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SDSPAGE检测蛋白质纯度
SDS-PAGE检测蛋白质纯度
1.电泳的大体原理
许多生物分子都带有电荷,其电荷的多少取决于分子性质及其所在介质的pH及其组成。
由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量和分子量的不同,在同一电场的作用下,各组分泳动的方向和速度也各异,因此,在一按时刻内,由于各组分移动距离的不同,而达到分离鉴定各组分的目的。
2.阻碍电泳的要紧因素
电泳介质的pH当介质的pH等于某种两性物质的等电点时,该物质处于等电状态,即不向正极或负极移动。
当介质pH小于其等电点时,那么呈正离子状态,移向负极;反之,介质pH大于其等电点时,那么呈负离子状态,移向正极。
因此,任何一种两性物质的混合物电泳均受介质pH的阻碍,即决定两性物质的带电状态及其量,为了维持介质pH的稳固性,经常使用必然pH的缓冲液,如分离血清蛋白质经常使用pH8.6的巴比妥或三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液。
缓冲液的离子强度离子强度对电泳的阻碍是:
离子强度低,电泳速度快,分离区带不易清楚;离子强度高,电泳速度慢,但区带分离清楚。
如离子强度太低,缓冲液的缓冲量小,不易维持pH的恒定;离子强度太高,那么降低蛋白质的带电量(紧缩双电层)使电脉速度减慢。
因此经常使用离子强度为之间。
电场强度电场强度和电泳速度成正比关系。
电场强度以每厘米的电势差计算,也称电势梯度。
如纸电泳的滤纸长15cm,两头电压(电势差)为150V,那么电场强度为150/15=10V/cm,电场强度愈高,那么带电粒子的移动愈快。
电压增加,相应电流也增大,电流过大时易产生热效应可使蛋白质变性而不能分离。
电渗作用在电场中,液体对固体的相对移动,称为电渗。
如滤纸中含有表面带负电荷的羧基,溶液那么向负极移动。
由于电渗现象与电泳同时存在,因此电泳的粒子移动距离也受电渗阻碍,如纸上电泳蛋白质移动的方向与电渗现象相反,那么事实上蛋白质泳动的距离,等于电泳移动距离减去电渗距离。
如电泳方向和电渗方向一致,其蛋白质移动距离,等于二者相加。
电渗现象所造成的移动距离可用不带电有色染料或有色葡聚糖点在支持物的中间,观看电渗方向和距离。
对支持物的选择一样要求支持物均匀,吸附力小,不然电场强度不均匀,阻碍区带的分离,实验结果及扫描图谱均无法重复。
如纸电泳时,滤纸厚薄不均匀或吸附力过大,那么蛋白质或其他胶体颗粒在它们泳动进程中有一部份被滤纸吸附,造成份离区带蛋白含量相对量降低。
因此,电泳前应事前处置滤纸,以减低滤纸的吸附能力,可取得较好的分离成效。
假设选用WhatwanNo.1号滤纸或国产新华滤纸,一样不需要进行预处置。
温度对电泳的阻碍电泳进程中由于通电产生焦尔热,热对电泳有专门大的阻碍。
温度升高时,介质粘度下降,分子运动加重,引发自由扩散变快,迁移率增加。
温度每升高1度,迁移率约增加%。
为降低热效应付电泳的阻碍,可操纵电压或电流,也可在电泳系统中安装冷却散热装置。
3.电泳的分类
按分离原理分类可分为区带电泳、移界电泳、等速电泳和聚焦电泳4种。
1)区带电泳电泳进程中,不同的离子成份在均一的缓冲液中分离成独立的区带,这是当前应用最普遍的电泳技术。
2)移界电泳是Tiselius最先成立的电泳,它是在U型管中进行的,由于分离成效较差,已为其它电泳技术所取代。
3)等速电泳需专用电泳仪,当电泳达到平稳后,各区带相随分成清楚的界面,并以等速移动。
4)等电聚焦由于具不一样电点的两性电解质载体在电场中,自动形成pH梯度,使分离物移动至各自等电点的pH处聚集成很窄的区带,且分辨率较高。
从表面看与区带电泳相似,但原理不同。
区带电泳的分类
1)按支持物物理性状分类
1.滤纸及其他纤维素膜如乙酸纤维膜、玻璃纤维膜、聚胺纤维膜电泳。
2.粉末电泳,如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳。
