酵母葡聚糖硫酸酯的制备及抗凝血活性Word文档下载推荐.docx
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胺)法
、浓硫酸法等
[8]
,前者得率高
、硫酸基团取代度大,
但采用氯磺酸等剧毒试剂。
浓硫酸法虽然产物的取代
度稍低,而高取代度并不代表高活性,而且高取代度往
往严重破坏酵母葡聚糖原有的三维结构,对保持免疫
活性是不利的。
本实验采用浓硫酸-正丁醇法,制备酵
母葡聚糖硫酸酯,测定其硫酸基团取代度和分子量,用
红外光谱及
1
HNMR进行结构分析鉴定,并初步分析其
抗凝血活性
材料与方法
1.1
材料与仪器
酵母葡聚糖和羧甲基酵母葡聚糖
[3]
:
广东药学院
生物化学实验室制备;
健康人枸橼酸化血浆:
购自广东
武警医院;
类凝血酶Agacutin:
昆明龙津药业有限公司
提供;
其余试剂均为国产分析纯试剂。
ALPHA1-4
型真空冷冻干燥机:
德国CHRTST公
司;
Nexus670型红外光谱仪:
美国ThermoNicolet公司;
515-410型凝胶渗透仪:
美国Waters公司;
Mercury-Plus
300核磁共振波谱仪:
美国VARIAN公司。
1.2
方法
1.2.1
酵母葡聚糖硫酸酯的制备
参考
[9]
方法,分别量取一定量的浓硫酸、正丁醇,
置于带干燥管和搅拌装置的三颈瓶中,搅拌,冰浴冷却
至-5℃,缓慢加入200目的酵母葡聚糖粉末5g。
反应
温度对于以浓硫酸为酯化剂的酯化反应很重要,超
过
0℃
,则多糖的酸水解作用明显。
试验中保持反应温
度-5℃,反应一定时间后,反应体系用NaOH中和,离
心,蒸馏水透析24h,减压浓缩至20mL左右,加入体积
分数
95%乙醇,静置后离心,收集沉淀物,将沉淀物溶
解于水,再透析24h,透析液经冷冻干燥后得S-glucan。
1.2.2纯度鉴定及相对分子量测定
应用美国Waters515-410凝胶渗透仪测定硫酸酯
化产物的相对分子量。
1.2.3
硫酸基含量测定
[10]
采用
BaCl
2
-明胶浊度法,S-glucan中硫酸基含量用
取代度(degreeofsulfur,DS)来表示。
DS是指S-glucan上
每个葡萄糖残基中含有的硫酸基团的平均个数。
取代
度计算公式:
DS=(1.62×
S%)(/32-1.02×
S%),式
中S%为硫酸基的百分含量。
1.2.4
红外光谱分析
KBr
压片,采用Nicolet670FT-IR(ThermoNicolet,
USA
)红外光谱仪测定,500cm
-1
~4000cm
范围内扫描。
1.2.5
核磁共振
HNMR
分析
以氘代DMSO(DMSO-d6)为溶剂(TMS内标),采用
Mercury-Plus300(Varian,USA)核磁共振。
扫描128次,
选择四甲基硅烷(
TMS)作为内标物。
1.2.6
抗凝血活性的测试
1.2.6.1
体外全血凝血时间测定
[11]
取管径均匀、清洁干燥的小试管若干支,每管加入
供试品溶液
0.1mL。
大鼠麻醉后,断头取血,迅速沿管
壁每管缓慢注入大鼠血0.9mL,立即混匀并将小试管
置于(37±
0.5)℃恒温水浴中。
从血液离体后至完全凝
固所需要的时间即为凝血时间,记录各组的凝血时间。
1.2.6.2改进法测定人血浆凝结时间
取洁净玻璃小试管,每管预先加入生理盐水
20μL
和Agacutin酶液200μL(本测试以类凝血酶替代凝血
ofDS0.418wasselectedforstructuralanalysisandanticoagulationinvestigation.Itsaveragemolecularweightis
1.68×
10
5
IRand
HNMRspectrumsindicatetheintroductionofsulfategroupsbysulfation.Coagulationassays
showthatglucansulfateatacertaindosagecansignificantlyprolonginvitroclottingtimeofratbloodand
coaguationtimeinplasma.
