分子生物学思考题剖析.docx
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分子生物学思考题剖析
分子生物学考试重点(前四章+第七、八章)
第一章
一、DNA重组技术和基因工程技术(p12)
答:
DNA重组技术:
将不同的DNA片段,按照人们的设计定向连接起来,于特定的受体细胞中和载体一起复制并得到表达,产生影响受体的新的遗传性状的技术。
基因工程技术:
除DNA重组技术外还包括其他对生物细胞基因组结构进行改造的体系。
关键:
工具酶的发现和应用
前景:
1、合成正常细胞中含量很低的多肽
2、定向改造基因组结构
3、进行基础研究
二、请简述现代分子生物学的研究内容。
(第二版前言、p12标题)
答:
分子生物学:
研究核酸等生物大分子的功能、形态、结构特征的重要性和规律性的科学,主要关心的是核酸在细胞生命过程中的作用,包括核酸的复制和保存、基因的表达和调控。
研究内容:
DNA重组技术,基因的调控和表达,生物大分子的功能结构——结构分子生物学,基因组、功能基因组和生物信息学。
第二章
一、核小体(P27)
答:
核小体:
由H2A、H2B、H3、H4各两分子组成的八聚体和约200bp的DNA组成。
八聚体在内,DNA盘绕在外。
其是DNA压缩的第一步。
若用核酸酶降解核小体,只能得到约146bp的核心颗粒。
(另:
H1在核小体的外面)
核心颗粒:
除去接头DNA的核小体单体,长度约146bp
核小体单体:
八聚体+200bpDNA组成,包括接头DNA
二、DNA的半保留复制(p38)
答:
DNA在复制过程中,碱基间的氢键首先断裂,双螺旋解旋解链,每条单链分别作为模板合成新链。
新生成的DNA分子与原DNA分子的碱基顺序完全一样,这样每个子代分子的DNA一条单链来自模板链,另一条单链来自新合成的链,这种复制方式成为DNA的半保留复制。
三、转座子(p57)
答:
转座子是存在于DNA上的可以自主复制和移动的基本单位,其可以分为两大类:
插入序列和复合型转座子,另外还有TnA家族。
四、DNA的一、二、三级结构特征。
(P32~p37)
答:
1、各级结构的定义:
DNA的一级结构:
指四种核苷酸的连接和排列顺序
DNA的二级结构:
指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构
DNA的三级结构:
在DNA双螺旋基础上进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。
2、各级结构的特点:
DNA一级结构:
(1)、DNA分子是由两条脱氧核苷酸长链盘绕而形成的。
(2)、脱氧核糖和磷酸交替连接,在外侧形成骨架;碱基排列在内侧。
(3)、碱基之间按照互补配对的原则以氢键连接(A=T、C≡G)。
DNA二级结构:
(1)、右手螺旋(A-DNA、B-DNA)
、双螺旋之间有凹槽,小沟1.2(nm)大沟2.2(nm)
、碱基之间以氢键连接,碱基平面与纵轴垂直,螺旋的轴心穿过氢键的中点
、碱基平面距离0.34nm,双螺旋直径2.0nm,每十个核苷酸为一个结构重复周期。
(2)、左手螺旋(Z-DNA)是右手螺旋结构模型的一个补充和发展
DNA三级结构:
(1)、超螺旋是其三级结构的主要形式,分为正超螺旋与负超螺旋。
在不同的拓扑异构酶的作用下可以相互转变。
(2)、DNA分子的变化满足公式:
L=T+W(连接数=旋转数+超螺旋数)
(3)、双螺旋DNA的松开导致负超螺旋、拧紧导致正超螺旋。
五、DNA复制通常采取哪些方式?
(p40)
答:
(1)线性DNA双链复制:
,复制叉方向:
单一起点单向、双向,或多起点双向
,特殊机制:
,线性的复制子形成环状或多聚分子
,末端形成发卡结构
,特殊蛋白介入,在真正末端启动复制
(2)环状DNA双链复制:
θ型、滚环型、D-环型
六、真核生物DNA的复制在哪些水平上受到调控?