3.凝胶电泳,如琼脂糖、琼脂、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳。
4.丝线电泳,如尼龙丝、人造丝电泳。
2)按支持物的装置形式不同分类
1.平板式电泳,支持物水平放置,是最经常使用的电泳方式。
2.垂直板式电泳。
3.持续流动电泳,第一应用于纸电泳,将滤纸垂直竖立,两边各放一电极,缓冲液和样品自顶端下流,与电泳方向垂直。
可分离较大量的蛋白质。
以后有效淀粉、纤维素粉、玻璃粉等代替滤纸,分离成效更好。
3)按pH的持续性不同分类
1.持续pH电泳:
电泳全数进程中缓冲液pH维持不变。
如纸电泳、乙酸纤维膜电泳。
2.不持续pH电泳:
缓冲液与支持物之间有不同的pH,如聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳、等电聚焦电泳、等速电泳等,能使分离物质区带加倍清楚,并可作ng级微量物质的分离。
不持续电泳与持续电泳的要紧区别在于前者①有两层不同孔径的凝胶系统;②电极槽中及两层凝胶中所用的缓冲液pH值不同;③电泳进程中形成的电位梯度亦不均匀。
而后者在这三个方面都是单一或是均匀的。
4.几种常见的电泳方式
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis)是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳,这种凝胶由丙烯酰胺(acrylamide,简称Acr)和交联剂N,N′-甲叉基(亚甲基)双丙烯酰胺(N,N′-methylene-bis-acrylamide,简称Bis)聚合而成。
聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好,弹性大,透明,化学稳固性高,无电渗作用,设备简单,用样量少(1-100μg)和分辨率高等优势,并可通过操纵单体浓度或单体与交联剂的比例聚合成孔径大小不同的凝胶,可用于蛋白质、核酸等物质的分离、定性和定量分析。
还可结合去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS),以测定蛋白质亚基分子量。
聚丙烯酰胺的聚合反映及其结构如下:
图APS引发TEMED催化Acr与Bis的聚合反映
Acr或Bis不管单独存在或混合在一路都是稳固的,一旦显现自由基团时,就会发生聚合反映。
自由基团的引发有化学和光合两种方式,化学法的引发剂是过硫酸胺(简称Aps),催化剂为四甲基乙二胺(简称TEMED);光化学法是在光线照射下,由光灵敏物质核黄素来引发,催化剂也是TEMED。
由于单体及交联剂、引发剂和催化剂的浓度、比例、聚合条件等的不同,即可产生不同孔径的凝胶。
一样而言,凝胶浓度愈大,交联度愈大孔径愈小。
凝胶浓度的选择与被分离物分子量及其性质有关,其大致选用范围如下表:
表:
分子量范围与凝胶浓度的关系
分子量范围
适用的凝胶浓度(%)
蛋白质
<104
1—4×104
1—5×104—1×105
1×105
>5×105
20—30
15—20
10—15
5—10
2–5
核酸(RNA)
<104
104—105
105—2×106
15—20
5—10
2—
依照凝胶形状可分为盘状电泳和板状电泳。
盘状电泳是在直立的玻璃管内,利用不持续的缓冲液的pH值进行电泳,同时,由于样品混合物被分开后形成的区带超级窄,呈圆盘状(discoidshape),故而得名。
板状电泳(垂直或水平)是将丙烯酰胺聚合成方形或长方形平板状,平板大小和厚度视实验需要而定。
垂直平板电泳有如下优势:
①表面积大,易于冷却,便于操纵温度;②能在同一凝胶板上,相同操作条件下,同时点加多个样品,便于彼此比较;③一个样品在第一次电泳后,可将平板转90度进行第二次电泳即双向电泳;④便于用各类方式鉴定(如放射自显影等)。
其缺点是制备凝胶时操作较复杂,电压较高,电泳时刻较长。
凝胶的机械性能,弹性、透明度和粘着度取决于凝胶总浓度。
通经常使用T%表示总浓度,即100mL凝胶溶液中含有Acr及Bis的总克数。
