猪细小病毒VP2基因与猪圆环病毒2型ORF2基因共表达对PPV病毒样颗粒形成的影Word格式.docx
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PCV2
2onPPVViruslikeParticlesFormatORF2’
XUZhi2wen,CHENYang,CHENDi2shi,ZHULing,WANGYin,WANGXia
o2yu
()Abstract:
Inthisexperiment,theamplifiedVP2genePPVstrainSC21wasinsertedintoeu2
karyoticexpressionvectorpPI22.EGFP,andtherecombinantplasmidpPI22.EGFP.VP2wasob2tained.PCV2ORF2genewasamplifiedusingtherecombinantplasmidp
MD2PCV2whichcon2tainsthewholegenomeofPCV2strainSCastemplate,thenthege
newasinsertedintopPI22.EG2
FP.VP2,andtheeukaryoticexpressionvectorpPI22.EGFP.VP2.ORF2containing
PPVVP2gene,PCV2ORF2geneandEGFPreportgenewasconstructed.Transfection
ofpPI22.EGFP.VP2.ORF2DNAtoverocellwasmediatedbyliposome,thefusionexp
ressionofgreenfluores2centproteinwasobserved.Verocellswhichshowedobvious
greenfluorescentwerepreparedforelectronmicroscopeobservation,theresultssuggestedthattherecombinantvirus2likeparticles’s
()病毒农农粒Virus2likeparticles,VLPs农VLPs能以基因工程或化学交农的方法农其表面是含农一步修农改造,从而引入异源性多农
有某农病毒的一或多个个农构蛋白的空心农粒,不含或异源DNA,作农疫苗农体使用。
VLPs作农一农
有病毒的核酸,不能自主农制,其在形农上病毒粒与新型的非农制型农体,农免疫防制提供了一有个效且
子相同或相似。
VLPs本身可以作农疫苗使用,安全的策略。
且具有安全性高、免疫原性强、农定性好等农点,
收稿日期:
2008212208
()基金细目:
国家自然科学基金30500019;
四川省育教农重点农农室农农。
()猪农小病毒Porcineparvovirus,PPV是PCV2SC株的序列农农一农引物根据
农增引起RF2基因,上下游引物均农置BamHI农切位点。
O
母猪繁殖障碍的主要病原之一,PPV感染主要引P3:
5′2caggatccatgacgtatccaaagaagc23′,起胚胎和胎死亡儿、重吸收、流农、木乃伊胎P4:
5′21,2][等,但母猪不表农明农的症状。
PPVVP2基因caggatccttatcacttcgtaatggtt23′,由大农生宝作农农蛋白基因构,具有良好的免疫原性,并可物公司合成。
自我装配形成1.5PPVVP2基因和PCV2ORF2基因的325][(VLPs。
猪农农病毒2型PorcinecircovirusPCR、克隆及其序列细定
)2,PCV2是引起仔猪多系农衰竭农合征农代表的系列在ST农胞上采用早期接农的方法增殖PPV,[6]疾病的病原,主要侵害6,12周农的仔猪。
PCV2待农胞出农30%,50%左右病农农提取PPVR
因作农农蛋构白基因农农也具有良好ORF2,基农μFDNA作农模板。
VP2基因的农增采用25L反[7]的免疫原性。
农2农疾病在世界各地泛广存在,农[8]并且其感染具有农同性。
因此,农农2农疾病的防体系,按如下程序农行:
95?
农农性5min,95?
30s治一直是猪病研究的农点之一。
本文通农共表达P
5315?
45s,72?
2min,35个循农后,72?
PVVP2基因、PCV2ORF2基因,以探农其
农农延伸10min。
农农泳分析PCR农物后,将其小病毒病毒农农粒的形成的影响,农究研农小病毒病克隆到PMD182T农体中,得到重农农粒pMD2VP2毒农农粒的形成机制及其作农疫苗农的策略究打体研,KpnI和BamHI双农切农定及农序。
下了基农,同农,也农农一步究研其功能农用打下与了
以含有因的重农农粒PCV2ORF2p基基农。
材料与方1MD2
法μPCV2农模板农增ORF2基因,采用25L反农体()1.1毒菌株、细胞系,按以下程序农行:
95?
农农性5min,95?
30和细粒
s,57?
1min,72?
1min,35个循农后,72?
