猪圆环病毒引起的断奶后多系统衰竭综合征诊断方法标准的建立Word格式文档下载.docx
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其它不常见的症状有发热、嗜睡、胃溃疡、中枢神经紊乱、猝死。
这些临床症状不会同时在同一头猪上出现。
发病猪场在一段时间内会出现大多数症状。
一些临床症状由于继发感染或双重感染而恶化。
3.2病理变化
3.2.1剖检变化
最显著的病变是全身淋巴结,特别是腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结、气管、支气管淋巴结及下颌淋巴结肿大到2-5倍,有时可达10倍。
在PMWS感染猪也观察到正常或萎缩的淋巴结。
切面硬度增大,均匀的苍白色,集合淋巴小结也肿大。
发生细菌感染,则淋巴结可见炎症和化脓病变,使病变复杂化。
———————————
作者简介:
崔尚金:
博士,副研究员,目前主要从事动物疫病诊断、流行病学、地理信息系统GIS和外来病的研究工作.
*通讯作者,E-mail:
;
肺肿胀不崩陷,有散在,大而隆起橡皮状硬块。
严重的病例,肺泡出血,部分病例尖叶和心叶萎缩或固质化。
脾中度肿大,呈肉变。
半数病例肝脏无明显异常,其它病猪表现不同程度的虎斑状外观,并伴有轻度或中度萎缩,有的病例肝肿大。
肾脏水肿,苍白,被膜下有白色坏死灶,盲肠和结肠粘膜充血或瘀血。
许多PMWS感染猪有支气管肺炎和胃溃疡,但胃溃疡和PCV2感染无直接关系,胃溃疡发生是多原因的。
支气管肺炎与细菌感染有关,然而胃内病灶引起内出血,导致部分PMWS猪死亡的原因,也是导致皮肤苍白的原因。
3.2.2组织学变化
淋巴结的皮质及副皮质区显著扩张,有单核/巨噬细胞,组织细胞浸润,有时还散布着大量的多核巨细胞。
淋巴细胞减少,淋巴结基质常增生或有嗜酸性细胞浸润。
淋巴滤泡有由组织细胞、类上皮细胞、巨噬细胞、多核巨细胞、嗜酸性白细胞、淋巴细胞集聚形成的肉芽肿。
其它组织有广泛的淋巴细胞、单核细胞、组织细胞浸润。
4病毒的分离与鉴定
4.1材料准备
4.1.1器材:
25cm2(T25)细胞培养瓶、直径15mm盖玻片、55mm圆形有盖平皿、微量移液器、恒温水浴箱、二氧化碳(CO2)恒温箱、普通冰箱及低温冰箱、离心机及离心管、组织研磨器、孔径0.2μm的微孔滤膜、普通光学显微镜。
4.1.2试剂:
RPMI1640营养液、犊牛血清、青霉素(105ug/mL)与链毒素(105ug/mL)溶液、氯仿、300mMD(+)氨基葡萄糖、Hanks平衡盐溶液。
4.1.3细胞培养物:
无PCV污染的猪肾传代细胞PK-15。
4.1.4样品
4.1.4.1样品的采取和送检:
在发病早期,无菌采取病猪的血清。
对病死猪立即采取肺、扁桃体、淋巴结、脾、肾、肝等组织数小块,置冰瓶内立即送检。
不能立即检查者,应放-25℃~-30℃冰箱中,或加50%甘油生理盐水,4℃保存送检。
4.1.4.2样品的处理:
若样品经PCR检测为PCV阳性,按如下方法进行处理。
血清可直接使用。
肺、淋巴结、扁桃体、脾、肾、肝等组织混合,组织剪碎后研磨成糊状,加入含有105ug/ml链霉素,105ug/ml青霉素,两性霉素B200ug/ml的RPMI1640营养液,制成10%(W/V)悬液,-20℃反复冻融3次或-70℃冻融1次,2000g离心30min。
吸取上清液,转移到新的离心管中,每1ml上清加入50ul氯仿,室温下不断混合10min,1000g离心10min。
怀疑有细菌污染的样品,也可用0.2μm微孔滤膜过滤处理。
取上清,注意避免吸出氯仿,分装,-70℃保存。