(p51)
答:
真核细胞生活周期:
G1期:
复制预备期、S期:
复制期、G2期:
有丝分裂预备期、M期:
有丝分裂期。
调控方式:
(1)、细胞生活周期水平调控:
决定是否从G1期进入S期
(2)、染色体水平调控:
决定不同染色体或者同一染色体的不同部位的复制子按一定顺序在S周期进行复制
(3)、复制子水平调控:
决定复制子是否进行复制
七、DNA修复包括哪几种?
p51~p55
答:
1、错配修复:
通过复制前母链甲基化来识别错配的子链,根据“保留母链,修复子链”的原则,通过两种方式(3′端、5′端)剪切和合成新链修复。
2、切除修复:
(1)、碱基切除修:
<1>、糖苷水解酶:
水解受损核苷酸上的N―β―糖苷键,形成去碱基位点(即AP位点)
<2>、AP核酸内切酶:
将受损核酸的糖苷-磷酸键切开
<3>、DNA聚合酶Ⅰ:
合成新的片段
<4>、DNA连接酶:
连接,完成修复
(2)、核苷酸切除修复:
通过DNA切割酶和DNA聚合酶实现修复
<1>、DNA切割酶:
切割损伤部位的磷酸糖苷键
<2>、DNA聚合酶Ⅰ(原核)或δ(真核):
合成新片段
<3>、DNA连接酶:
连接,完成修复
3、重组修复:
又称复制后修复,复制时跳过损伤部位,之后通过DNA重组修复
4、直接修复:
不通过切除来修复,如DNA光解酶使环丁烷胸腺嘧啶二聚体或6-4光化物还原成单体。
5、SOS修复:
诱导DNA修复,诱变反应,细胞分裂的抑制,溶原性细菌释放噬菌体等。
细胞癌变也与SOS修复有关
第三章
一、Pribnowbox(P76)
答:
为原核生物指导转录的DNA模板链上一段由5个核苷酸(TATAA)组成的共同序列,其为RNA聚合酶紧密结合点,其又位于起始位点上游10bp处,故又称-10区。
二、编码链(p66)
答:
将与mRNA序列碱基顺序相同的那条DNA单链称编码链,又称有义链;另一条根据碱基互补配对原则指导mRNA合成的DNA单链称为模板链,又称反义链。
三、上升突变(p78)
答:
细菌中常见两种突变:
上升突变、下降突变,上升突变指:
增加pribnowbox的共同序列的同一性能够提高启动子的效率,从而提高基因的转录水平的一种突变。
例如乳糖操纵子中的pribnow区的TATGTT变为TATATT能够提高操纵子的基因转录水平。
四、增强子(p78)
答:
是除启动子以外与转录起始有关的序列,一般位于-200bp处,能够增强转录起始。
特点:
远距离效应、顺式调节、可对外部信号有反应;无方向、有相位;无物种基因特异性、有组织特异性。
五、简述生物体内RNA的种类和功能(P67)
答:
(1)mRNA:
编码特定蛋白质序列
(2)tRNA:
识别mRNA中的遗传信息,将其转化为相应的氨基酸后加入到多肽链中
(3)rRNA:
直接参与核糖体内的蛋白质合成(为最多的RNA)
六、什么是DNA模板与mRNA及蛋白质产物之间的共线性关系?
(p67)
答:
书上67页图3-1
七、转录一般被分为哪几个步骤?
(p67~p69)
答:
模板识别:
RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并结合的过程
转录起始:
RNA聚合酶与启动子DNA双链结合后,形成转录泡,RNA链上第一个核苷酸键的产生。
通过启动子:
第一个核苷酸键产生到形成九个核苷酸短链的过程。
转录延伸:
RNA聚合酶释放σ因子后,核心酶沿DNA模板链移动并使新生RNA不断延伸的过程
转录终止:
RNA延伸到终止位点时,RNA聚合酶不再形成新的磷酸二脂键,转录泡瓦解,RNA-DNA杂化双链分离,DNA恢复双链,RNA和RNA聚合酶从模板释放。
八、转录终止子与翻译终止密码的结构特点?
(转录终止子结构p90)
答:
转录终止子结构:
(1)不依赖ρ因子的终止:
在终止位点上游一段富含GC二重对称区,通过转录形成RNA容易出现发卡结构,该结构阻止RNA聚合酶的前进,破坏RNA-DNA杂化双链的结构
在终止位点上游存在4~8个A组成的序列,转录产物形成不稳定的rU•dA区域,上述两者共同作用,使RNA聚合酶从三元复合物中脱离出来
(2)依赖ρ因子的终止:
ρ因子为六个相同亚基的聚合物,其能够催化NTP的水解促使新生成的RNA从三元复合物中脱离出来,从而终止转录
翻译终止密码结构:
待定
九、什么是RNA编辑?
其生物学意义?
