ROCKI基因表达下调及其对血管平滑肌细胞迁移的抑制作用Word文档下载推荐.docx
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丝年上月丑日
ROCK.I基因表达下调及其对血管平滑肌细胞迁移的抑制作用
硕士研究生:
白柳
孑旨导教师:
高颖教授
专业名称:
生物化学与分子生物学申请学位:
硕士学位
摘要
目的:
心脑血管疾病已成为威胁人类生命的重要疾病之一。
血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecell,VSMC)的增生和迁移,是许多心脑血管疾病发生的重要因素之一。
Rho/Rho激酶介导的信号转导通路参与了众多血管生理功能的调节,如细胞骨架重组,平滑肌收缩,细胞增生、黏附、迁移以及其他炎症反应过程,而这些细胞功能又与许多血管疾病的发生发展密切相关。
ROCK即Rho激酶,广泛存在于各种组织中,有两种同源异构体ROCK.I,ROCK-II。
Rho激酶在多种组织器官的平滑肌收缩中起作用【21。
Rho激酶被Rho蛋白激活后,对下游肌球蛋白进行磷酸化,使胞浆中的肌球蛋白轻链磷酸化水平增加,进一步使肌动蛋白和肌球蛋白交联增加,从而使肌动蛋白微丝骨架聚合,引起肌动.肌球蛋白收缩,最终引起VSMC迁移。
阐明Rho激酶与血管平滑肌细胞的迁移的分子机制,将为许多心脑血管疾病的研究和治疗提供重要的理论依据【3,4】。
本研究拟采用RNA干扰技术,对ROCK.I基因表达进行下调,研究ROCK.I基因与血管平滑肌细胞迁移的关系。
为进一步研究Rho激酶与血管平滑肌细胞迁移的分子机制提供实验依据。
方法:
根据大鼠ROCK.I基因参考序列设计合成siRNA,通过实验筛选出有效的siRNA,然后通过脂质体将ROCK.I的siRNA转入ATr5细胞,对于转染后的细胞进行如下实验:
1.提取细胞的总RNA,然后做逆转录PCR,在基因水平上检测ROCK.I基因表达下调的情况;
2.提取细胞总蛋白,通过蛋白印迹技术,在蛋白水平上检测ROCK.I基因表达下调情况;
3.用Boyden微孔膜双槽法进行细胞迁移实验,测定ROCK.I基因表达下调前后细胞迁移率的影响。
结果:
’1.siRNA转染效率实验
运用带有荧光标记的siRNA分别转染细胞(5h、24h、48h、72h),在荧光显微镜下观察细胞的转染效率,并进行细胞计数和统计分析。
每组时间段做4个平行孔,实验重复3次。
结果显示:
转染效率分别为77.8%、85.2%、83.3%和85.7%。
siRNA5h即可被成功地转染到细胞中,以48或72小时的转染效果最佳。
2.脂质体毒性实验
用不同浓度的脂质体(分别为0、0.56ng/I.tl、0.83ng/I-tl、1.67ng/Ixl)进行转染,在不同的时间段(24h、48h、72h)收集细胞并进行细胞计数,计算出不同浓度脂质体在不同时间段的细胞死亡率,结合上述siRNA转染效率实验,确定siRNA转染效率最高时脂质体的浓度和最佳的转染时
间。
最终确定脂质体最佳浓度为0.56ng/I-tl一0.83ng/I_tl。
3.在基因水平上的检测:
转染48h和72h后,分别提取细胞总RNA,进行RT.PCR反应,在
基因水平上检测RNA干扰前后ROCK.I表达量的变化。
研究显示siRNA转染后ROCK·
I表达量与对照组相比明显下降(P=0.012)。
4.在蛋白水平上的检测ROCK.I表达:
运用免疫印迹技术,检测转染72h后细胞中ROCK.I表达量的变化。
实验结果显示:
转染组细胞中ROCK.I蛋白的表达量比对照组明显降低(P=0.022)。
5.PDGF—BB诱导血管平滑肌细胞(A7r5)迁移:
利用血小板源性生长因子BB二聚体(PDGF.BB)作为诱导剂诱导细胞迁移,用Boyden微孔膜双槽法检测细胞迁移。
实验结果显示,PDGF·
BB在低浓度时,诱导剂与细胞迁移数量存在剂量依赖关系,随着浓度的增加,细胞迁移的数量增加。
当PDGF.BB达到5ng/ml时,随着诱导剂浓度的增加,细胞迁移的数量下降。
因此,得出PDGF.BB的最佳诱导浓度为5ng/ml。
6.ROCK.I基因表达下调对血管平滑肌细胞(A7r5)迁移的影响:
用5ng/mlPDGF.BB诱导剂,以Boyden微孔膜双槽法建立的细胞迁移的模型,观察不同剂量的siRNA对平滑肌细胞(A7r5)迁移的影响。
实验组与对照组分别设置6个平行孔。
显微镜下观察到细胞迁移数量随着siRNA剂量的增加而呈减少的趋势,表明ROCK.I基因表达下调可以抑制血管平滑肌细胞(A7r5)的迁移,实验组与对照组相比经统计学分
2
析有显著差异(P-0.000).
