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当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时,蛋白质与DNA发生变性,当加入中和液后,质粒DNA分子能够迅速复性,呈溶解状态,离心时留在上清中;
蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状,离心时可沉淀下来。
提取的质粒DNA通过对核酸特异性吸附的树脂进行离心过滤纯化。
2、质粒酶切:
限制性内切酶能够识别短的DNA序列并在识别序列内或旁侧特异性切割双链DNA。
对环状DNA有多少切口,就能产生多少个酶解片段,因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶中的区带数,就可以推断酶切口的数目,从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。
如本次试验使用的限制性内切酶为BamHI酶,识别的序列分别为G↓GATCC(↓表示切割部位)。
3、DNA琼脂糖凝胶电泳:
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。
DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。
由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速度向正极方向移动。
在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即DNA分子本身的大小和构型。
具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,可进行分离。
DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。
4.重叠PCR合成基因:
本次实验设计了首尾相连长链DNA片段,通过多轮PCR人工合成了转录因子SalL4及其DNA结合域基因。
5、表达载体与基因克隆及其表达:
本实验采用了pET-DsbA融合表达载体,可在大肠杆菌BL21(DE3)中融合表达外源基因。
文献报道DsbA融合有利于实现可溶性表达。
该载体表达产物N端带6个His便于采用Ni2+chelatingsepharose亲和层析纯化目标蛋白。
6、6His-tag融合蛋白的纯化:
在外源基因表达载体相对应表达蛋白的N端或者C端添加6个组氨酸(即6His-tag)实现融合表达。
。
金属鏊合层析,又称固定化金属离子亲和层析(Immobilizedmetalionaffinitychromatography,IMAC)。
该法将通过亚氨基二乙酸(IDA)等将金属离子Ni2+鏊合在琼脂糖凝胶上形成的一种亲和层析介质,利用6His-tag与金属离子Ni2+能够发生特殊的相互作用而较特异地吸附带有6His-tag,吸附的6His-tag融合蛋白可以用高浓度的咪唑竞争性洗脱下来,从而实现目标蛋白即带6His-tag的融合蛋白与杂蛋白的分离。
其它实验步骤:
DNA切胶回收通过对核酸特异性吸附的树脂进行离心过滤纯化;
DNA连接在15°
含ATP溶液里面,DNA连接酶将两个酶切的DNA片段进行连接;
质粒转化采用CaCl2方法进行。
【实验方法与步骤】:
2.1.1菌株和质粒
大肠杆菌JM109,BL21(DE3)为本实验室构建保存;
pMD18-T、pMD19-T载体购于TaKaRa公司,表达载体pET-DsbA为本实验室构建保存。
2.1.2主要仪器设备
PCR仪为德国Biometra公司产品
移液枪为德国Eppendorf公司产品
恒温培养箱为上海一恒公司产品
恒温水浴锅为英国Grant公司产品
水平电泳槽,垂直电泳槽为美国Bio-Rad公司产品
凝胶成像系统为美国Carestream公司产品
微型离心机,台式高速离心机为德国Eppendorf公司产品
恒温摇床为美国NewBrunswickScience公司产品
2.1.3主要试剂
DNA胶回收试剂盒,质粒小提试剂盒为美国Omega公司产品
LATaqDNA聚合酶、PrimeStarHSDNA聚合酶、PCR专用GCBuffer、dNTP、限制性内切酶(BamHⅠ,HindⅢ)、T4DNA连接酶、DL2000DNAMarker、10×
