HE染色方法与步骤吐血整理文档格式.docx
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染色流程
(1)二甲苯(Ⅰ)15min
(2)二甲苯(Ⅱ)15min
(3)二甲苯:
无水乙醇=1:
12min
(4)100%乙醇(Ⅰ)5min
(5)100%乙醇(Ⅱ)5min
(6)80%乙醇5min
(7)蒸馏水5min
(8)苏木精液染色5min
(9)流水稍洗去苏木精液1-3s
(10)1%盐酸乙醇1-3s
(11)稍水洗10-30s
(12)蒸馏水过洗1-2s
(13)0.5%伊红液染色1-3min
(14)蒸馏水稍洗1-2s
(15)80%乙醇稍洗1-2s
(16)95%乙醇(Ⅰ)2-3s
(17)95%乙醇(Ⅱ)3-5s
(18)无水乙醇5-10min
(19)石炭酸二甲苯5-10min
(20)二甲苯(Ⅰ)2min
(21)二甲苯(Ⅱ)2min
(22)二甲苯(Ⅲ)2min
(23)中性树胶封固
注:
①第(11)、(12)步可省去,(13)步冲水时间需延长至20-30min。
②第(21)步如果不用石炭酸二甲苯,可改用无水乙醇。
*冷冻切片HE染色步骤:
(1)冰冻切片固定10~30s
(2)稍水洗1~2s
(3)苏木精液染色(60℃)30~60s
(4)流水洗去苏木精液5~10s
(5)1%盐酸乙醇1~3s
(6)稍水洗1~2s
(7)促蓝液返蓝5~10s
(8)流水冲洗15~30s
(9)0.5%曙红液染色30~60s
(10)蒸馏水稍洗1~2s
(11)80%乙醇1~2s
(12)95%乙醇1~2s
(13)无水乙醇1~2s
(14)石炭酸二甲苯2~3s
(15)二甲苯(Ⅰ)2~3s
(16)二甲苯(Ⅱ)2~3s
(17)中性树胶封固。
第(14)步如果不用石炭酸二甲苯,可改用无水乙醇。
染色结果:
细胞核蓝色,胞质、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈深浅不一的红色。
4.12切片脱水透明切片经HE染色后,要彻底脱水透明,才能用中性树胶封盖。
如果脱水不彻底,封片后呈白色雾状,镜下观察模糊不清,且容易褪色。
切片1-2级无水乙醇脱水,也可使用石碳酸二甲苯进行脱水。
石碳酸有较强脱水能力,但长时间可使切片脱色,因此要经过多次二甲苯以使石碳酸完全除去。
5.H-E染色评定标准:
(1)切片完整,厚度4-6微米,厚薄均匀,无皱褶无刀痕;
(2)染色核浆分明,红蓝适度,透明洁净,封裱美观。
4染色结果编辑
细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色,软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色,粘液呈灰蓝色。
细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色,胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色。
胶原纤维呈淡粉红色,弹力纤维呈亮粉红色,红血球呈橘红色,蛋白性液体呈粉红色。
着色情况与组织或细胞的种类有关,也随其生活周期及病理变化而改变。
例如,很多细胞在新生时期胞浆对伊红着色较淡或轻度嗜碱,当其衰老时或发生退行性变则呈现嗜伊红浓染。
胶原纤维在老化和出现透明变性时,伊红着色由浅变深。
Masson染色,用于显示组织中纤维的染色方法之一。
试剂:
Regaud氏苏木精:
苏木精1g,95%酒精10ml,甘油10ml,蒸馏水80ml。
将苏木精加入蒸馏水内加温溶解,冷却后加入酒精和甘油,放数日后即可应用。
Masson丽春红酸性复红液:
丽春红0.7g,酸性复红0.3g,蒸馏水99ml,冰醋酸1ml。
0.2%冰醋酸水溶液:
冰醋酸0.2ml,蒸馏水100ml。
1%磷钼酸水溶液:
磷钼酸1g,蒸馏水100ml。
苯胺蓝水溶液:
苯胺蓝2g,蒸馏水98ml,冰醋酸2ml。
1%光绿水溶液:
光绿1g,蒸馏水100ml。
Masson三色法步骤
1.石蜡切片脱蜡至水。
2.铬化处理或去汞盐沉淀(甲醛固定的组织此步可略)。
3.依次自来水和蒸馏水洗。
4.用Regaud苏木精染液或Weigert苏木精液染核5-10min。
5.充分水洗,如过染可盐酸酒精分化。
6.蒸馏水洗。
7.用Masson丽春红酸性复红液5-10min。
8.以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻。
9.1%磷钼酸水溶液分化3-5min。
10.不经水洗,直接用苯胺蓝或光绿液染5min。
11.以0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻。
12.95%酒精、无水酒精、二甲苯透明、中性树胶封固。
结果:
胶原纤维、粘液、软骨呈蓝色(如光绿液染色为绿色),胞浆、肌肉、纤维素、神经胶质呈红色,胞核黑蓝色。
体会与说明:
1.控制好染色步骤。
2.组织固定起着很重要的作用,根据不同的固定液可延长或缩短染色时间。
3.0.2%冰醋酸水溶液洗,可使色调清晰鲜艳。
4.磷钼酸水溶液对丽春红、酸性复红有分化作用,分化时镜下控制,肌纤维和纤维素呈红色,胶原纤维呈淡粉红色即可。
天狼猩红染色
[试剂配制]
(1)天狼星红饱和苦昧酸液O.5%天狼星红10ml,苦味酸饱和液90ml。
(2)天青石蓝液天青石蓝B1.25g.铁明矾1.25g,蒸馏水250ml。
溶解煮沸、待冷却过滤
加入甘油30ml,然后再加入浓盐酸0.5ml。
[染色步骤]
(1)中性甲醛液固定组织,石蜡切片,常规脱蜡至水。
(2)人大青石蓝液染5一lOmin。
(3)蒸馏水洗3次。