结论:
通过RNA干扰方法成功地使ROCK.I的基因表达下调,证实ROCK—I基因表达的下调可以抑制血管平滑肌细胞的迁移。
这些研究为进一步探讨ROCK—I与血管平滑肌细胞迁移的分子机制提供了实验依据。
关键词ROCK—IRNA干扰平滑肌细胞迁移血小板源性生长因子
DownRegulationofROCK-·
IGeneExpressionandits
inhibitiontoVascularSmoothMuscleCellMigration
Masterdegreecandidate:
BaiLiuSupervisor:
ProfessorGaoⅥngMajor:
BiochemistryandMolecularBiology
Abstract
Objective:
Accordingtotherelevantdata,therewere15.3millionpeopledieofcardioVasculardiseasesandcerebrovasculardiseases,whichaccount1/4ofthetotalnumberofdeath.Sothecardiovasculardiseasesandcerebrovasculardiseaseshavebeenbecomeoneofthemostfataldiseases.Accordingtosomeanimalexperimentresearch,itwasconfirmedthatRho·
kinaseparticipatedinthepathogenesyofthediseasessuchasangios-clerosis,angiospasm,ischemicalreperfusioninjury,pulmonaryarteryhy—pertension,palsy,hypertensionandcongestiveheartfailure.Therecent
researchhasfoundthatRho/Rho-kinasesignaltransductionpathway
participatesthedevelopmentofthecardiovasculardiseasesandcerebrovas-culardiseases,SOtheinhibitorofthesignaltransductionpathwaywillpreventandtreatthesediseases.Rho-kinase(Rho—associatedcoiled.coiIkinase,ROCK)isthekeyenzymeinRho/ROCKsignalpathway,therefore,ROCKwillbecomeoneoftheimportanttargetofdrugtreatmentofthediseases.
Rho-kinasegenerallyexistsineverykindoftissues,anditcontainstwoisomers:
ROCK-IandROCK—II,andRho-kinaseplaysanimportantpartinsmoothmuscIeofmanykindoftissues.
Rho/ROCKsignaltransductionpathwayparticipatesinnumerousphysiologicalfunctionalregulations,suchascytoskeletonrecombination,smoothmusclecontraction,cellularproliferationandstick,migrationandotherinflammatoryreactions.Andtheseeellfunctionsareclosecorrelatedwithmanydiseaseofbloodvessel.Inrecentyears,Rho/ROCKsignaltransductionpathwayhasbeenconcernedwideattention.ROCKwasactivatedbyRhoprotein,thenphosphorylated697-threonineofmyosin
4
subunitdownstream,andraisedmyosinlightchainphosphorylationinendochylema,andincreasedactin-myosincrosslinkage,thenactinmicro.filamentframeworkgettogether,finallyitresultsincellsmigration.
Forthisreason,Rho/ROCKwashopedtobecometheimportanttreatedtargetofartherosclerosis,restenosis,hypertension,brainorcoronaryarteryvasospasmandSOon.