Keywords:
yeastglucan;
sulfation;
preparation;
anticoagulation
基础研究
33n(浓硫酸)∶n(正丁醇)
DS
表1酯化反应中浓硫酸与正丁醇摩尔比对取代度的影响
Table1Therelationshipbetweenthepropotionofsulfuricacid-
butanolandDS
0.8∶1
0.232
1.2∶1
0.256
1∶1
0.239
1.6∶1
0.281
1.4∶1
0.418
反应时间/h
表2酯化反应中反应时间对取代度的影响
Table2TherelationshipbetweenreactiontimeandDS
0.5
0.303
1.5
1.0
0.331
2.5
0.353
2.0
0.345
酶),混匀,
37℃保温5min,然后加入预先37℃保温的
人枸橼酸化血浆200μL,混匀,37℃保温,肉眼观察。
从
加入血浆起到血浆开始出现凝结状为血浆凝结时间
试验中适当调整酶的浓度,以使对照管的凝结时间为
约
60s,测定组均以此酶浓度进行测试。
取不同浓度的
样品液20μL代替生理盐水进行上述实验,记录血浆凝
结时间。
结果与讨论
2.1
硫酸酯化条件的单一因素实验分析
2.1.1
浓硫酸与正丁醇比例对取代度的影响
葡聚糖的磺化反应是一个非均相固液二相反应,
部分硫酸在反应中被消耗,产生一定量的水,同时还存
在其他副反应,如葡聚糖的酸水解、碳化以及脱水,通
过优化反应条件控制副反应的进行尤其重要
虽然与
均相体系反应相比产物的硫酸基取代度较低,但反应
底物酵母葡聚糖和产物葡聚糖硫酸酯均不溶于反应体
系,分离产物较为容易,并且正丙醇硫酸反应液可以重
复使用,较均相反应体系的氯磺酸、甲酰胺等试剂的环
境环境污染小
酯化实验中,浓硫酸和正丁醇的总体积为250mL,
反应时间为1.5h。
调整两者的比例,测定各产物硫酸基
团的取代度
结果如表1所示。
由表1可知,浓硫酸与正丁醇摩尔比为1.4∶1时的
取代度最高。
浓硫酸浓度较高,则酯化反应较易进行,
但过高比例的浓硫酸,副反应也加快,而且酵母葡聚糖
和产物葡聚糖硫酸酯被硫酸水解的程度增加,会使得
率下降。
2.1.2
反应时间对取代度的影响
确定浓硫酸和正丁醇的摩尔比为1.4∶1,考察酯化
反应时间对酵母葡聚糖酯化的影响。
酯化反应不同的
时间,产物分别测定硫酸基团的取代度,结果如表2所示。
反应时间为1.5h的样品取代度最高。
在所考察的
个不同的反应时间中,随着反应时间延长,DS先呈现
上升趋势,在反应时间1.5h时DS最高为0.418,再延长
反应时间,
DS开始下降,但下降幅度不大,并维持相对
稳定。
反应时间过长,相对而言副反应增加,水解也加
强,对制备合适取代度的产物并不利
2.2纯度及相对分子量分析
冷冻干燥后所得样品为灰白色粉末,易溶解于
水。
分子排阻层析色谱测定样品为单一吸收峰,表明样
品纯度较好,相对分子量为1.68×
2.3
酵母葡聚糖硫酸酯的红外光谱分析
选取酵母葡聚糖(
Y-glucan
)和取代度为0.303、
0.418、0.345
的S-glucan共4个样品进行红外光谱测试。
红外光谱见图1。
由图
1可知,在功能区,波数3413、2922、1748cm
处有明显的吸收,分别对应的是多—OH,C—H,CO的
伸缩振动吸收带。
产物在1157、1074、1041、891cm
处
存在显著特征吸收带,连接方式仍然是β-型,说明衍
生化没有破坏多糖主链的结构。
红外谱图揭示,3种取
代度的S-glucan在1240、810cm
有吸收带,它们分别
对应
SO
拉伸和C-O-S振动,为硫酸酯的特征吸收峰,说
明酵母葡聚糖分子中已经成功引入了硫酸基团。
2.4
核磁共振氢谱分析
核磁共振氢谱分析,见图2。
由图2可知,比较酵母葡聚糖(Y-glucan)和