Acr和Bis的比例经常使用交联度C%表示,即交联剂Bis占单体Acr和Bis总量的百分数。
凝胶的孔径要紧受总浓度T%的操纵。
通常T%越大,平均孔径越小,凝胶的机械强度增加。
实验说明,当T%值固按时,Bis浓度在5%时孔径最小,高于或低于5%时,孔径却相应变大。
为了在利用凝胶做实验时有较高的重现性,制备凝胶所用的Bis浓度,Bis和Acr的比例,催化剂的浓度,聚合反映的溶液pH值,聚胶所需时刻等,凡能阻碍泳动率的因子都必需维持恒定。
欲将蛋白质或核酸类大分子混合物专门好地分离,并在凝胶上形成明显的区带,选择必然孔径的凝胶是关键。
文献中常见的标准凝胶是指浓度为%,凝胶孔径平均为5nm。
大多数生物体内蛋白质在此标准凝胶中电泳均能取得中意结果。
不持续凝胶电泳的支持体由样品胶、分离胶和浓缩胶组成。
样品胶为最上层;中层为浓缩胶,一样Acr为2%-3%,缓冲液为不同浓度的Tris-HCl、pH为左右;分离胶为最基层,Acr为5%-10%,缓冲液经常使用Tris-HCl,pH为。
上下电泳槽盛有pH为的Tris-甘氨酸缓冲液,上电泳槽接电源的负极,下电泳槽接正极。
不持续凝胶电泳的分离原理如下:
1.样品的浓缩效应
1)凝胶层的不持续性:
浓缩胶与分离胶中所用原料总浓度和交联度不同,孔径大小就不同。
前者孔径大,后者孔径小。
带电荷的蛋白质离子在浓缩胶中泳动时,因受阻力小,泳动速度快。
当泳动到小孔径的分离胶时,碰到阻力大,移动速度慢慢减慢,使样品浓缩成很窄的区带。
2)缓冲液离子成份的不持续性,最上层电极缓冲液中甘氨酸在pH时,可部份解离为NH2CH2COO-。
三层胶中的缓冲液都是Tris-HCl,HCl在各自pH条件下均被全数解离为Cl-,而在时蛋白质被解离带负电(因大部份蛋白质pI值为左右,通电后,电极缓冲液中的甘氨酸进入浓缩胶缓冲液,pH由变成),使甘氨酸解离度降低,负电荷减少,迁移率明显下降(称慢离子),相反Cl-处于解离状态,且颗粒和摩擦力最小,其迁移率最大(称快离子),结果在浓缩胶中,离子迁移率为Cl->蛋白质->甘氨酸-。
由于Cl-的快速移动,使在Cl-后面胶层中的离子浓度骤然降低,形成一个低电导或称高电位梯度(电位差)区域(电势梯度E=电流强度I/电导率η),因为电泳速度取决于电位差和有效迁移率,因此在此区域中,使蛋白质离子及甘氨酸离子加速向阳极移动。
当快离子、慢离子和蛋白质的迁移率与电位梯度的乘积彼此相等时,那么3种离子移动速度相同。
在快离子和慢离子的移动速度相等的稳固状态成立以后,那么在快离子和慢离子之间形成一个稳固而又不断向阳极移动的界面。
也确实是说,在高电位梯度和低电位梯度之间形成一个迅速移动的界面(见图24)。
由于蛋白质离子的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间,因此就聚集在那个移动的界面周围,被浓缩成很窄的薄层。
此浓缩效应使蛋白质浓缩了数百倍。
在分离胶层中,因缓冲液pH为,甘氨酸进入此胶层后,其解离度大大增加,它的迁移率几乎与Cl-接近。
另外,分离胶孔径小,蛋白质在泳动时,所受阻力较浓缩胶中大,移动缓慢。
由于这两个缘故,使甘氨酸离子在分离胶中有效迁移率超过蛋白质离子,致使分离胶不具有浓缩胶效应,而只有分离效应。
2.分子筛效应由于在凝胶电泳中,凝胶浓度不同,其网的孔径大小也不同,可通过的蛋白质分子量范围也就不同。
在分离胶中孔径较小,分子量和构型不同的蛋白质分子,通过必然孔径的凝胶时所受阻力不同,从而引发泳动速度的转变,因此多种蛋白质即便所带电荷相同,迁移率相等,在聚丙烯酰胺中经一按时刻泳动后,也能彼此分开。
大分子受阻程度大,走在后面,小分子受阻小,走在前面。
3.电荷效应由于各类蛋白质所带电荷不同,有效迁移率也不同,它们在浓缩胶和分离胶交壤处被浓缩成狭小区带,仍以必然程序排列成各自的小圆盘状,紧接在一路。
当它们进入分离胶时,由于电泳体系已处于一个均一的持续状态中,故现在以电荷效应为主,带不同电荷的蛋白质离子按其移动速度大小按序分离。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