Tosumup,ifWecanforbidthevascularsmoothmusclecellstomigrate,wewillprovidesignificanttheoryforstudyandtreattheabovediseases.So,ROCKisconsideredtobecomeanimportanttreatedtarget.Afterliteratureretrieval,wehavenotfoundtherelevantnewsreports,SOthisessaywillbestudiedandresearched.
Method:
WedesignedandsynthesizedsiRNAaccordingtorat
ROCK—IeDNAsequence,thenscreentheeffectivesiRNA.BringsiRNAtoA7r5cellsthroughLipofectamineTM2000Reagent,andthendothefollowingexperiments:
1.InordertocheckthedownregulationofROCK-IgeneexpressionfrommRNAlevel,thetotalRNAwasextractedfromA7r5eellbyTaKaRaRNAisoReagent,andthenfollowedbyreversetranscriptionandPCR.
2.ToconfirmthedownregulationofROCK—Igeneexpressionfrom
proteinlevel,thetotalproteinwasextractedandexaminedbyWestern
Blotting.
3.Themigrationofsmoothmusclecell(A7r5)wasdeterminedbyBoydenChamber.ThevariationofcellmigrationmobilitywasanalyzedwithdownregulationofROCK—Igeneexpression.
Result:
Afterrepeatingandconsiderableexperimentsmanytimes,we
getthefollowingresults:
Theefficiencyoftransfection:
WeusedsiRNAwhichcontainfluorescentlabelingtodotheexperimentofinterference.Thecellsweretransfectedrespectivelyby5h,24h,48hand72h,andthenobservedunderthefluorescencemicroscope.FromthepicturesWeobtained,itshowedthatthebestefficiencyoftransfectioniStransfectionafter48hor72h.
AssayofLipofectaminetoxicity:
Inordertofindoutthebest
concentrationofLipofectamine,WeUSedifferentconcentrationofLipo.
fectaminetotransfectthecells.Thecellsmortalityratewascalculateafter
5
differenttransfectiontime.Theresultssuggestthatthebestconcentration
ofLipofectamineiS0.56ng/ttl一0.83ng/p1.
Assayfromgene:
ToconfirmthedownregulationofROCK·
IgeneexpressionfrommRNAlevel,thetotalRNAwasextractedfromA7r5cellaftertransfection48hor72handthenfollowedbyreversetranscriptionandPCR.ThroughanalysisbySPSSsoftware,thedatashowedthattheexpressionwasgreatlydecreasedafterRNAinterference.
Assayfromprotein:
InordertodetectthedownregulationofROCK-Igeneexpressionfromprotein,thetotalproteinwasextractedformA7r5cellaftertransfection72handthenfollowedbyWesternblot.ThenwedetectedtheproteinbyECLandanalyzedbySPSSsoftware.ThedatashowedthatthattheexpressionwasgreatlydecreasedafterRNAinterference.
Selectionoftheoptimalconcentrationofcellmigrationinductor(PDGF—BB):
Becauseofthedose-dependentrelationshipbetweencellmigrationandPDGF—BB,weshouldchoosetheoptimalconcentrationtodotheexperiment.Fromtheexperimentofcellmigration,wefoundthattheoptimalconcentrationofPDGF-BBis5ng/m1.
Experimentofcellmigration:
WeuseddifferentdoseofsiRNAtodoexperimentofcellmigrationusingtheoptimalPDGF-BBthroughthemethodofBoydenchamber.ThenweobservedunderthemicroscopeandanalyzedbythesoftwareofSPSS,andobtainedthecoincidentresults:
ThenumbersofcellmigrationweregreatlydecreasedafterRNAinterference.
Conclusion:
ThroughthemethodofRNAinterference,wecansuccessfullydownregulatetheexpressionofROCK-Igene.SoitmadegreatsenseoffurtherresearchofthemolecularmechanismofROCK-Iand
cellmigration.
