植物分子生物学实验技术Word文件下载.docx
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制备过程中,细胞破碎的同时就有Dnase释放到提取液中,使DNA因被降解而影响得率,在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和EDTA,既可抑制酶的活性又可使蛋白质变性而与核酸分离,再加入阴离子去垢剂0.15%的SDS,经过2h搅拌,或用氯仿-异醇除去蛋白,通过离心使蛋白质沉淀而除去,得到的是含有核酸的上清液。
然后用95%的预冷乙醇即可把DNA从除去蛋白质的提取液中沉淀出来。
(一)植物DNA的SDS提取法:
(来自Youaresolate的新浪空间)
试验试剂:
1、研磨缓冲液:
称取59.63gNaCl,13.25g柠檬酸三钠,37.2gEDTA-Na分别溶解后合并为一,用0.2mol/L的NaOH调至pH7.0,并定容至1000ml。
2、10×
SSC溶液:
称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠,分别溶解,一起定容至1000ml。
3、1×
用10×
SSC溶液稀释10倍。
4、0.1×
用1×
5、Rnase溶液:
用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液,用1mol/LHCl,pH至5.0,使用前经80℃水浴处理5min(以破坏可能存在的Dnase)。
6氯仿-异戊醇:
按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。
7、5mol/L高氯酸钠溶液:
称取NaClO4.H2O70.23g,先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。
8、SDS(十二烷基硫酸钠)化学试剂的重结晶:
将SDS放入无水酒精中达到饱和为止,然后在70~80℃的水浴中溶解,趁热过滤,冷却之后即将滤液放入冰箱,待结晶出现再置室温下凉干待用。
9、1mol/LHCl。
10、0.2mol/LNaOH。
11、二苯胺乙醛试剂:
1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中,添加1.5ml浓硫酸,装入棕色瓶,贮存暗处,使用时加0.1ml乙醛液[浓乙醛:
H2O=1:
50(V/V)]。
12.1.0mol/L高酸溶液(HClO4)。
13、高氯酸溶液。
14、0.05mol/LNaOH。
15、DNA标准液:
取标准DNA25mg溶于少量0.05mol.L-1NaOH中,再用0.05mol/LNaOH定容至25ml,后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中,加5.0ml1mol/LHClO4,混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度,则得100μg/ml的标准溶液。
实验步骤:
1、称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中,加10ml预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS,置冰浴上研磨成糊状。
2、将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液,加上塞子,剧烈振荡30s,转入离心管,静置片刻以脱除组织蛋白质。
以4000rpm离心5min。
3、离心形成三层,小心地吸取上层清液至刻度试管中,弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质和下层的氯仿。
4、将试管置72℃水浴中保温3min(不超过4min),以灭活组织的DNA酶,然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温,加5mol/L高氯酸钠溶液[提取液:
高氯酸钠溶液=4:
1(V/V)],使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。
5、再次加入等体积氯仿-异戊醇混合液至大试管中,振荡1min,静置后在室温下离心(4000rpm)5min,取上清液置小烧杯中。
6、用滴管吸95%的预冷乙醇,慢慢地加入烧杯中上清液的表面上,直至乙醇的体积为上清液的两倍,用玻璃棒轻轻搅动。
此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。
7、然后加入0.5ml左右的10×
SSC,使最终浓度为1×
SSC。
8、重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。
9、加入已处理的Rnase溶液,使其最后的作用浓度为50~70μg/ml,并在37℃水浴中保温30min,以除去RNA。
10、加入等体积的氯仿-异戊醇混合液,在三角瓶中振荡1min,再除去残留蛋白质和所加Rnase蛋白,室温下以4000rpm离心5min,收集上层水溶液。
11、再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。
(二)植物DNA的CTAB提取法:
试验步骤:
1、称取新鲜叶片2-3g,剪碎放入研钵中,在液氮中研磨成粉末。
2、将粉末转移到加有7ml经预热的15×
CTAB提取缓冲液15ml离心管中,迅速混匀后置于65℃水浴中,温育30min。
3、取出离心管,冷却至室温,加入氯仿/异戊醇(24:
1),充分混匀,室温下2300转离心20min。
4、将上清转移至另一新的15ml离心管中,加入1/10体积10%的CTAB和等体积的氯仿/异戊醇。
充分混匀,2300rpm离心20min。
5、转移上清至另一新的15ml离心管中,加入等体积1%的CTAB沉淀缓冲液,轻轻摇晃至形成DNA絮状沉淀。
1000rpm离心10min,使DNA沉淀于管底。
6、加入1.5-2ml的1mol/LNaCl和5μlRNase置于56℃水浴中过夜。
7、待DNA完全溶解后,加2-3ml4℃预冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀,挑出DNA,置于15ml离心管中,用70%乙醇清洗30min。
8、离心机甩5s,倒出70%乙醇,再用95%乙醇浸泡5min,倒出95%乙醇,在超净工作台上吹干。
9、将风干的DNA直接在4℃保存备用或溶于100μlTE溶液中于-20℃保存.