4.2操作方法
4.2.1接种样品:
取2ml上清液加到18mlPK-15细胞悬液,细胞浓度达到5×
104个/ml,培养液用10%犊牛血清和1%双抗的RPMI1640。
将12ml病毒细胞混合悬液分装到2个25cm2(T25)通气的细胞培养瓶中,每瓶6ml。
6ml加入到装有直径15mm盖玻片的55mm圆形有盖平皿中,置于37℃5%CO2培养箱。
4.2.2细胞处理:
接种后18-24h长成50-60%单层细胞,倾去培养瓶中培养液,加入2-3ml预热300mMD(+)氨基葡萄糖,能覆盖细胞足以,放入37℃培养箱继续作用30min。
去除氨基葡萄糖,以Hanks平衡盐溶液冲洗2-3次,加入含有2%血清的维持液,放回培养箱。
4.2.3继续培养48h后,用间接免疫荧光法对平皿中的玻片培养物进行染色,以监控病毒生长。
4.2.4重复感染:
取1个T25瓶反复冻融3次。
用胰酶消化另一个T25瓶内细胞,悬于21ml生长液,再加入第一瓶中的细胞悬液6ml,取15ml接到一个75cm2(T75)瓶,6ml接到一个T25瓶,6ml接种到有盖玻片的平皿中。
4.2.572-96h后取平皿中玻片进行免疫荧光染色,观察病毒的生长情况。
将T25瓶反复冻融3次,接种到T75瓶内,继续传代。
取少量细胞悬液进行PCR的检测。
4.3结果的判断和解释
在第一代培养时,若IFA检测为阴性应继续盲传,第三代培养IFA、PCR检测为阳性,则判定为PCV病毒分离阳性。
5聚合酶链式反应(PCR)
5.1材料准备
5.1.1器材:
微量移液器、吸头、离心机、研磨器、PCR仪、电泳仪、恒温水浴锅、恒温干燥箱等。
5.1.2试剂:
Tris饱和酚、氯仿、10%SDS、50ug/ml蛋白酶K、无水乙醇或异丙醇、3MpH5.2醋酸钠、75%乙醇;
TaqDNA聚合酶、dNTP(2.5mmol/l)、10×
Buffer、灭菌去离子水、特异性引物、标准DNA分子量的Marker、上样缓冲液。
5.2病毒DNA的提取:
5.2.1样品的处理:
取发病猪脾、淋巴结、肝、肾等脏器剪碎加入适量生理盐水研磨制成组织匀浆,反复冻融3次,3000g离心20min,吸取上清用于提取DNA。
发病猪的全血和血清可直接进行检测。
5.2.2核酸提取:
5.2.2.1取500ul组织冻融上清、全血或血清加入25ul10%SDS,5ul蛋白酶K,振荡混合数次,置37-56℃水浴锅中2-3小时,其间振荡混合几次。
5.2.2.2酚抽提:
每管中加入200ul酚,颠倒混合30s,12000rpm离心10min。
吸出上层水相,转移到新管。
5.2.2.3酚/氯仿抽提:
每管分别加入100ul和100ul氯仿,颠倒混合30s,12000rpm离心10min。
吸出上层水相,转移到新管,并作好标记。
5.2.2.4氯仿抽提:
每管分别加入200ul氯仿,颠倒混合30s,12000rpm离心10min。
5.2.2.5每管中加入2.5倍无水乙醇,1/10体积的3MpH5.2NaAc(醋酸钠),混合数次,-20℃沉淀2h或过夜。
或每管中加入等体积的异丙醇,1/10体积的3MpH5.2NaAc(醋酸钠),混合数次,室温下沉淀20-30min。
5.2.2.613000rpm离心10-15min,倒掉管内液体,在滤纸上吸干,不要求完全干燥。
5.2.2.7每管中加入100-200ul70%的乙醇,12000rpm离心5min。
倒掉管内液体,在滤纸上吸干,放入37℃温箱烘干。
5.2.2.820-40ul灭菌水溶解沉淀,反复吹打沉淀,促进沉淀溶解。
5.2.3PCR扩增:
PCR反应液应在冰上配制,配液顺序:
灭菌水,10×
buffer,dNTP,引物,Taq酶,样品DNA。
5.2.3.150ul的反应体系:
Taq(5U/ul):
0.4-0.5ul
10×
buffer:
5ul
dNTP(2.5mM):
4ul
引物1(10pmol/ul):
2ul
引物2(10pmol/ul):
灭菌水:
upto50ul
模板DNA:
5.2.3.2PCV病毒特异性引物序列:
能扩增PCV1和PCV2,扩增片段938bp。
P1:
5'
-gTCTTCTTCTgCggTAACgCCTCCTTg-3'
,P2:
-TAggAggCTTCTACAgCTgggACAg-3'
;
PCV2型特异性引物序列:
扩增片段为490bp。
P3:
-ATTgTAgTCCTggTCgTATATACTgT-3'
,P4:
-CTCCCgCACCTTCggA-3'
5.2.3.3PCR的反应条件:
95℃5min;
94℃1min,52℃1min,72℃1min,35个循环;
72℃10min.
5.2.3.4PCR电泳:
取5ulPCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳。
5.2.4结果判定与解释:
PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳,扩增出938bp和490bp的两条带为PCV2阳性。
只扩增出938bp一条带为PCV1阳性。
同时应设正常PK-15细胞DNA、水阴性对照,不能扩增出任何条带。
PCV1阳性DNA的阳性对照可扩增938bp,PCV2阳性DNA的阳性对照可扩增938bp和490bp的两条带。
6间接免疫荧光试验(IFA)
6.1材料准备
6.1.1器材:
荧光显微镜、恒温箱、保湿盒、微量移液器等。
6.1.2试剂
6.1.2.1IFA诊断板的制备:
见附录。
6.1.2.2兔抗猪异硫氰酸荧光黄(FITC)结合物、标准阳性血清和标准阴性血清,由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所疫病诊断与流行病学中心提供。
6.1.3样品:
采集被检猪血液,分离血清,血清必须新鲜、透明、不溶血、无污染,密装于灭菌小瓶内,4℃或-30℃冰箱保存或立即送检。
试验前将被检血清统一编号,并用PBS液作20倍稀释。
6.2操作方法
6.2.1取IFA诊断板,编号,弃去板中的乙醇溶液,置超净工作台中风干,每孔加100μLPBS液洗一次,弃去PBS液并在吸水纸上轻轻拍干。
6.2.2在编号对应的孔内加入20倍稀释的被检血清:
同一排相邻的感染细胞孔2个及其后感染细胞孔1个,每孔100ul,同时做标准阴、阳性血清及空白对照,空白对照是用PBS液代替血清。
置37℃恒温箱中感作45min。
6.2.3弃去板中血清,用PBS液洗板3次,每孔100ul,每次5min,最后在吸水纸上轻轻拍干。
6.2.4每孔加入工作浓度的兔抗猪FITC结合物50ul,在37℃恒温箱中感作45min。
6.3荧光显微镜检查及判定与解释
荧光显微镜采用蓝紫光(激发滤板通常用BG12,吸收滤板用OG1或GG9),在5倍~10倍目镜下检查。
标准阳性血清对照中感染细胞孔(P·
V+)应出现典型的特异性荧光,而未感染细胞孔(P·
V-)不应出现特异性荧光;
标准阴性血清对照、空白对照中感染细胞孔(N·
V+)和未感染细胞孔(N·
V-)均不应出现特异性荧光;
被检血清对照中未感染细胞孔(C·
V-)不应出现特异性荧光。
被检血清样品感染细胞孔(N·
V+)出现特异性胞浆亮绿色荧光判为阳性;
