸提取产物纯化基因扩增序列比对测序反应
5.实验方法核酸提取:
1.5涡旋震荡混匀LPrepManUltra的离心管中,挑取单菌落,然后置于装有100μ10min后,以离心机最大转速离心3min,取10μL10030s左右,然后℃水浴上清液与490μLddHO(即稀释50倍),混匀作为下步PCR的模板DNA。
提取2的DNA于-20℃保存。
1.6基因扩增
1.6.1PCR反应体系
板使用量。
进行反应,这种冷启动法可增强
试剂
使用量(25μL体系)
模板DNA
2μL(10ng~100ng)
)μLTaq酶(5U/
0.2μL
2+TaqBuffer(Mg10×)
2.5μL
2.5mM)各dNTPs(
2μL
M)μ引物F(1
5μL
M)μ引物R(1
5μL
O
ddH2
8.3μL
备注:
DNA模板量通常在100ng以下,必要时可进行梯度稀释,确定最佳的DNA模PCR反应体系应在冰中配置,然后置于冰箱中冷却3~5min,最后放于PCR仪上PCR扩增的特异性。
3/9
1.6.2PCR反应条件
94℃:
10min
94℃:
30s
58℃:
30s30Cyc
45s℃:
725min72℃:
4℃:
∞1.6.3电泳℃加热融化,待温度降至60称取1g琼脂糖置于100mLTAE电泳缓冲液中,100VPCR反应结束后,加样,以左右时,均匀铺板,制成1%的琼脂糖凝胶。
电压进行琼脂糖凝胶电泳。
电泳结束后,染色,用凝胶成像仪观察,拍照,记录实验结果。
产物纯化1.7试剂,混匀。
5μLPCR产物加入2μLExoSAP-IT每1.7.1
15min15min,80℃温育。
1.7.2放入PCR仪中,37℃温育纯化后的PCR产物做为下一步测序反应的模板。
1.7.3
测序反应1.8测序反应体系1.8.1
试剂
10使用量(μL体系)
DNA模板
1μL
M)(1μ引物
1.6μL
BigDyeTerminator
1μL
SequencingBuffer
5×
1μL
4/9
ddHO2
μL5.4
测序反应条件1.8.22min℃9630s℃:
9615s55℃:
30Cyc60℃:
4min
4℃:
∞(BigDyeXTerminatorPurificationKit)
测序反应纯化1.8.3BigDyeXTerminatorSolution。
和6μL5.4.3.1每管加入27μLSAMSolution。
2000rpm震荡30min放在5.4.3.2EppendorfMixMate上。
g离心2min5.4.3.3在离心机上以1000×孔板中,放入测序仪中测序。
上清液于965.4.3.4每管吸取10μL序列比对1.9
微生物鉴定系统中进行比对,得MicroSEQ基因测序仪得到的测序结果,在到菌种的种属信息。
关键说明6.时,对于细胞壁比较薄的革兰氏阴性细菌,可挑提取细菌基因组DNA1.1
后,10minOμLddH中,混匀,沸水热变性取一菌环菌株,置于1002确认PCR模板。
必要时做梯度503min分离,稀释倍后做为PCR离心最佳的模板量。
及测序反应时,为了保证酶的活性,整个体系应在冰中配置;然后PCR1.2这种冷启仪上进行反应,最后放于3~5min,PCR置于低温冰箱中冷却扩增的特异性。
动法可增强PCR包含有丰富的细菌种属的特异序列变化较大,500bp1.316SrDNA序列的前500bp性信息,所以对于绝大多数菌株来说,只需要第一对引物测前无法鉴序列即可鉴别出细菌的菌属。
针对科学论文发表或是前500bp的全序列扩增和测序,得到较为全面的别的情况,需要进行16SrDNA5/9
16SrDNA的序列信息。
具体参照附录。
或出现非特异性条带的原因:
一是引物与靶序列不完全互补、PCR离子浓度过高、退火温度过低,及引物聚合形成二聚体。
二是Mg2+往往一些来源的酶易出循环次数过多有关。
其次是酶的质和量,PCR则不出现,酶量过多有时也会出现非现非特异条带而另一来源的酶
物。
减低酶量或调换另特异性扩增。
其对策有:
必要时重新设计引
数。
适当一来源的酶。
降低引物量,适当增加模板量,减少循环次
℃左右退火与延伸)。
提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性,65其原因往往由于酶量扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
PCR浓度过高,退火温度过浓度过高,Mg2+差,过多或酶的质量dNTP或调换另一来源的酶。
其对策有:
减少酶量,低,循环次数过多引起。
度。
增加模板量,减少循环Mg2+浓的浓度。
适当降低②减少dNTP次数。
污染。
RT阴性对照检测是否被基因组DNA用模板浓度过高
10ul体系100ngDNA6/9
附录(资料性附录)结果电泳图三部分的PCR1.细菌16SrDNA
2000b
1000b
750b
500b
250b
100bp
M:
DL2000;
1:
引物27F和519R的PCR产物(第1部分500bp)
2:
引物357F和1115R的PCR产物(第2部分750bp)
3:
引物926F和1492R的PCR产物(第3部分560bp)7/9
2.细菌16SrDNA鉴定结果
1.1即可反映细菌的种属信息:
500bp16SrDNA前菌株TL140924的鉴定结果
8/9
.
1.216SrDNA前500bp不足以反映细菌的种属信息:
菌株70528的鉴定结果
1.316SrDNA的全序列信息:
菌株70528的鉴定结果
如附录2.2、2.3所示,当待测菌株的16SrDNA前500bp序列不足以将待测菌株与库中菌株区分时,则需要测其16SrDNA全长序列以将其区分。
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- 16 SrDNA 鉴定 菌株 标准 操作规程