(p99、p101)
答:
定义:
RNA编辑是某些RNA,特别是mRNA前体的一种加工方式,通过插入删除或取代一些核苷酸残基,导致mRNA编码的遗传信息发生改变,通过编辑的mRNA序列发生了不同于模板DNA的变化。
RNA编辑的机制有两种:
位点特异性脱氨基作用和RNA指导的尿嘧啶插入或删除。
生物学意义:
(1)、校正作用:
弥补因突变而缺失的遗传信息。
(2)、调控翻译:
通过构建或除去起始密码子和终止密码子来调控翻译。
(3)、扩充遗传信息:
能使基因产物获得新的结构功能。
第四章
一、SD序列(P130)
答:
原核生物的mRNA上,于翻译起始密码AUG上游约10bp处,有一段5′-AGGAGGU-3′的富嘌呤区,称为SD序列。
该序列与核糖体30s亚基的16srRNA中的3′端一段富嘧啶区互补;通过SD序列,核糖体与mRNA相互作用并结合。
二、信号肽(p145)
答:
定义:
在编码分泌蛋白的基因中,大多5'端有一段基因用于编码疏水性肽段,这一肽段在成熟的分泌蛋白中并不存在,其功能在于引导随后产生的蛋白质多肽链穿过内质网膜进入腔内。
其在蛋白质的内质网-高尔基体-质膜分泌途径中具有重要作用,并被称之为信号肽。
(来源XX)
特征:
(1)带有10~15个疏水性氨基酸
(2)靠近N端常有一个或数个带正电的氨基酸
(3)C端于蛋白酶切割位点附近常有数个极性氨基酸,且离切割位点最近的极性氨基酸常有很短的侧链
三、简述tRNA的结构。
(P116~p117)
答:
二级结构:
“三叶草”结构,含76个碱基,相对分子量为2.5×104
(1)共同点:
①、含稀有碱基
②、3′末端均为CCA-OH
(2)五个臂:
①、受体臂:
含CCA-OH
②、D臂:
因含二氢尿嘧啶得名,并含三个可变核苷酸位点
③、反密码子臂:
其套索结构中含有三个反密码子
④、TψC臂:
根据三个核苷酸命名,其中ψ为拟尿嘧啶
⑤、多余臂:
为tRNA变化最大的部位。
三级结构:
L形折叠。
特点:
①、氢键维系
②、两个新增双螺旋结构:
TψC臂、受体臂和D臂
③、L的两头:
分别为受体臂和反密码子臂
④、L的转角处:
TψC臂和D臂的套索结构
⑤、结构意义:
满足翻译时核糖体与mRNA的结构相适应。
四、简述核糖体的组成及其功能。
(P123~p126)
答:
结构:
(1)、由大亚基和小亚基组成,每个亚基都由核糖体蛋白以及rRNA组成
(2)、根据沉降系数不同70S型(原核生物,由50S+30S组成)
80S型(真核生物,由60S+40S组成)
(3)、核糖体蛋白:
组成活性中心,去除任一蛋白,总体也会失去功能
(4)、rRNA:
5SrRNA:
结合50S大亚基、TψC臂。
16SrRNA:
结合mRNA、50S大亚基、A(P)位置的tRNA
23SrRNA:
结合tRNAMET
5.8SrRNA:
存在于真核生物中,相当于5SrRNA
18SrRNA:
存在于酵母中,相当于大肠杆菌16SrRNA
28SrRNA:
功能未知
(5)、三个tRNA结合位点:
A:
结合氨酰-tRNA
P:
结合肽酰-tRNA
E:
移出tRNA
tRNA的移动顺序:
A-P-E
功能:
(1)、所有生物体的核糖体结构相近、功能相同——参与蛋白质多肽的合成
(2)、大亚基的功能:
肽键的形成、结合氨酰-tRNA、结合肽酰-tRNA
(3)、小亚基的功能:
识别mRNA,识别起始部位、识别密码子与反密码子
(4)、核糖体可以根据需要解离为亚基或者合成为颗粒。
五、简述肽链合成过程的生物学机制。
(P132~p136)
答:
(1)、后续AA-tRNA与核糖体结合
①、起始复合物生成后,AA-tRNA与延伸因子EF-Tu和GTP形成复合物
②、AA-tRNA•EF-Tu•GTP复合物进入核糖体A位。
同时,GTP水解