loadingbuffer均为大连宝生物工程有限公司(Takara)产品
标准蛋白ladder,蛋白loadingBuffer、DTT为加拿大Fermentas公司产品
蛋白胨,酵母粉,琼脂,琼脂糖均为英国Oxiod公司产品
NaCl,NaOH,CaCl2,MgCl2均为西陇化工公司产品
氨苄青霉素为石家庄制药公司产品
核酸染色剂GelView为北京百泰克公司产品
50×
TAE为上海生工公司产品
IPTG、lysozyme为加拿大BioBasic公司产品
30%丙烯酰胺、1.5molTris-HCl(pH8.8)、0.5molTris-HCl(pH6.8)、SDS、过硫酸铵、TEMED、Tris、甘氨酸、考马斯亮蓝染色液均为美国Bio-Rad公司产品
2.2方法
2.2.1引物的设计与合成
根据小鼠的SalL4基因序列(GenBank序列号为CAM21963),及分析其DNA结合区域。
参考大肠杆菌偏爱密码子,采用PrimerPremier5.0软件分别为SalL4(FL)设计11对引物,为SalL4(DBD)设计2对引物。
2.2.1.1SalL4(FL)引物:
F1:
5’-TTTGTGGCCGTGCGTTTACCACCAAAGGCAACCTGAAAGTGCATTATATGACCCATGGC-3’
R1:
5’-TCGCCAGTTTGCGACCACGGCGCGCGCTGTTGTTGTTCGCGCCATGGGTCATATAATGC-3’
F2:
5’-GAACGCACCCATACCGGCGAGAAACCGTTTGTGTGCAACATTTGTGGCCGTGCGTTTAC-3’
R2:
5’-CGTTTGCCTTCCGCGCTCAGCGCCGCCATAGGGTTTTCAATCGCCAGTTTGCGACCACG-3’
F3:
5’-CGGCAAGAACTTTAGCAGCGCCAGCGCGCTGCAGATTCATGAACGCACCCATACCGGCG-3’
R3:
5’-CGCCGGGCTCAGCAGTTCTTTGCTAAACACTTCCGGCGCGCGTTTGCCTTCCGCGCTCA-3’
F4:
5’AGCCACGACGCCAGGCGAAACAGCATTGCTGCACCCGCTGCGGCAAGAACTTTAGCAGC3’
R4:
5’CGCTGGTATACTGGTTCCACGACGCCGGGTCCACGCTCACCGCCGGGCTCAGCAGTTCT3’
F5:
5’-ATGCCGAGTGGTATGCCGCCGCTGCTGGCGAGCCAGCCGCAGCCACGACGCCAGGCGAA-3’
R5:
5’-CTAATTTCGTTGGTTTTCATCGCCAGGCCGCCGTTCAGCACGCTGGTATACTGGTTCCA-3’
F6:
5’-GAAAGTGGAAGTGCCGGGCACCTTTGTGGGCCCGCCGAGCATGCCGAGTGGTATGCCGC-3’
R6:
5’-GCTCACCGGCAGGGTCGGAATGCCGCCGCTCTGAATCACGCTAATTTCGTTGGTTTTCA-3’
F7:
5’-GCCTGCCGCCGACCTTTATTCGCGCGCAGCCGACCTTTGTGAAAGTGGAAGTGCCGGGC-3’
R7:
5’-TGCTAATGGTGCCGTTGCTCACCACGCTGCTCGCGCCCAGGCTCACCGGCAGGGTCGGA-3’
F8:
5’-CTGGCAGAAGCACTGGCGGCGGAAGAACCGGGCCGCACCAGCCTGCCGCCGACCTTTAT-3’
R8:
5’-CTCATCGGCATGCTCACGCCGGTCTGGCTGCCATCCAGTTTGCTAATGGTGCCGTTGCT-3’
F9:
5’-AGGTCAGGGCGAACAGCCGCAGCAGCTGCCGAGCCCGGATCTGGCAGAAGCACTGGCGG-3’
R9:
5’-CGCCATGCCATCCGGCACCGCCAGTTTTTCGCCGTTGCCGCTCATCGGCATGCTCACGC-3’
F10:
5’-GCCGCAAACAGGCGAAACCGCAGCATATTAACTGGGAAGAAGGTCAGGGCGAACAGCCG-3’
R10:
5’-CAATTTTGTTTTCTTCCAGAAAATGCGGAAACTGATGTTTCGCCATGCCATCCGGCACC-3’
F11:
5’-AGGATCCATGAGCCGCCGCAAACAGGCGAAACC-3’
R11:
5’-AAGCTTAGCTCACCGCAATTTTGTTTTCTTCCAG-3’
在第十一对引物引入限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ酶切位点(下划线部分),理论扩增片段大小为848bp,引物的合成由大连宝生物工程有限公司(Takara)完成。
2.2.1.1SalL4(DBD)引物:
5’-TTCTCCTCCGCGTCCGCGCTGCAGATTCATGAACGCACCCATACCGGCGAGAAACCGTT-3’
5’-GCCTTTGGTGGTAAACGCCCTGCCGCAAATGTTGCACACAAACGGTTTCTCGCCGGTAT-3’
5’-AGGATCCGGCTCTTGCACCAGGTGCGGCAAGAACTTCTCCTCCGCGTCCGCGC-3’
5’-AAAGCTTATGGGTCATATAATGCACTTTCAGGTTGCCTTTGGTGGTAAACGCC-3’
在第二对引物引入限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ酶切位点(下划线部分),理论扩增片段大小为153bp,引物的合成由大连宝生物工程有限公司(Takara)完成。
2.2.2目的基因的扩增
第一轮PCR以F1、R1两条引物互为模板,扩增的反应体系如下(表1):
表1第一轮PCR扩增反应体系
PrimeStarHSDNA聚合酶
0.5μl
10×
HSBuffer
5μl
dNTP
10μl
上游引物
1μl
下游引物
ddH2O
32.5μl
50μl
以后的每轮PCR均以上一轮PCR回收产物为模板,扩增的反应体系如下(表2):
表2每轮PCR扩增反应体系
模板
PCR反应条件:
95℃3min后用降落(Touchdown)PCR方式[6]进行扩增,第1个循环为94℃45s,59℃50s,72℃1min,重复三次,此后退火温度逐渐下降1℃,每个温度三个循环,当退火温度下降到56℃时,则以94℃45s,57℃50s,72℃1min运行16个循环,再于72℃延伸10min结束。
结果分析:
1.0%的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物,用DL2000作为DNAMarker。
电泳条件为:
电压90V,时间20min。
电泳完毕在紫外灯下观察并用凝胶成像系统照相。
2.2.3目的基因的回收与纯化
使用Omega公司的胶回收试剂盒[7]回收PCR产物,纯化目的基因。
取1μl回收产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后,贮存于-20℃备用。
2.2.4大肠杆菌JM109感受态细胞的制备
将保存于液氮的大肠杆菌JM109解冻后,划线接种于LB培养基平板,37℃恒温培养过夜。
挑取平板上的单个菌落,接种到20mlLB培养基液体37℃振荡培养过夜。
取1%的菌液接种到20ml新鲜LB培养基液体,37℃剧烈震荡,活化3h至OD600为0.5。
活化完得菌液冰上放置15min,使菌液冷却。
7000rpm离心1min,尽量弃尽上清,用预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬细胞,7000rpm离心1min,尽量弃尽上清。
用预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬细胞,即得感受态细胞。
每次感受态细胞使用期限为3d。
2.2.5基因的克隆
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,并在紫外灯下切胶回收预计片段大小处的DNA条带,PCR产物经过加A处理,反应体系如表3,再进行TA克隆,与pMD-19T连接,连接反应体系如表4,获得重组克隆质粒pMD-19T-SalL4(FL)。
表3PCR产物加A反应体系,反应条件:
72℃,,10min
SalL4(FL)PCR回收产物
7.5μl
LATaq
LATaqBuffer
表4pMD-19T载体连接反应体系,连接条件:
16℃,12h
SalL4(FL)
7μl
pMD-19T
T4ligase
T4ligasebuffe
2.2.6重组质粒的转化与酶切鉴定
在60μl制备好的大肠杆菌感受态细胞JM109中加入5μl连接完毕的质粒,混匀后在冰上放置30min,将管放到42℃恒温水浴热击90s,取出后迅速冰浴5min。