S-glucan(DS0.418样品)的
HNMR谱图,酵母葡聚糖谱
图1酵母葡聚糖及其硫酸酯红外谱图比较
Fig.1Comparisonofyeastglucansinfraredspectrabeforeand
aftersulfation
Y-glucan
注:
谱图从上至下分别为DS0.303、0.418、0.345的S-glucan、Y-glucan。
波数/cm
-1
透
光
率
/
%
王庆华,等:
酵母葡聚糖硫酸酯的制备及抗凝血活性基础研究
ppm(f1)
34图2酵母葡聚糖及其硫酸酯
HNMR
图谱
Fig.2
HNMRspectraofyeastglucansanditssulfatedderivative
S-glucan
组别
生理盐水
C-glucan
表3不同质量浓度样品对大鼠全血凝血时间的影响(n=6)
Table3Effectsofdifferentdosagesofsampleontheclottingtime
ofratbloodinvitro
葡聚糖浓度(/μg/mL)
50
凝结时间/s
62±
4
59±
65±
3
79±
*
注:
*与生理盐水对照组比较P<
0.01。
表4不同质量浓度样品对人血浆凝结时间的影响(n=6)
Table4Effectsofdifferentdosagesofsampleonthecoagulation
timeinplasma
0.1
0.2
257±
15
264±
302±
16
367±
18
261±
12
图于4.4~5.4之间有峰,而S-glucan的谱图没有与之对
应的峰,说明与之对应的H被取代。
酵母葡聚糖硫酸酯的抗凝血活性分析
酵母葡萄糖硫酸酯的抗凝血活性分析,结果见
表
3、
表4。
测试取代度为0.418的S-glucan的抗凝血活性,并
与C-glucan进行比较。
全血凝血时间测定实验中,血液
离体后与异物表面接触,使凝血过程启动,参与凝血的
因子被激活,最后使纤维蛋白原转化为纤维蛋白,血液
凝固,若凝血过程受到抗凝血因子的抑制,使血液凝血
时间延长
表3结果显示,随着S-glucan浓度的增加,凝
血时间延长,50μg/mL浓度的S-glucan具有明显的抗凝
活性,而相同浓度的C-glucan未显示抗凝血活性。
凝血酶在凝血过程中作用于血浆可溶的纤维蛋
白原,将其转变为不可溶解的纤维蛋白。
血浆凝结时间
测定试验中,在血浆中添加类凝血酶使凝血时间加快,
通过抗凝血物质的加入,延长血浆凝结时间反映样品
对凝血过程的作用
表4结果显示,0.2、0.5mg/mL浓度
的
S-glucan抗凝血活性明显,而0.5mg/mL的C-glucan未
显示抗凝血活性
2种抗凝血测试方法的结果说明,本试验所得到
的S-glucan具有抗凝血活性,而羧甲基化修饰的酵母
葡聚糖并未显示此种活性。
结论
本研究表明,浓硫酸-正丁醇法是合成酵母葡聚
糖硫酸酯的有效方法。
在浓硫酸与正丁醇摩尔比为1.4∶1,
反应时间1.5h条件得到的样品硫酸基取代度为0.418,
红外光谱和
图谱显示,产物已形成硫酸酯,分
子量测定为
,水溶性较好。
经凝血活性测试显
示该酵母葡聚糖硫酸酯具有抗凝血活性,结合酵母葡
聚糖原有的免疫活性,有望开发成新一代功能性保健
食品成分。
参考文献:
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徐叔云
卞如濂
陈修
.
药理实验方法学
[M].3
版
北京
:
人民卫生出
版社,2002:
1270-1272
收稿日期:
2010-12-17
基础研究王庆华,等:
ppm
(f1)
35
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- 酵母 聚糖 硫酸 制备 抗凝 活性