③、通过另一延伸因子EF-Ts产生GTP,形成EF-Tu•GTP复合物循坏再利用
(2)、肽链合成
①、AA-tRNA的AA从A位进入P位,与fMET-tRNAMET上的AA形成肽键
②、形成肽键后的起始tRNA离开P位
③、A点准备接受新的tRNA
(3)、移位:
即核糖体沿mRNA的3′端方向移动一个密码子
①、位于A位的二肽酰-tRNA2从A位移动到P位
②、去氨基-tRNA进入E位
③、mRNA上第三位密码子对应A位
另:
1、氨基酸活化
2、肽链合成的起始指核糖体与mRNA及起始氨酰-tRNA结合成起始复合物。
分为三步:
(1)核糖体的小亚基与mRNA结合
小亚基能识别mRNA上的起始密码子AUG,并附着在这个部位,形成“小亚基-mRNA”复合物。
(2)起始氨酰-tRNA结合上去
起始氨酰-tRNA与mRNA上的起始密码子结合,形成了“小亚基-mRNA-fMet-tRNA”复合物。
(3)大亚基结合上去
大亚基与上述复合物结合,形成了起始复合物,即“核糖体-mRNA-(f)Met-tRNA”复合物。
在整个起始过程中,还需有3种蛋白质因子参与,称起始因子(IF),即IF1、IF2、IF3。
另外,起始过程还消耗高能化合物,即1分子GTP。
3、肽链的延伸
(1)进位
与起始复合物中A位处的密码子相对应的aa-tRNA进入。
此时需消耗1分子GTP→GDP。
(2)转肽
P位的fMet-tRNA上的甲酰甲硫氨酰基转移至A位的aa-tRNA的aa的氨基上,形成肽键。
催化此反应的酶叫肽基转移酶,它是核糖体大亚基中的一种酶。
此转肽反应不另外消耗高能化合物,因为活化的氨基酸已具有潜在的能量。
(3)移位
核糖体沿着mRNA3′端方向移动一个密码子的距离,这样,原来P位空载的tRNA离开了核糖体,原来A位的肽酰-tRNA位于了P位,而A位空了出来。
这一步需消耗1分子GTP→GDP。
通过以上三步,延长了一个氨基酸。
在此过程中,还需要一些蛋白质因子的参与,称为延长因子(EF)。
每延伸一个氨基酸,需要消耗2分子GTP→GDP。
(进位和移位)
接下来,空着的A位又有新的aa-tRNA进入,通过转肽→移位,又可延长一个aa。
重复上述步骤,随着核糖体从5′→3′移动,可使aa按照mRNA上密码子的要求一个个地对号加入,肽链从N端向C端延伸。
4、肽链合成的终止与释放
当核糖体由5′→3′移动至终止密码子(UAA、UAG、UGA)时,由于没有与之相应的tRNA,终止因子RF进入A位。
终止因子使肽基转移酶的活性转变为水解酶活性(使肽基不再转移到氨酰tRNA上,而是转移给水分子),从而将肽酰tRNA水解。
这样肽链被释放。
空载的tRNA也离开核糖体。
核糖体的大小亚基解离并离开mRNA。
5、新合成多肽链的折叠和加工
六、蛋白质加工的种类和意义。
(P136~p140)
答:
(1)、N端fMET和MET的切除:
无论真核、原核细胞,蛋白翻译之后均要切除N端的甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸
(2)、二硫键形成:
二硫键的正确形成对于形成蛋白质天然空间构象具有重要意义
(3)、特殊AA的修饰:
①、磷酸化:
苏氨酸、丝氨酸、酪氨酸(苏西洛)
②、糖基化:
Ⅰ、真核细胞蛋白的特征
Ⅱ、于内质网内受糖基化酶的作用
Ⅲ、所有分泌蛋白和膜蛋白均为糖基化蛋白
③、甲基化、乙基化、羟基化、羧基化
(4)、切除新生肽链中的非功能片段:
肽类激素或酶的前体大多都要经过此类加工才能成为活性分子
七、简述蛋白质转运的种类和机制。
P142~p153
答:
1、蛋白质转运分为:
翻译转运同步机制,翻译后转运机制
2、几种主要蛋白质的转运机制:
(1)、分泌蛋白:
翻译转运同步机制
(2)、细胞器蛋白:
翻译后转运机制
(3)、膜蛋白:
两者都有