(4)天狼星红饱和苦昧酸浓染15-30min
(5)无水乙醇直接分化与脱水。
Devil二甲苯透明,中性树胶封固。
[注意事项]
(1)细胞核里染色可以用Harris苏木素染色液谈染。
(2)染色封固后的切片,须及时用偏光显微镜进行观察和照相已保持鲜艳的色彩
在偏光显微镜下可以观察到四种类型的胶原纤维。
l型胶原纤维:
紧密排列,显示很强的双折光性,呈黄色或红色的纤维o
ll型胶原纤维:
显示弱的双折光,呈多种色彩的疏松网状分布。
皿型胶原纤维:
显示弱的双折光,呈绿色的细纤维。
lv型胶原纤维:
显示弱的双折光的基膜,呈淡黄色。
免疫组化步骤(ABC法)
1。
4%多聚甲醛常规灌注固定,取材并置20%蔗糖溶液(4℃)中过夜。
蜡块制作。
切片,贴片。
0.01MKPBS清洗5min×
3后;
2。
加入配好的0.3%的过氧化氢甲醇溶液(甲醇80ml+0.01MKPBS100ml+30%过氧化氢)30min,以消除内源性过氧化物酶的影响,0.01MPBS清洗5min×
3;
3。
加入配好的0.3%TritonX100(30%TritonX100+0.01MKPBS100ml)30min,以增加细胞的通透性,0.01MKPBS清洗5min×
4。
加入用血清稀释液(牛血清白蛋白1.00g+0.01MPBS100ml+叠氮纳0.08g)稀释的一抗,4℃存放24-48h;
吸去抗体,0.01MKPBS洗5min×
5。
加入0.01MKPBS稀释的的二抗,室温孵育2h。
0.01MKPBS洗5min×
6。
加入ABC复合物之类的抗体,室温孵育2h,0.01MKPBS洗5min×
蒸馏水迅速冲三次;
7。
加入显色液,进行免疫组织化学显色,时间一般不超过30min,可不时在显微镜下进行观察,待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液,用蒸馏水迅速冲三次后加入0.01MKPBS终止反应;
8。
梯度酒精脱水之后,封片,拍照。
免疫组化SP法步骤:
SP(streptavidin-perosidase)法,即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法.
按标记物质的种类,如荧光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)、铁蛋白、胶体金等,可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。
按染色步骤可分为直接法(又称一步法)和间接法(二步、三步或多步法);
按结合方式可分为抗原—抗体结合,如过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)法和亲和连接,如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(SP)法等,其中SP法是最常使用的方法。
一般的sp法步骤啊,具体如下:
1.烤片,68℃,20分钟,
2.常规二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水;
二甲苯I20min--二甲苯II20min--100%酒精I10min--100%II10min--95%5min--80%5min--70%5min
3.阻断灭活内源性过氧化物酶:
3%H2O237℃孵育10min,PBS冲洗3X5min;
4.抗原修复:
置0.01M枸橼酸缓冲液(PH6.0)中用煮沸(95℃,15-20min),自然冷却20min以上,再用冷水冲洗缸子,加快冷却至室温,PBS冲洗3X5min。
5.正常羊血清工作液封闭,37℃10min,倾去勿洗.
6.滴加一抗4℃冰箱孵育过夜,PBS冲洗3X5min(用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照);
滴加生物素标记二抗,37℃孵育30min,PBS冲洗3X5min;
7.滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液,37℃孵育30min,PBS冲洗3X5min;
8.DAB/H2O2反应染色,自来水充分冲洗后,
苏木素复染,常规脱水,透明,干燥,封片。
免疫组化(Elivision二步法):
(1)石蜡切片置于67℃烘箱中,烘片2小时,脱蜡至水,用pH7.4的PBS冲洗三次,每次3分钟(3×
3’)。
(2)取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液,加入微波盒中,微波加热至沸腾,将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上,放入已沸腾的缓
DAB液,显微镜下观察5分钟。
(8)苏木素复染,0.1%HCl分化,自来水冲洗,蓝化,切片经梯度酒精脱水干燥,二甲苯透明,中性树胶封固,晾干后观察。
即用型第二代免疫组化Elivisionplus广谱试剂盒,购自福州脉新生物技术开发有限公司。
包括:
生物素化抗兔二抗、亲和素(ReagentA)、生物素-辣根过氧化物酶(ReagentB)、二氨基联苯胺(DAB)
脱钙剂的配置
10%EDTA的配置:
1)
加热水浴锅到65℃
2)
称取NaOH11g加到900ml
dd
H2O中
3)
再加入EDT
A-Na2
100g至水中;
4)
水浴加热,搅拌至透明溶解
5)
加入Na2HPO4
6g,
NaH2PO4
0.4g,
NaCl
9g
;
蒸馏水定容至1000ml
6)
调节pH值至7.2~7.3,室温或4度保存
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