(三)植物叶片DNA的提取步骤(来自 b04a 43e2 bbfc d1e1a002dc21)
实验步骤
1、在50ml带盖离心管(放在-20度预冷)中加入20ml提取缓冲液I,60℃水浴预热。
2、水稻幼苗或叶子5~10g,剪碎,在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中,剧烈摇动混匀,60℃水浴保温30~60分钟(时间长,DNA产量高),不时摇动。
3、加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液,颠倒混匀(需带手套,防止损伤皮肤),室温下静止5~10分钟,使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。
4、室温下5000rpm离心5分钟。
5、仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入一倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。
6、在1.5mleppendorf管中加入1mlTE。
用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。
7、如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟,再将沉淀移入TE管中。
这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上,以帮助溶解。
8、将DNA溶液3000rpm离心5分钟,上清液倒入干净的5ml离心管。
9、加入5μlRNaseA(10μg/μl),37℃10分钟,除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响,可省略该步骤)。
10、加入1/10体积的3mol/LNaAc和2×
体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置20分钟左右,使DNA形成絮状沉淀。
11、用玻璃捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。
12、将DNA重新溶解于1mlTE中,-20℃贮存。
三、植物RNA的提取
植物细胞内含有细胞质RNA、细胞核RNA和细胞器RNA。
细胞质RNA包括mRNA、rRNA、tRNA。
细胞核RNA主要有细胞质RNA的前体和小分子细胞核RNA(snRNA)、染色质RNA(chRNA)等。
细胞器RNA主要指线粒体RNA和叶绿体RNA。
这些RNA统称细胞总RNA,其中大量的是rRNA,占80%左右。
基因转录产物mRNA在总RNA中只占1%~5%。
不同的mRNA在分子大小、核苷酸序列,以和在细胞内转录水平等方面各不相同,但真核细胞mRNA3ˊ末端都具有20~200个不等的多聚腺苷酸的尾,称为poly(A)结构。
利用poly(A)结构可以把mRNA从总RNA中分离出来。
对于Northern杂交可以使用植物细胞总RNA,也可以使用由总RNA中分离出的mRNA。
植物细胞RNA提取中的主要问题是防止RNA酶的降解作用。
RNA酶是一类水解核糖核酸的内切酶,它与一般作用于核酸的酶类有着显著的不同,不仅生物活性十分稳定,耐热、耐酸、耐碱,作用时不需要任何辅助因子,而且它的存在非常广泛,除细胞内含有丰富的RNA酶外,在实验环境中,如各种器皿、试剂、人的皮肤、汗液、甚至灰尘中都有RNA酶的存在。
因而,生物体内源、外源RNA酶的降解作用是导致RNA提取失败的致命因素。
内源RNA酶来源于材料的组织细胞,提取自始至终都应对RNase活性进行有效抑制。
RNA提取过程中将蛋白质变性剂与RNase抑制剂联合使用效果较理想。
蛋白质变性剂包括酚、氯仿、SDS、Sarkosyl(十二烷酰肌氨酸钠)、DOC(脱氧胆酸钠)、盐酸胍、异硫氰酸胍、4—氨基水杨酸钠、三异丙基萘磺酸钠等;
RNA酶抑制剂有RNasin(RNase阻抑蛋白)、氧钒核糖核苷复合物等。
外源RNA酶的抑制主要是使用DEPC(焦碳酸二乙酯C2HsOCOOCOOCxH5),它能与RNase分子中的必需基团组氨酸残基上的咪唑环结合而抑制酶活性,用于水、试剂和器皿的RNase灭活。
DEPC与肝素合用效果增强,值得注意的是DEPC在Tris溶液中很不稳定,很快分解成CO2和C2H5OH,因而不能用于Tirs溶液的RNase灭活。
