免疫组化非标记免疫酶法PAPWord文档下载推荐.docx
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包括酶桥法(EnzymeBridgeMethod)和过氧化物酶抗过氧化物酶法(PeroxidaseAntiperoxidaseMethod,PAP法)。
现分述如下。
(一)酶桥法
1.基本原理 首先用酶免疫动物,制备效价高、特异性强的抗酶抗体,然后使用第二抗体作桥,将抗酶抗体连结在与组织抗原结合的第一抗体上,再将酶结合在抗酶抗体,经呈色显示抗原的分布。
在此过程中,任何抗体均未被酶标记,酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合,避免了共价连结对抗体和酶活性的损害,提高方法的敏感性,且能节 省第一抗体的用量。
2.染色步骤主要程序如图4-4
图4-4 酶桥法主要染色步骤
(1)切片准备及第一抗体孵育前处理同间接法,第一抗体(假设来自种属A)孵育24h(4℃)。
第一抗体的稀释度可高些,使抗体的两个Fab段均与组织抗原结合,较牢固,漂洗时不易丢失。
(2)切片与第二抗体(也称桥抗体,抗种属aIgG抗体)孵育1~1.5h(室温)。
应用过量的桥抗体能保证一个Fab段与第一抗体结合,另一个Fab段游离。
(3)切片与抗酶抗体(来自种属A)孵育1~1.5h(室温)。
因抗酶抗体和第一抗体均系种属aIgG,具有相同的抗原性,所以桥抗体游离的Fab能与抗酶抗体结合,起到桥的作用,将抗酶抗体连结在与组织抗原结合的第一抗体上。
(4)切片与酶(HRp70~100μg/ml,PBS溶解)孵育0.5h(室温),酶与抗酶抗体结合。
(5)显色等与酶标抗体法相同。
酶桥法克服了酶标抗体法的缺点,较好地保护了抗体和酶活性。
但仍有其不足:
①在酶抗体血清中,含有低亲合力和高亲合力两类抗体,它们作为抗原与桥抗体结合,主要依赖于桥抗体对它的亲合力,而与其本身对酶的亲合力无关,故二者均可被连结在桥抗体上。
低亲合力的抗酶抗体与酶结合较弱,漂洗时易解离,使大部分酶(70%左右)丢失,降低了方法的敏感性。
②第三步所用的抗酶抗体血清中,亦含有非特异性抗体,其抗原性与抗酶抗体相同,所以能与桥抗体结合,但不能与酶结合,影响组织抗原的显示。
为此70年代初,Sternberger(1970)又建立了PAP法,并加以改良,现为ICC研究中常用的方法之一。
(二)PAP法
1.PAP的制备及特征 PAP复合物是离体制备的HRP抗HRP复合物,它的制备方法较多,现简介其中之一。
PAP复合物的形成不同于其它抗原抗体反应,在抗原稍过量时,所有的抗HRP抗体均参与形成可溶性PAP复合物,仅残留少许游离的HRP,而大多数抗原抗体反应需要抗原绝对过量才能形成可溶性复合物。
PAP复合物的形状相当稳定,不受抗原量的影响,无论最初加入的抗原抗体过量与否,最终形成的PAP复合物其HRP/抗HRP之比绝大部分为3:
2。
应用离心沉降、液相扩散等方法分析表明:
PAP复合物沉降系数为11.5s,分子量为400~430kD,由此可推算出酶与抗体之比为3:
2,即每个PAP生命物由3个HRP分子和2个抗HRP抗体组成,呈五角形结构,3个角为HRP,另两个角为抗HRP抗体。
采用H2O2-DAB染色,电镜下已经观察到PAP复合物五角形环状结构,直径平均21nm。
这种结构异常稳定。
据报告PAP复合物的抗HRP抗体与HRP结合常数为108,在此可溶性复合物中,即使存在少量游离HRP,亦不影响其稳定性。
2.PAP染色原理及步骤
(1)原理:
与酶桥法相似,都是借助桥抗体将酶连结在与组织抗原结合的第一抗体上,所不同的是PAP法将酶桥法的步骤3、4合并为1,用PAP复合物代替,即第三步用PAP复合物孵育切片,故称PAP法。
PAP复合物中的抗HRP抗体和第一抗体为相同种属动物的IgG,所以桥抗体能够作为“桥”将PAP复合物连结在第一抗体上。
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(2)染色步骤:
主要步骤与酶桥法相似,如图4-5。
①切片准备及第一抗体孵育前处理同间接法;
切片与特异性第一抗体孵育同酶桥法。
②用过量的桥抗体孵育,作用同酶桥法。
图4-5 PAP法主要染色步骤
③用离体制得的PAP复合物(1:
30~300稀释)孵育1~1.5h(室温),使其被桥抗体连结在第一抗体上。
亦可用ALP抗ALP复合物代替。
④显色观察等同间接法。
3.PAP法的评价 PAP法应用比较广泛,特别是近几年,PAP、ABC等试剂盒商品化,在科研和临床病理诊断等中有着广阔的前景。
其主要特征和注意事项如下:
(1)抗体活性高:
非标记抗体酶法最大限度地保存了抗体活性,因为在所有的反应过程中,任何抗体均未被酶连结,避免了标记过程(共价键连结)对抗体活性的损害。
(2)灵敏度高:
灵敏度是指ICC方法所能发现最少数量抗原而言。
从理论上讲,PAP法应该较间接法敏感2倍以上,因为酶标抗体法中,酶与抗体为1:
1标记,而PAP复合物含有3个HRP分子。
假设一个第一抗体同一个酶标抗体/PAP复合物结合,则被连结于抗原部位的酶分子数量不同,所以PAP法应较敏感。
我们知道组织切片抗原的含量是未知的,所以不能直接在切片上检测方法的敏感度;
但可以假设相邻切片抗原浓度相对恒定,采用相邻切片染色,以产生特异性染色所用的第一抗体最低浓度作为方法的敏感度,用信噪比(Signal/moise,S/N)表示。
据此,Sternberger(1979)认为PAP法较间接法敏感20~25倍,可进一步稀释第一抗体,以节 省其用量。
但实际上PAP法与间接法之间的差异并非如此明显。
笔者在实验中注意到,PAP显示阳性的抗原,相同的稀释倍数的第一抗体在间接法中亦呈阳性反应,而时间阴性时,PAP法亦为阴性。
其原因尚不清楚,可能与桥抗体和第一抗体结合时,“剩余”(游离)的Fab段少,PAP复合物被连结的相应减少有关。
另外,PAP复合物分子量较大(400KD),冰冻切片时,对组织穿透性远不如酶标抗体(分子量90~180kDa),所以不适于免疫电镜的标本制作。
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- 免疫 组化非 标记 PAP