3、翻译转运同步机制:
(1)、核糖体组装、翻译开始
(2)、位于N端的信号肽首先被翻译出来
(3)、SRP与含有信号肽的新生肽链以及核糖体及GTP结合,翻译被中止
(4)、膜上受体DP与SRP结合,形成孔道
(5)、GTP水解,SRP释放、翻译继续进行,边翻译边跨膜
(6)、翻译结束,信号肽被切除、核糖体解离并恢复到翻译前起始状态
4、翻译后转运:
(1)、线粒体转运:
①、待转运多肽由成熟蛋白质和前导肽组成
②、转运需要能量
③、先有线粒体外膜上的Tom受体识别Hsp70或MSF等分子伴侣结合的待转运多肽,再通过Tom和Tim组成的通道进入线粒体腔
④、前导肽特点:
Ⅰ、碱性氨基酸和羟基氨基酸含量多
Ⅱ、有形成两条α螺旋的能力
(2)、叶绿体转运:
①叶绿体定位信号肽为两部分:
Ⅰ、决定该蛋白能否进入叶绿体基质
Ⅱ、决定该蛋白能否进入叶绿体类囊体
②特征:
Ⅰ、活性蛋白水解酶位于叶绿体基质中
Ⅱ、叶绿体膜与叶绿体蛋白前体特异性结合
Ⅲ、叶绿体蛋白前体内可降解序列因植物和蛋白种类不同而不同
(3)、核定位蛋白转运:
①真核生物:
Ⅰ、NLS(核定位序列)与核转运因子αβ结合,停留于核孔
Ⅱ、依靠GTP水解能量(Ran酶),进入细胞核
Ⅲ、αβ亚基解离
②原核生物:
Ⅰ、新生成蛋白质与分子伴侣SecB结合,形成结合物
Ⅱ、结合物与膜上的SecA-SecYEG复合物结合
Ⅲ、通过SecA水解ATP将蛋白质分段送出胞外
第七、八章
一、定义:
基因家族。
(P282)
答:
真核细胞中相关基因按功能成套组合,称为基因家族,同一家族的成员有时紧密排列,组成一个基因簇,但大多分布在同一染色体的不同部位,甚至不同的染色体,有各自不同的表达调控模式。
二、简述操纵子学说。
(P237)
答:
(1)、1961年,由法国科学提出,最初发现的是大肠杆菌的乳糖操纵子。
其由三个结构基因Z、Y、A,以及启动子、控制子和阻遏子等组成,负责调控大肠杆菌的乳糖代谢。
(2)、乳糖操纵子结构基因的表达受阻遏蛋白和诱导物的调控,当阻遏蛋白结合到操纵基因之上时,结构基因不产表达,而乳糖(充当诱导物)会与阻遏蛋白结合,使之从操纵基因上脱落下来。
这时,操纵基因开启,结构基因表达,细菌就能分解并利用乳糖了。
三、简述乳糖操纵子的调控模型。
(P240)
答:
(1)、Z、Y、A的基因产物由同一条多顺反子mRNA编码;Z编码β-半乳糖苷酶、Y编码β-半乳糖苷透过酶、A编码β-半乳糖苷乙酰基转移酶
(2)、启动区(P)位于阻遏基因(I基因)和操纵区(O区)之间,不能主动进行糖苷酶和糖苷透过酶基因的高效表达
(3)、操纵区为一段短DNA链(长约26bp),是阻遏物的结合位点
(4)、阻遏物与操纵区结合后,阻遏lacmRNA的转录
(5)、诱导物与阻遏物结合后,改变阻遏物的空间构象,使其不能结合到操纵区,从而激活lacmRNA的表达
四、简述顺式作用元件与反式作用因子。
(P299)
答:
(1)、顺式作用原件:
影响自身基因表达活性的非编码DNA,如启动子、增强子、沉默子
(2)、反式作用因子:
①、定义:
能够直接或间接识别或结合在顺式作用原件的核心序列,调控靶基因转录效率的蛋白质
②、常见的反式作用因子:
Ⅰ、HTH结构(螺旋-转折-螺旋结构)
Ⅱ、锌指结构
Ⅲ、bZIP结构(碱性-亮氨酸拉件)
Ⅳ、bHLH结构(碱性-螺旋-环-螺旋结构)
Ⅴ、同源域蛋白
③、反式作用因子的唯一结构基础:
转录活化域
④、转录活化域主要结构:
Ⅰ、带负电的螺旋结构
Ⅱ、富含谷氨酰胺的结构
Ⅲ、富含脯氨酸的结构
五、DNA甲基化的方式及其作用。
(P292)
答:
1、方式:
通过两种甲基化酶
(1)日常型甲基化酶:
通过甲基化的母链,将DNA分子中处于半甲基化状态的甲基胞嘧啶相对应的胞嘧啶甲基化
(2)、从头合成甲基化酶:
无需母链,将未甲基化的CpG进行甲基化。
2、常见的DNA甲基化:
5-mC(5-甲基胞嘧啶),N6-mA(N6-甲基腺嘌呤),7-mG(7-甲基鸟嘌呤)。
3、作用:
通过甲基化关闭某些基因的活性、改变染色体结构、DNA构象、DNA稳定性,以及和蛋白相互作用来达到调控基因表达。
六、简述真核基因转录的过程和调控方式。
(P296起)
答:
1、转录过程:
一般转录过程:
模板识别、转录起始、转录延伸、转录终止(参见第三章第七问)
真核生物参转录机器的组成:
(1)、启动子
①、核心启动子
Ⅰ、结构:
包括转录起始位点以及其上游-35~-25bp处的TATA盒
Ⅱ、作用:
确定转录起始位点,产生基础水平转录
②、上游启动原件Ⅰ、结构:
包括位于-70bp的CAAT盒以及GC盒等
Ⅱ、作用:
提高转录效率
(2)、转录模板:
从转录起始点到RNA聚合酶Ⅱ转录终止处的全部DNA序列。
(3)、RNA聚合酶Ⅱ
(4)、RNA聚合酶Ⅱ基础转录所需的蛋白质因子(TFⅡ):
①、TFⅡD、B、F形成初级复合物
②、TFⅡH、E加入后形成完整转录复合物
③、加入TFⅡA可提高转录效率
④、转录时TFⅡD、A滞留在转录起始位点上。
2、调控方式:
大多数通过顺式作用原件和反式作用因子相互作用调控
(1)、顺式作用原件:
启动子:
(见上)
增强子:
(定义、功能特点见第三章)
沉默子:
为参与基因表达负调控的一种元件,其DNA序列被调控蛋白结合后阻断了转录起始复合物的形成或活化,使基因表达活性关闭。
(2)、反式作用因子:
(见上)
分子生物学考试重点后半部分
一、基因工程
答:
在体外将核酸分子插入载体分子中,使之进入原先不含此类分子的寄主细胞中,并使之进行持续稳定的繁殖和表达的技术。
其与其他技术最显著的区别是,基因工程技术跨越了天然生物屏障,能将来自任何生物的基因置于与之毫无亲缘关系的寄主细胞中。
二、限制性核酸内切酶
答:
1、定义:
能识别DNA中特定的碱基序列,并从该位点切开DNA分子的酶称~。
其能够识别并切断外来DNA分子的某些部位,使外来DNA分子失去活性,并限制外来噬菌体的繁殖。
2、分类:
(1)限制性核酸内切酶Ⅰ:
能识别专一的核苷酸顺序,并在识别位点附近的核苷酸切割DNA分子,但切割的核苷酸顺序没有专一性,是随机的。
代表酶:
EcoKEcoB。
(2)、限制性核酸内切酶Ⅱ:
能够识别专一的核苷酸顺序,并且在该顺序内固定位置切割DNA分子,识别的专一顺序是:
回文对称顺序。
代表酶:
EcoR。
(3)、限制性核酸内切酶Ⅲ:
能够识别专一的核苷酸顺序,但所识别的顺序并非回文对称顺序,能够在所识别的核苷酸顺序外专一切割DNA分子。
3、反应过程:
(1)、加DNA
(2)、加Buffer
(3)、加酶
(4)、37℃一小时或过夜
(5)、停止反应,65℃加热,加EDTA或苯酚
4、注意事项:
(1)、使用浓缩限制性核酸内切酶时以1×限制酶缓冲液稀释
(2)、每次取酶均应更换无菌吸头,操作要快,操作完立刻放回-20℃冰箱内
(3)、尽量减小反应体积,但酶的体积最多不超过总体积的10%
(4)、切割大量DNA时,延长作用时间可以减少所需的酶,反应时可取少量酶,行微量凝胶电泳来检测反应
(5)、注意星号酶切活力:
核酸内切酶在一些特殊情况下,对底物DNA特异性降低,将与特定DNA序列不同的碱基切断
三、基因组DNA文库和cDNA文库
答:
1、基因组DNA文库
(1)、概念:
将某种生物细胞的基因组DNA切成适当大小,分别与载体分子组合,并导入微生物细胞,形成克隆。
汇集包含基因组中所有DNA序列的克隆(理论上每个序列至少有一份代表),这样的克隆片段的汇总称为基因组的DNA
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- 分子生物学 思考题 剖析