水和其它溶液的灭活一般使用0.05%~0.1%DEPC,37℃处理过夜,也有人采用磁搅0.5小时以上的做法。
DEPC处理后的溶液还需高压灭菌,以去除残存的DEPC。
若DEPC去除不净,会破坏mRNA活性。
不能高压灭菌的试剂要使用经过DEPC处理的灭菌蒸馏水配制,然后用0.22μm滤膜过滤。
含有Tris的试剂用经DEPC处理过的水配制,再经高压消毒。
玻璃器皿可以在180℃烘烤8小时以上,不能烘烤的器皿用0.1%的DEPC水处理过夜后再高压灭菌。
提取全过程必须在清洁无尘的环境中进行。
操作人员要使用一次性的手套拿取物品,尽可能避免一切污染机会。
提取时使用的器皿应经过硅烷化处理,以防止RNA被吸附在器皿壁上,造成损失。
RNA电泳使用的电泳槽需用去污剂洗涤,水冲洗,乙醇干燥。
再浸入3%H202溶液中,室温下放置10分钟以上,再用DEPC溶液处理过的水冲洗干净。
总之,实验中所用的试剂、器皿都要经过RNase灭活处理。
尽管如此,有时还会出现在提取的后期RNA被降解的问题。
这是因为RNase活性的抑制只是一个暂时的现象,一旦抑制剂浓度下降RNase就有可能恢复活性。
对于RNA提取来说,这是一个潜伏的危险。
在提取的前阶段,提取液中无疑是有足够的抑制剂,但到了提取后期,抑制成分逐渐减少,残存的RNase就会复活而引起RNA降解。
另外,提取后期发生的RNase污染,那怕是极轻微的,也会使到手的产品降解,因而提取后期要更加小心。
影响植物RNA提取的另一个问题是水溶性的细胞代谢物如酚、多糖等易与RNA结合成胶冻状的不溶物或有色的复合物,它们能影响RNA的质量和产量。
人们采用了多种处理方法来解决这个问题,如对组织提取液进行高速离心去除多糖;
采用低pH值的提取缓冲液抑制酚的解离和氧化;
或用β—巯基乙醇、PVP来抑制酚类的干扰等。
(一)小麦叶片和不同时期种子的RNA的提取(赵双宜,吴耀荣,夏光敏.介绍一种简单高效的植物总RNA提取方法山东大学生命科学学院,济南)
1、取510g材料放入研钵中,加入过量液氮,迅速研磨成均匀的粉末(在研磨过程中,保证材料始终浸在液氮中,研磨约30min左右)。
2、待液氮自然挥发干净后,将材料转入100ml的离心管中,加入68倍体积的裂解缓冲液Ⅰ,轻轻搅拌后,0℃冰浴20min。
3、12000r/min,4℃离心15min。
4、取上清液,加1/3体积的3mol/L醋酸钠(pH5.3),1/5体积的氯仿-异戊醇(24:
1),轻轻混匀,0℃冰浴20min(加5倍体积裂解缓冲液Ⅱ溶解沉淀以提取DNA)。
5、12000r/min,4℃离心15min。
6、取上清,加入等体积冰浴冷却的异丙醇,混匀且冰浴10min。
7、5000r/min,4℃离心10min。
将沉淀溶于5ml含有0.1%的SDS缓冲液中,加入8mil/LLiCl使终浓度至2.5mol/L,冰浴4℃过夜。
8、12000r/min,4℃离心10min。
9、70%乙醇洗涤沉淀两次,空气干燥10min后,溶于DE-PC处理的TE或水中。
加入1/10体积10%重复第四、六步进一步除去蛋白质。
-70℃冰箱保存。
裂解缓冲液Ⅰ成分:
7mol/L尿素,50mmol/LTris-ClpH8.0,10mmol/LNa2EDTA,pH8.0,3.5mol/LNaCl,6.25%Tris饱和酚pH8.0,0.1%SDS+0.1%LDS。
裂解缓冲液Ⅱ成分:
7mol/L尿素,50mmol/LTris-ClpH8.0,10mmol/LNa2EDTA,pH8.0,3.5mol/LNaCl,6.25%Tris饱和酚pH8.0,0.1%SDS+1%LDS。
(二)植物总RNA的提取(XX文库)
Trizol试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂,在匀浆和裂解过程中,能在破碎细胞、降解蛋白质和其它成分,使蛋白质与核酸分离,失活RNA酶,同时能保持RNA的完整性。
在氯仿抽提、离心分离后,RNA处于水相中,将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。
Trizol试剂配制
苯酚饱和液(38%)-380ml/l、硫氰酸胍盐(0.8M-118.16g)、硫氰酸铵(0.4M)--76.12g、醋酸钠pH5(0.1M)-33.4ml、甘油–50ml,加水至1L
实验试剂
1、无RNA酶的无菌水:
用将高温烘烤的玻璃瓶(180℃2小时)装蒸馏水,然后加入0.01%的DEPC(体积/体积),处理过夜后高压灭菌。
2、75%乙醇:
用DEPC处理水配制75%乙醇,(用高温灭菌器皿配制),然后装入高温烘烤的玻璃瓶中,存放于低温冰箱。
3、氯仿:
异戊醇[24:
1(v/v)]、氯仿。
4、异丙醇、无水乙醇、70%乙醇。
5、Trizol试剂。
操作步骤
1、取植物嫩叶,液氮研磨,每1.5mltube分装0.1克样品;
2. 每管加入0.5mlTrizol液,迅速混匀,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
3、室温下静置5~10分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离
4、加入0.5ml的氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒,室温静置5分钟
5、10000r/min离心10分钟
6、取上清液(水相)转入一新的离心管,加入等体积异丙醇,室温放置10分钟,10000r/min离心10分钟。
7、弃去上清液,加入至少1ml的70%乙醇,涡旋混匀,4℃下7500r/min离心5分钟。
8、小心弃去上清液,然后室温或真空干燥5-10分钟,注意不要干燥过分,否则会降低RNA的溶解度。
然后将RNA溶于TE或DEPC处理过的水中,必要时可55℃-60℃水溶10分钟。
RNA可进行mRNA分离,或贮存于70%乙醇并保存于-70℃
(三)CTAB方法提取植物叶片RNA(XX文库)
1、取叶片材料两克,液氮中研磨成细粉末。
2、每管加入10ml65℃预热的CTAB提取液和500µ
lβ-巯基乙醇,剧烈涡旋匀浆,65℃水浴温育30min。
3、每管加入10ml氯仿:
异戊醇(24:
1),涡旋混匀,冰浴10min。
4℃,12000rpm离心10min。
4、取上清,加入1∕3体积的8MLiCl和500µ
lβ-巯基乙醇,-20℃沉淀过夜。
5、4℃,12000rpm离心20min。
6、弃上清,沉淀用4ml异硫氰酸胍变性液溶解,加入120µ
lβ-巯基乙醇和880µ
l2MNaAc(pH4.0),混匀后加入5ml的酚:
氯仿:
异戊醇(25:
24:
1),涡旋混匀,冰浴5min。
7、取上清,加入等体积酚:
1),涡旋混匀,冰浴5min。
8、取上清,加入等体积氯仿:
9、取上清,加入1∕10体积的3MNaAc(pH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇,-20℃放置过夜。
10、4℃,14000rpm离心20min。
弃上清,沉淀用预冷的75%乙醇漂洗2次,每次洗涤后,14000rpm离心10min,弃上清。
冰上干燥RNA沉淀。
11、加入100µ
lRNase-free-ddH2O溶解沉淀。
取10µ
l稀释200倍检测UVλ230、260、280下的OD值,检测RNA样品的纯度与浓度。
取5μg进行RNA样品的电泳检测,以检测rRNA的完整性,其余样品加入3倍体积的无水乙醇于-70℃下保存。
(四)硅藻土-苯酚法(一种广泛适用的RNA提取方法)(来自李晓宇的方法)
利用硅藻土能够有效吸附RNA酶的特性,结合高盐、PVP和乙二醇丁醚沉淀等过程,建立了高效高质量RNA提取方法.该方法适应性广,可以从富含RNase和多糖、多酚等代谢产物提取RNA困难的动、植物和微生物材料中提取高质量总RNA植物组织RNA提取的难点和对策。
具体步骤:
(全过程均在冰上操作,保持样品温度在0~4℃)
1、样品液氮速冻,于研钵中研磨成细微粉末并转入预冷的离心管;
2、按照4ml/g的比例加入硅藻土提取缓冲液,充分震荡后加入1/2体积的水饱和酚和1/2体积的氯仿∶异戊醇(24∶1),震荡混匀;
3、4℃12000g离心10min,取上清加入等体积5mol/LKAc(pH4.8),混匀后冰浴10min;
4、4℃13000g离心10min,液相转入新管,重复上述酚仿抽提,直至界面清亮;
5、上清移入新管,加入等体积乙二醇丁醚,混合均匀后,冰上放置1h;
6、4℃14000g离心15min,沉淀用75%乙醇洗2次,空气干燥后用适量DEPC-H2O溶解,-70℃保存。
硅藻土提取缓冲液:
20mmol/L柠檬酸钠(pH7.0),10mmol/LEDTA,0.5%SDS,1%β-巯基乙醇,100mmol/LNaCl,1.9g/L处理过的硅藻土。