延伸PPV2SC1株由四川农农大农学物生物技农中心
10minPCR,农农泳分析物后其克。
农将α()下称本室分离农定保存,E.coliDH5,ST农
隆到胞,Vero,pPI2.EGFP,胞由本室保存农2
PMD182T,pMD2ORF2体中农粒农得到重农。
pMD2
1.6PPVVP2因的真核表达细体pPI2.含基2PCV2由本室建保存构,pMD182TVector农自大农
EG2宝生物公司。
FP.VP2的构建1.2细主要
用KpnI和BamHI分农农切pMD2V细
P2和pPI22.EGFP并回收目的片段,农农接农化BamHI内切农农自大农宝生物公等
得到重农农粒pPI22.EGFP.VP2。
用KpnI司,2×
和BamHITaqPCRMasterMix农自北京天农农代公司;
农粒抽
农行双农切农定。
提农农盒,胶回收农农盒农自OMEGA公司,LI2
1.7含PPVVP2基因、PCV2ORF2基因的POFECTINReagent2000自Invitrogen农公
真核表达细体pPI22.EGFP.VP2.ORF2的构,6司
孔农胞培农板农自晶美公司。
建
细1.3主要用BamHI分农农切pMD2ORF2和pP
I22.EGFP.VP2并回收目的片段,农农接农化得到重器农体介农法,将其农入哺乳农物农胞Vero农培农箱()公微FormaScientific司,型台CO2胞。
具体操作参照脂农体农染农农盒LIPOF式()离心机Beckman公司和Sigma公司;
PCR农ECTIN
(Ep2Reagent2000明农农行。
农
)()pendorf公司,正置农光农微农Nikon公司,全自1.9切片细细细察超薄
()(农凝胶农像分析系农UVP公司,透射农农日立取农染后出农明农农色农光的Vero农胞,用常农
)H2600A型。
胰农消化后,收集农胞3000r/min4?
心离10min1.4PCR物细细及合的引,尽弃清上,215%的戊二农,4?
固定24h后,
四川农农大学学农第27卷102
2.3真核表农农达体pPI22.EGFP.VP2的建构按常农方法修农、固定、包埋、切片,分农农醋酸农和
(()将pPI22.EGFP农体717kb和目的片段农檬酸农染色后,H2600A日立透射农农农察。
用型
)1.10PPVVP2PCV2ORF2118kb黏端农接后得到重农农粒pPI22.EGFP.V基因、基因的表达
并用KpnI和BamHI农行农双切农定。
如农3。
细细
农果表明:
pPI22.EGFP.VP2农粒大小农农ELISAPPVVP2将农染液用农农因、方法基
915PCV2ORF2因在核农真胞中的表达情况。
基细果2KpnBamHkb,II717kb118k和双农切农农和
b基因的、2.1PPVVP2PCR克隆及其序列细2大小的条农。
定
2.4pPI2.EGFP.VP2.ORF2细体真核表达2的PPVRFDNA,P1以提取的病毒农模板以
建构和
用BamHI分农农切pMD2ORF2和pPP2农引物农增出了大小农农118kb的条农,农果农与
I22.EGFP.VP2并回收目的片段,然后农接农化得期的大小一致,农果如农1,重农农粒p
到重MD2
农农粒pPI22.EGFP.VP2.ORF2。
用BamHIKpnBamH行农切双农农VP2II1174kb用和农
农行农切农定,得到大小农915kb和730bp的227kb2和1小的。
大条农
条农,表明ORF2基因成功插入pPI22.2.2PCV2ORF2PCR克隆及其序列基因的、
EGFP.VP2中;
用KpnI与BstBI双农切农定细定
以重农农粒pMD2PCV农模板,以P3和P4农
引物农增出了大小农农730bp的条农,农果农与期
细5nI与HI双细KpBam
切
pPI22.EGFP.VP2.ORF2细
细
Figure5IdentificationofpPI22.EGFP.VP2.O
RF2byKpnI/BamHIdigestion
λ2M1:
DL2000M2:
EcoT14;
1:
pPI22.E
GFP.
细7pPI22.EGFP.VP2.ORF2DNA2.5pPI22.EGFP.VP2.ORF2DNA细染Vero细细染
胞细胞后的细细细察(a),细胞细照(
b)采用脂农体介农法将pPI22.EGFP.Figure7ElectronmicrographsofpPI22.EGFP.VP2.VP2.ORF2DNA农染Vero农胞,在倒置农光农微农
表1pPI22.EGFP.VP2.ORF2下农察农色农光。
如农6。
细染2.6切片细细细察超薄VP2ORF2后、表达农农染后出农明农农色农光的Vero农胞培农物农行透细细
射农农农察,农果如农7所示。
可以看出,在农胞农中存农农PPV2AbPCV22AbGroupsODOD492nm492nm在大量的病毒农农粒,大小农农20,
pPI22.EGFP.VP2.ORF2农30nm,聚集成农,散存在。
其农或分0.4750.357粒、的表达2.7PPVVP2PCV2ORF2基因基因Rrecombinantplasmid0.1320.162pPI22.EGFP农粒农照细细Controlofblankpla1.1742.236采用ELISA方法初步农农到农染液与Psmid阳清性血农照ControlofpositiveserumPV、PCV2高免血农清生抗原抗体反农,农表1,初步0.0780.062农性血清农照细细3Controlofnegativeserum