Keywords:
ROCK(Rho·
-associatedcoiled·
-coilkinase)RNAinterferenceCellMigrationVascularSmoothMuscleCell(VSMC)Platelet—DerivedGrowthFactor(PDGF)
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指导教师:
高颖教授专业名称:
生物化学与分子生物学申请学位:
.●▲--●一
翮罱
细胞迁移是机体正常生长发育必不可少的生理过程,而在一些慢性疾病中也伴随着特定细胞的迁移,若能阻止这些细胞的迁移就能够有效地抑制病情的进展pJ。
细胞迁移涉及到细胞骨架和细胞黏附相关的动态组装和空间位置的改变,而Rho家族是肌动蛋白细胞骨架重新组装的重要因子之一,Rho信号通路在协调细胞迁移中起着重要的作用16】。
目前公认的细胞迁移过程是细胞片状伪足的形成,新黏附的建立,细胞体的收缩和尾部的分离17J。
Rho蛋白是单体小G蛋白,作为分子开关控制信号转导途径。
其亚家族有:
Rho(RhoA、RhoB、RhoC),Rac(Racl、Rac2、RhoG),cdc42(cdc42、TCl0、TCL、Wrchl),当Rho蛋白与GTP结合时呈激活状态,而与GDP结合时呈失活状态18】。
鸟嘌呤核苷酸交换因子控制此交换过程,催化Rho蛋白向有活性的GTP转换,而GTPase活化蛋白负性调节Rho
蛋白的活性,使其结合GDP而失活。
当Rho蛋白呈激活状态时,作用于
下游靶蛋白发挥作用【9j。
与大多数分化细胞相比,血管平滑肌细胞(vaslularsmoothmusclecell,VSMC)保持调节自身表型和增殖的能力,以适应多种细胞内和细胞外信号分子和病理刺激。
VSMC分化是通过几种平滑肌特异性收缩和细胞骨架基因的协调表达标志的,而这些基因的表达又受血清反应因子直接调控,RhoA蛋白信号传递是通过调控血清反应因子依赖性的转录而控制VSMC分化的关键机制。
组成性激活的RhoA突变体的表达增加了平滑肌特异性启动子的活性,相反C3转移酶抑制RhoA,减少了平滑肌分化标志基因的表达Il引。
RhoA的表达和活性在收缩性平滑肌中都很高,而在合成型平滑肌中表达很低。
RhoA表达和活性的改变是VSMC表型变化的基础J。
7
RhoA是收缩蛋白Ca+增敏作用的主要调节物,而收缩蛋白是VSMC收缩的主要效应成分。
血管收缩诱导的RhoA依赖的Ca+增敏作用,是通过RhoA效应分子Rho激酶介导的【12J。
Rho激酶(Rho—associatedcoiled.coilkinase,ROCK)是Rho蛋白的下游效应分子,ROCK广泛存在于各种组织细胞中,有两种异构体:
ROCK.I和ROCK-II。
Rho激酶在多种组织器官的平滑肌收缩中起作用[t3,t7】。
ROCK属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员。
它的分子结构包括氨基末端的催化结构域、中间的Rho结合卷曲螺旋结构域和羧基末端pH结构域【141。
在静息状态下,Rho激酶的Rho结合结构域和pH结构域、Rho激酶的催化结构域相互作用,从而抑制激酶活性。
激活状态的Rho与Rho激酶的结合结构域相互作用而改变Rho激酶的构型,使Rho激酶被激活,并引导其下游一系列磷酸化/脱磷酸化反应【15,16,181。
在细胞迁移的过程中,片状伪足的形成是细胞迁移的第一步,与肌动蛋白聚合有关,主要受Rac调节。
其激活途径有两种,一是通过磷脂酰肌醇.3.激酶通路,另一通路是DOCKl80使Rac蛋白活化【19】。
第二步是片状伪足通过黏着斑与细胞外基质黏附。
黏着斑是细胞与细胞外基质的连接点,黏着斑的装配激活了Rho蛋白,其中主要是Rac和Cd42,当细胞置于纤维连接蛋白环境时,则能激活Rac和Cd42诱导的细胞迁移。
接下来是细胞体收缩,依赖
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