(121℃高压灭菌20min,冷却后再加入1%β-巯基乙醇,4℃保存)。
硅藻土的处理:
5g硅藻土用50ml50mmol/LTris-HCl(pH7.6)溶解,于100℃放置5min。
室温2500g离心5min。
弃上清,沉淀用40ml50mmol/LTris-HCl(pH7.6)重悬。
重复离心和重悬的步骤两次。
超声1min。
室温3500g离心15min.。
沉淀用30ml50mmol/LTris-HCl(pH7.6)重悬。
4℃储存。
实验二:
PCR和QPCR
普通的PCR是进行定性分析的,而QPCR是进行定量分析的,是检测初始量的,并且在进行PCR是标准曲线的制作是非常重要的。
一、PCR
PCR(PolymeraseChainReaction)即聚合酶链式反应,是指在DNA聚合酶催化下,以母链DNA为模板,以特定引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步骤,体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
是一项DNA体外合成放大技术,能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。
可用于基因分离克隆,序列分析,基因表达调控,基因多态性研究等许多方面。
(一)PCR的原理
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。
双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链,在DNA聚合酶的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。
在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。
因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,加入设计引物,DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
(二)PCR反应体系(XX文库)
10×
扩增缓冲液
10μl
4种dNTP混合物
200μl
引物
10~100μl
模板DNA
0.1~2μg
TaqDNA聚合酶
2.5μl
Mg2+
1.5mmol/L
加双或三蒸水
100μl
1、无Mg2buffer:
由纯水、kcl、Tris组成。
Tris用于调节反应体系pH值,使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。
kcl可降低退火温度,但不能超过50mmol/L,否则会抑制DNA聚合酶活性。
2、Mg2:
终浓度为1.5~2.0mmol/L,其对应dNTP为200μmol/L,注意Mg2与dNTPs之间的浓度关系,由于dNTP与Taq酶竟争Mg2,当dNTP浓度达到1mmol/L时会抑制Taq酶的活性。
其浓度越小,酶的特异性就越高。
3、BSA:
一般用乙酰化的BSA,起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用,对Taq酶有保护作用。
4、底物(dNTPs):
dNTPs具有较强酸性,其储存液用NaOH调pH值至7.0~7.5,一般存储浓度为10mmol/L,各成份以等当量配制,反应终浓度为20~200μmol/L。
高浓度可加速反应,但同时增加错误掺入和实验成本;
低浓度可提高精确性,而反应速度会降低。
5、Taq酶:
能耐95℃高温而不失活,其最适pH值为8.3~8.5,最适温度为75~80℃,一般用72℃。
能催化以DNA单链为模板,以碱基互补原则为基础,按5’→3’方向逐个将dNTP分子连接到引物的3’端,合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。
6、模板:
不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在,如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。
模板DNA的量不能太高,否则扩增可能不会成功,在此情
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- 植物 分子生物学 实验 技术