PAGE电泳是依照蛋白质分子(或其它生物大分子)所带电荷的不同及分子大小的不同所产生的不同迁移率而分离成假设干条区带。
但是有时两个分子量不同的蛋白质,由于其分子大小的不同、被它们所带电荷的不同补偿而以相同的速度向阳极移动,因此不能达到分离的目的。
SDS-PAGE确实是设法将电荷不同这一因素除去或减小到能够略而不计的程度。
SDS是一种阴离子表面活性剂,能使蛋白质的氢键、疏水键打开,并结合蛋白质疏水部份,形成SDS-蛋白质复合物。
在必然条件下,SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质。
由于SDS带有负电荷,使各类SDS-蛋白质复合物都带上相同密度的负电荷,它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量,因此掩盖了不同蛋白质分子原有的电荷不同。
如此的SDS-蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁移率再也不受蛋白质原有的电荷和形状的阻碍,而只与蛋白质的分子量有关。
5.染色方式
经醋酸纤维薄膜、琼脂(糖)、聚丙烯酰胺电泳分离的各类生物分子需用染色法使其在支持物相应位置上显示出谱带,从而检测其纯度、含量及生物活性。
蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核酸及酶等均有不同的染色方式,现别离介绍如下:
蛋白质染色
染色液种类繁多,各类染色液染色原理不同,灵敏度各异。
利历时可依照需要加以选择。
经常使用的染色液有:
1.氨基黑10B
氨基黑10B分子式为C22H13N6S3Na3,MW=715,λmax=620-630nm,是酸性染料。
其磺酸基与蛋白质反映组成复合盐,是最经常使用的蛋白质染料之一,但对SDS-蛋白质染色成效不行。
另外,氨基黑10B染不同蛋白质时,着色度不等、色调不一(有蓝、黑、棕等);作同一凝胶柱的扫描时,误差较大,需要对各类蛋白质作出本身的蛋白质-染料量(吸收值)的标准曲线,更有利于定量测定。
2.考马斯亮蓝R250
考马斯亮蓝R250的分子式为C14H44O7H3S2Na,MW=824,λmax=560-590nm。
染色灵敏度比氨基黑高5倍。
该染料是通过范德瓦尔键与蛋白质结合,尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色,但蛋白质浓度超过必然范围时,对高浓度蛋白质染色不合乎Beer定律,作定量分析时要注意这点。
3.考马斯亮蓝G250
考马斯亮蓝G250比R250多二个甲基。
MW=854,λmax=590-610nm。
染色灵敏度不如R250,但比氨基黑高3倍。
其优势是在三氯乙酸中不溶而成胶体,能选择地使蛋白质染色而几乎无本底色,因此经常使用于需要重复性好和稳固的染色,适于作定量分析。
4.固绿
固绿分子式为C37H31N2O10S3Na2,MW=808,λmax=625nm,酸性染料。
染色灵敏度不如考马斯亮蓝,近似于氨基黑,但却可克服考马斯亮蓝在脱色时易溶解出来的缺点。
5.荧光染料
略
6.银染色法
此法较考马斯亮蓝灵敏100倍。
但染色机制尚不清楚,可能与摄影进程中Ag+的还原相似。
7.广谱染料(stains-all)染色法
糖蛋白染色
1.过碘酸-Schiff试剂
2.阿尔山蓝染色
脂蛋白染色
1.油红O染色
2.苏丹黑B
实验一SDS-PAGE凝胶电泳法测定蛋白质的纯度
[目的要求]
学习SDS-PAGE测定蛋白质纯度的原理和方式;把握SDS-PAGE的其他应用
[原理]
SDS-PAGE是PAGE的一种特殊形式,有关理论如上所述。
SDS是带负电荷的阴离子去污剂。
用SDS-PAGE测定蛋白质分子量时,蛋白质需经样品溶解液处置。
在样品溶解液中含有巯基乙醇及SDS,各类蛋白质样品在巯基乙醇作用下还原成单链,再进一步与SDS结合形成带大量负电荷的SDS-蛋白质复合物。
因此各类蛋白质分子在SDS-PAGE中,只能按其分子量大小而分离。
SDS-PAGE有持续体系及不持续体系两种,这两种体系有各自的样品溶解液及缓冲液,但加样方式,电泳进程及固定、染色与脱色方式完全相同。