在管内加入100μlLB液体培养基轻轻混匀,37℃,150rpm复苏1h。
取100μl已转化的感受态细胞,涂在含氨苄青霉素的培养皿上,37℃培养过夜。
挑取阳性菌落,提取质粒[8],经过BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定后,酶切反应体系如表5,阳性克隆送大连宝生物工程有限公司(Takara)测序。
表5BamHⅠ和HindⅢ双酶切酶切反应体系,酶切条件:
37℃,1.5h
重组质粒
16μl
BamHⅠ
HindⅢ
KBuffer
2μl
20μl
2.2.7重组质粒pET-DsbA-SalL4(FL)和pET-DsbA-SalL4(DBD)的构建与鉴定
将已鉴定的重组体pMD-19T-SalL4(FL)pET-DsbA融合表达载体提取质粒,均用BamHⅠ和HindⅢ双酶切后,经琼脂糖凝胶电泳纯化回收所需片段,在T4DNA连接酶作用下16℃连接过夜,连接产物转化大肠杆菌感受态细胞JM109涂在含氨苄青霉素的LB平板上。
经过筛选重组质粒的转化子并提取重组质粒,BamHⅠ和HindⅢ酶切鉴定(表6)。
表6pMD-19T载体连接反应体系,连接条件:
pET-DsbA
将已鉴定的重组体pMD-18T-SalL4(DBD)pET-DsbA融合表达载体提取质粒,均用BamHⅠ和HindⅢ双酶切后,经琼脂糖凝胶电泳纯化回收所需片段,在T4DNA连接酶作用下16℃连接过夜,连接产物转化大肠杆菌感受态细胞JM109涂在含氨苄青霉素的LB平板上。
经过筛选重组质粒的转化子并提取重组质粒,BamHⅠ和HindⅢ酶切鉴定。
表7pMD-19T载体连接反应体系,连接条件:
SalL4(DBD)
2.2.8重组表达质粒pET-DsbA-SalL4(FL)和pET-DsbA-SalL4(DBD)的诱导表达
2.2.8.1重组质粒pET-DsbA-SalL4(FL)和pET-DsbA-SalL4(DBD)的转化、初步诱导
将鉴定正确的重组质粒pET-DsbA-SalL4(FL)和pET-DsbA-SalL4(DBD)分别转化BL21感受态细胞,在含氨苄青霉素的LB琼脂糖平板上培养过夜,挑取单菌落接种至含氨苄青霉素0.001g/ml的20ml液体LB培养基中,37℃、180rpm振荡培养过夜。
将过夜培养菌以2:
100转接至含上述抗生素的200ml新鲜培养基中,37℃、250rpm强烈振荡培养2-3h,培养至菌液的OD600值达到0.6左右时,在剩余菌液中加入IPTG至终浓度为1mmol/L,再补充一半浓度0.0005g/ml的氨苄青霉素32℃诱导6h。
此时各取出1ml菌液为已诱导的电泳检测。
2.2.8.2SDS-PAGE凝胶电泳
配制蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的凝胶:
15%分离胶和5%浓缩胶[9]。
取诱导后菌液各1ml,10000rpm,室温离心1min,弃上清;
菌体中加入75μl蒸馏水重悬,各加入20μl5×
loadingBuffer和5μl20×
DTT混匀,取75μl超声上清及超声沉淀重悬液,各加入20μl5×
DTT混匀。
100℃加热5min。
各取5μl上样,设电压为90V,蛋白进入分离胶后电压增至120V,电泳时间约80min。
电泳结束后将胶小心取出,用考马斯亮蓝染色1h。
染色后用脱色液脱色,每隔4小时换一次脱色液,脱色20h。
待脱色完全至背景无色,数码相机拍照保存图片。
2.2.8.3重组蛋白的大量制备与纯化
大量诱导培养:
培养菌液及蛋白诱导与上述初步诱导的方法一样,在活化时将菌液扩大培养,至250ml×
4瓶LB液体培养基,分瓶以利于大肠杆菌生长。
破菌收集上清:
共1L的诱导菌液,离心(4℃,12000rpm,5min)收集菌体,重悬于50ml含40mM咪唑的缓冲液,加少量溶菌酶放置10min,冰浴超声破碎(400W,每次超声5s,间隔10s,40次循环)。
4℃、12000rpm离心30min,收集上清。
过滤上清:
将离心收集的上清液通过0.45um滤膜。
过Ni2+柱纯化:
用200mMNiSO4处理层析柱,1ml预装填料Ni2+Chelatingsephraose可以吸附10mg的6His-tag融合蛋白。
已经鏊合了Ni2+层析柱用5个柱体积的ddH2O冲洗,再用含40mM咪唑的平衡缓冲液冲洗10个柱体积以达到平衡。
将过滤后的上清上样,缓慢通过柱子;
用含40mM咪唑的缓冲液,洗去杂蛋白;