目前,人农已研制出了多农疫苗,并在各农疾病的农防和控制中广泛农用。
衡量疫苗农农农用的农
准主要有2个,一是安全性,二是有效性。
农活疫
苗和农农位疫苗比农安全,但由于不能激农农胞免疫,
免疫原性农差。
减毒疫苗、重农活农疫体苗和核酸
疫苗免疫原性农好,既可激农机体的液免疫体,又可
启农机的农胞体免疫。
但是减毒疫苗可能由于减毒
不农底而引农农床感染或引起免疫抑制,农存在着
由于农生农或异与野毒株农生基因重农农致毒力返强的
危农。
重农活农疫苗体农无常农活苗毒力返强
细6pPI22.EGFP.VP2.O之农,但其重农农用于同一宿主可能农农农农体的自身免RF2疫,甚至有回农突农引农免疫低下,宿主农生疾病或死DNA细染Vero细胞的细
光亡的危农。
以VLPs农基农的疫苗制研既克服了农农Figure6GreenfluorescentofpPI22.EGFP.VP2.O农活疫苗免疫原性不高的缺点,也克服
四川农农大学学农第27卷104
了活疫苗安全性的限制,而由于其不含有农农物农,有2个主要的农放农农框ORF1和ORF2
其中又可以大量制农,具有良好的安全性和免疫原性。
ORF2基因是PCV2的主要农构蛋白基因,农农病本文探农了PPVVP2基因与PCV2ORF2基因[7][9]毒的衣壳蛋白可自我配成装病毒农粒子,由此可共表达农病毒农农粒形成的影响,Martinez等将
推农ORF2表农达物可能具有与全病毒相似PPVVP2基因克隆到杆状病毒系农中,并成功[14]的免疫学特性。
Blanchard等研究农农地在昆虫农胞中高效表达,表明VP2多农能农自我
PCV2ORF2装配成VLPs,其形农与天然衣壳非常相似,能农引
基因的杆状病毒表农达物免疫猪,农农猪农生可抵御农农助性T淋巴农胞和农胞毒性T淋巴农胞农生强烈
PCV2强毒攻农。
因此,本究研农农以PCV2的的免疫农答,用其免疫母猪能农使母猪抵御强毒的
ORF衣壳蛋白基因2农外源片段。
攻农。
农研究农猪农小病毒新型农农位疫苗的
PCV2农床上常与PPV共同感染,引起农重的研究提供了新思路,而且,PPVVLPs不农自身可
农农学农农的农床病例。
T.opriessnig更是指出,以作农疫苗,在外源多农的农运及多价疫苗的制研中
[10]目前所农道的所有PPV毒株都农PCV2有增效作也农农重要作用。
Sedlik等将PPVVP2和包[15]用。
因此农2农疾病的防治一直是猪病研究的()含淋巴农胞农农农脉炎病毒LCMV的1182132位氨
农点,若能研制同农农防农2农疾病的疫苗可以农基酸的抗原定决簇区相农,然后克隆于杆状病毒表
化猪农农农的免疫程序有农广的前景。
本文根具达体农农PACYM,农染表达VP22LCMV蛋白,利
PPVVLPs,据的疫苗农体特性的原理达具有共表用农重农蛋白免疫鼠可以农农强烈的农胞毒性T农胞
PPVVP2基因与PCV2ORF2基因,以探农其农猪()反农CTL反农,在体内持农农农农达9个月,并可抵
[11]农小病毒病毒农农粒形成的影响,农有究表明研,在抗致死量的LCMV攻农。
Pan等在PPVVP2
农小病毒农农粒的不同位置上可以插入外源多农基因N端插入PCV2抗原表位,在腺病毒中成
而通农病毒粒子的3D农构是到找允农外源片段入插()功表达出农合病毒农农粒[PPV:
VLP2PCV2],具
位点的唯一合理的途径,B农胞的抗原决定族多位有良好的免疫原性。
[12]于病毒粒子的表面,而T农胞的抗原决定族多位插入GilbertCPVVP2NEG2等的末端在
于病毒粒子的内部,农小病毒病毒农农粒农免疫已农能FP,并通农杆状病毒表达系农表达形成
农农农强烈的B农胞,TH农胞和CTL反农(了fVLPsfluorescentvirus2likeparticles,含[16]。
本研究共表达PPVVP2基因与)农色农光蛋白的病毒农农粒。
共聚焦农微农农察农果表明
PCV2,EGFP2
ORF22个基因,得到的表达农物与PPV病毒农农VP2融合表达并装配形成具有农色农光的空壳病
参考文献毒农合物;
农农农察表明,其大小和形农与
殷震,刘景农.农物病毒学[M].北京:
科学[1]VP2出版社,VLPs相似;
农化的EGFP2VP2农合物免疫农农表1997.[2]VanLeengoedLA,VosJ,GruysE,etal.Porcineparvo明,EGFP和VP2的农构均有没农生改农。
AlanAvir2usinfection:
reviewanddiagnosisinasowherdwit[13]等在运用X射农农晶照相农研究杆状病毒表达()hrepro2ductivefailure[J].VetQ,1983,53:
1312141.[3]MartinezC,DalsgaardK,LopezdeTurisoJA,etal.的PPV衣壳蛋白农指出,PPV与CPV衣壳蛋白Pro2
ductionofporcineparvo2virusemptycapsidswithhighi十分相似。
本文借农农思路,在建构表达农体农,E[4]mmu2G2nogenicactivity[J].Vaccine,1992,10:
6842690.FP位于VP2基因N端,并得到融合表达,表SedlikC,SaronM,SarrasecaJ,etal.Recombina
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