[操作步骤]
一、安装夹心式垂直板电泳槽
1.装上贮槽和固定螺丝钉,仰放在桌面上。
2.将长、短玻璃板别离插到硅橡胶框的凹形槽中,注意勿用手接触灌胶面的玻璃。
3.将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上,短玻璃板应面对上贮槽。
4.将下贮槽的销孔对准以装好螺丝钉的上贮槽,双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。
5.竖直电泳槽,在长玻璃板下端与硅胶模框交壤的裂缝内加入已融化的1%琼脂,以
封住间隙,加琼脂溶液时,应避免气泡进入。
二、配胶及凝胶板的制备
1.配胶依照所测蛋白质分子量范围,选择适宜的分离胶浓度。
由于SDS-PAGE有持续系统及不持续系统两种,二者间有不同的缓冲系统,因此有不同的配制方式,见表一、2。
表1SDS-不持续体系凝胶配制
试剂名称
20mL分离胶所需试剂用量(mL)
浓缩胶试剂用量
5%
%
10%
15%
5%
分离胶贮液30%%Bis
分离胶缓冲液Tris-HCl
浓缩胶贮液10%%Bis
浓缩胶缓冲液Tris-HCl
10%SDS
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
1%TEMED
TEMED原液5uL
双蒸水
50%甘油
10%APS
mL
电极缓冲液为Tris-甘氨酸缓冲液,内含%SDS。
表2略
2.凝胶板的制备
(1)SDS-不连续体系凝胶板的制备
分离胶的制备:
按表1配制20%聚丙烯酰胺,混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的裂缝内,约8cm高,用1mL移液器取少量水饱和正丁醇,沿长玻璃板板壁缓慢注入,约3-4mm高,以隔离空气。
约30min后,凝胶与水饱和正丁醇层间显现折射率不同的界限,那么表示凝胶完全聚合。
倾去水饱和正丁醇,再用滤纸条吸去多余水分。
浓缩胶的制备:
按表1浓缩胶配制方式配制4mL5%聚丙烯酰胺,混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方,直至距离短玻璃板上缘约0.5cm处,轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内,约30min后凝胶聚合。
警惕拔去样品槽模板,用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分,将Tris-甘氨酸缓冲液倒入上、下贮槽中,应没太短板约0.5cm以上,即可预备加样。
三、样品的处置与加样
1.样品的处置
依照分子量标准蛋白试剂盒的要求加样品溶解液;自己配制标准及未知样品,按mL加样品溶解液,溶解后,将其转移到带塞小离心管中,轻轻盖上盖子(不要塞紧,以避免加热时迸出),在100℃滚水浴中保温3min,掏出冷却后加样。
如处置好的样品临时不用,可放在-20℃冰箱保留较长时刻,利用前在10O℃滚水中加热3min,以除去亚稳态聚合。
2.加样
一样每一个凹形样品槽内,只加一种样品或已知分子量的混合标准蛋白质,加样体积要依照凝胶厚度及样品浓度灵活把握,一样加样体积为10-15μL(即2-10μg蛋白)。
如样品较稀,加样体积可达100μL。
如样品槽中有气泡,可用注射器针头排除。
加样时,将微量注射器的针头通过电极缓冲液伸入加样槽内,尽可能接近底部,轻轻推动微量注射器,注意针头勿碰破凹形槽胶面。
由于样品溶解液中含有比重较大的蔗糖或甘油,因此样品溶液会自动沉降在凝胶表面形成样品层。
四、电泳
不持续系统:
在电极槽中倒入Tris-甘氨酸电极缓冲液,内含%SDS即可进行电泳。
电泳条件:
开始时电流为10mA左右,待样品进入分离胶后,改成20-30mA,当染料前沿距硅橡胶框底边时,停止电泳,关闭电源。
五、凝胶板剥离与固定
电泳终止后,取下凝胶模,卸下硅橡胶框,用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板,在凝胶板切下一角作为加样标志。