用含200mM咪唑的缓冲液进行洗脱,在5只EP管中依次收集500μl洗脱液。
SDS-PAGE分析纯化的蛋白样品(洗脱液)。
检查纯化效果。
【实验结果与分析】:
3.1PCR扩增目的基因的结果
3.1.1SalL4(FL)目的基因的PCR结果
将SalL4(FL)每一步的PCR产物取1μl进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,获得特异性的目的条带,并与预期大小一致。
图1目的基因SalL4(FL)的分段PCR产物电泳M:
DL2,000DNAMarker;
1:
Sall4F1/Sall4R1;
2:
Sall4F2/Sall4R2;
3:
Sall4F3/Sall4R3;
4:
Sall4F4/Sall4R4;
5:
Sall4F5/Sall4R5;
6:
Sall4F6/Sall4R6;
7:
Sall4F7/Sall4R7;
8:
Sall4F8/Sall4R8;
9:
Sall4F9/Sall4R9;
10:
Sall4F10/Sall4R10;
11:
Sall4F11/Sall4R11
3.1.2SalL4(DBD)目的基因的PCR结果
将SalL4(DBD)每一步的PCR产物取10μl进行1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定,获得特异性的目的条带,并与预期大小一致。
图2目的基因SalL4(DBD)的分段PCR产物电泳M:
DL2,000DNAMarker;
1:
Sall4F1/Sall4R1;
2:
Sall4F2/Sall4R2
3.2目的基因序列的酶切鉴定
将SalL4(FL)PCR产物与PMD19-T载体连接,转化JM109感受态菌后,挑取白色菌落,接种于LB(含氨苄青霉素)培养基中,小量提取质粒DNA后,进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定,得到850bp左右的条带,酶切结果均与预计完全相同,酶切鉴定结果如图3。
图3pMD-19T-SalL(FL)重组质粒BamHⅠ/HindⅢ双酶切M:
L2,000DNAMarker;
1:
alL4(FL)阳性克隆质粒
将SalL4(DBD)PCR产物与PMD18-T载体连接,转化JM109感受态菌后,挑取白色菌落,接种于LB(含氨苄青霉素)培养基中,小量提取质粒DNA后,进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定,得到150bp左右的条带,酶切结果均与预计完全相同,酶切鉴定结果如图4。
图4pMD-18T-SalL(DBD)重组质粒BamHⅠ/HindⅢ双酶切M:
SalL4(DBD)阳性克隆质粒
3.3目的基因序列的测序结果
3.3.1SalL4(FL)基因测序结果
将获得的pMD19-T-SalL4(FL)克隆体转化至大肠杆菌E.coliJM109后,阳性菌落经大连宝生物工程有限公司测序,以通用引物pMD18F、pMD18R为测序引物,对pMD19-T-SalL4(FL)进行双向测序,测序峰图如图5、图6。
读取序列表明,PCR扩增序列正确,片段共848bp。
图5SalL4(FL)正向测序图
图6SalL4(FL)反向测序图
3.3.2SalL4(FL)基因序列BLAST比对
利用PrimerPremier5.0软件将测序所得的核苷酸序列翻译成蛋白质序列(图7),并在NCBI网站上利用BLAST工具进行同源性搜索和分析,结果显示这段序列与鼠源转录因子SalL4蛋白的氨基酸序列同源性为100%(图8)。
图7SalL4(FL)氨基酸序列
图8SalL4(FL)氨基酸序列BLAST比对结果
3.3.3SalL4(DBD)基因测序结果
将获得的pMD18-T-SalL4(DBD)克隆体转化至大肠杆菌E.coliJM109后,阳性菌落经大连宝生物工程有限公司测序,以通用引物pMD18F、pMD18R为测序引物,对pMD18-T-SalL4(FL)进行双向测序。
测序峰图如图9、图10。
读取序列表明,PCR扩增序列正确,片段共153bp。
图9:
SalL4(DBD)正向测序图
图10:
SalL4(DBD)反向测序图
3.3.5SalL4(DBD)基因序列BLAST比对
利用PrimerPremier5.0软件将测序所得的核苷酸序列翻译成蛋白质序列(
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