将凝胶板放在大培育皿内。
六、染色与脱色
将染色液倒入培育皿中,染色1h左右,用蒸馏水漂洗数次,再用脱色液脱色,直到蛋白质区带清楚,即可计算相对迁移率。
七、绘制标准曲线
将大培育皿放在一张坐标纸上,量出加样端距细铜丝间的距离(cm)和各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm)。
按下式计算相对迁移率mR:
相对迁移率mR=蛋白样品距加样端距离/溴酚蓝区带中心距加样端距离
以标准蛋白质的相对迁移率为横坐标,标准蛋白质分子量为纵坐标在半对数坐标纸上作图,可取得一条标准曲线。
依照未知蛋白质样品相对迁移率可直接在标准曲线上查出其分子量。
[注意事项]
1.SDS纯度
2.SDS与蛋白的结合量
3.凝胶浓度:
应依照未知样品的估量分子量,选择凝胶浓度。
分子量在25000-200000的蛋白质选用终浓度为5%的凝胶;分子量在10000-70000的蛋白质选用终浓度为10%的凝胶;分子量在10000—50000的蛋白质选用终浓度为15%的凝胶,在此范围内样品分子量的对数与迁移率呈直线关系。
以上各类凝胶浓度其交联度都应是%。
标准蛋白质的相对迁移率最好在-之间均匀分布。
用此法测定的分子量只是它们的亚基或单条肽键的分子量,而不是完整的分子量。
为测得精确的分子量范围,最好用其他测定蛋白分子量的方法加以校正。
此法对球蛋白及纤维状蛋白的分子量测定较好,对糖蛋白,胶原蛋白等分子量测定差异较大。
4.对样品的要求:
应采纳低离子强度的样品。
如样品中离子强度高,那么应透析或经离子互换除盐。
加样时,应维持凹形加样槽胶面平直。
加样量以10~15μL为宜,如样品系较稀的液体,为保证区带清楚,加样量可增加,同时应将样品溶解液浓度提高二倍或更高。
5.由于凝胶中含SDS,直接制备干板会产生龟裂现象。
[试剂]
1.标准蛋白质目前国内外均有厂商生产低分子量及高分子量标准蛋白质成套试剂盒,用于SDS-PAGE测定未知蛋白质分子量。
2.不持续体系SDS-PAGE有关试剂
(1)10%SDS溶液:
称5gSDS,加双蒸水至50mL,微热使其溶解,置试剂瓶中,4℃贮存。
用前微热,使SDS完全溶解。
(2)l%TEMED:
取1mLTEMED,加双蒸水至100mL,置棕色瓶中,4℃贮存。
(3)10%APS:
称APS1g加双蒸水至10mL。
最好临用前配制。
(4)样品溶解液:
内含1%SDS,1%巯基乙醇,40%蔗糖或20%甘油,%溴酚蓝,LTris-HCl缓冲液。
(5)凝胶贮液
30%分离胶贮液:
称Acr30g及Bis0.8g,溶于双蒸水中,最后定容至100mL,过滤后置棕色试剂瓶中,4℃贮存。
10%浓缩胶贮液:
称Acr10g及Bis0.5g,溶于双蒸水中,最后定容至100mL,过滤后置棕色试剂瓶中,4℃贮存。
(6)凝胶缓冲液
分离胶缓冲液(mol/LTris-HCl缓冲液):
称Tris36.3g加少量双蒸水使其溶解,再加1mol/LHCl约48mL,调pH至,最后加双蒸水定容至100mL,4℃贮存。
浓缩胶缓冲液(LTris-HCl缓冲液):
称Tris6.0g,加少量双蒸水使其溶解,再加1mol/LHCl约48mL,调pH至。
最后用双蒸水定容至100mL,4℃贮存。
(7)电极缓冲液(内含%SDS,mol/LTris-mol/L甘氨酸缓冲液):
称Tris6.0g,甘氨酸28.8g,加入SDS1g,加蒸馏水使其溶解后定容至1000mL。
4.固定液
取50%甲醇454mL,冰乙酸46mL混匀。
5.染色液
称考马斯亮蓝R2500.125g,加上述固定液250mL,过滤后应用。
6.脱色液
冰乙酸75mL,甲醇50mL,加蒸馏水定容至1000mL。
表1SDS-不持续体系凝胶配制
试剂名称
20mL分离胶所需试剂用量(mL)
浓缩胶试剂用量
5%
%
10%
15%
5%
分离胶贮液30%%Bis
分离胶缓冲液Tris-HCl
浓缩胶贮液
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- SDSPAGE 检测 蛋白质 纯度