否则,判为阴性。
7间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)
7.1材料准备
7.1.1器材:
96孔平底微量反应板、微量移液器、酶标测定仪、恒温箱、保湿盒等。
7.1.2试剂
7.1.2.1PCV病毒抗原和正常细胞对照抗原,由中国农科院哈尔滨兽医研究所疫病诊断与流行病学中心提供。
使用前,按说明书规定用抗原稀释液稀释至工作浓度。
7.1.2.2兔抗猪IgG辣根过氧化物酶结合物(简称酶标抗体)由中国农科院哈尔滨兽医研究所疫病诊断与流行病学中心提供。
使用前按说明书规定用血清稀释液稀释至工作浓度。
7.1.2.3PCV病毒标准阳性血清和标准阴性血清,由中国农科院哈尔滨兽医研究所疫病诊断与流行病学中心提供。
使用前说明书规定用血清稀释液稀释至工作浓度。
7.1.2.4抗原稀释液、血清稀释液、洗涤液、封闭液、底物溶液、终止液等,依照附录A自行配制。
7.1.3样品:
采集被检猪血液分离血清,血清必须新鲜、透明、不溶血、无污染,密装于灭菌小瓶内,4℃或-30℃冰箱保存或立即送检。
试验前将被检血清统一编号,并用血清稀释液作20倍稀释。
7.2操作方法参照图。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
P
S3
B
C
N
S4
D
E
S1
S5
F
G
S2
S6
H
V
V-为PCV病毒抗原包被列;
C-正常细胞抗原包被列;
P-标准阳性血清对照孔;
N-标准阴性血清对照孔;
S1、S2、S3等一被检血清编号。
图间接ELISA诊断板加样示意图
7.2.1包被抗原:
取96孔平底微量反应,于奇数列加工作浓度的病毒抗原,偶数列加工浓度的对照抗原,每孔100μL(参照图2),封板,置保湿盒内放37℃恒温箱中感作60min,再移置4℃冰箱内过夜。
7.2.2洗板:
弃去板中包被液,加洗涤液洗板,每孔300μL,洗涤3次,每次2min,在吸水纸上轻轻拍干。
7.2.3封闭:
每孔加入封闭液100μL,封板后置保温盒内37℃恒温箱感作2h。
7.2.4洗涤:
方法同7.2.2
7.2.5加血清:
反应板按图2编号后,对号加入已作稀释的被检血清、标准阳性血清和标准阴性血清。
每份血清各加2个病毒抗原孔和2个对照抗原孔,孔位相邻。
每孔加样量均为100μL。
封板,置保湿盒内于37℃恒温箱中感作15min。
7.2.6洗板:
方法同7.2.2。
7.2.7加酶标抗体:
每孔加工作浓度的酶标抗体100μL,封板,放保温盒内置37℃恒温箱中感作2h。
7.2.8洗板:
7.2.9加底物:
每孔加入新配制的底物溶液100μL,封板,在37℃恒温箱中感作30min。
7.2.10加终止液:
每孔添加终止液100μL终止反应。
7.3光密度(OD)值测定与计算
7.3.1OD值测定:
在酶标测定仪上用λ=490nm读取反应板各孔溶液的OD值,记入专用表格。
7.3.2OD值计算
按下式分别计算标准阳性血清、标准阴性血清和被检血清与2个平行抗原孔反应的OD值的平均值。
标准阳性血清(P)与病毒抗原(V)反应的均值P·
V(OD490)按式
(1)计算。
标准阳性血清(P)与对照抗原(C)反应的均值P·
C(OD490)按式
(2)计算。
标准阴性血清(N)与病毒抗原(V)V(OD490)按式(3)计算。
被检血清(S)与病毒抗原(V)反应的均值S.V(OD490)按式(4)计算。
被检血清(S)与对照抗原(C)反应的均值S.C(OD490)按式(5)计算。
P·
V(OD490)=[A1(OD490)+B1(OD490)]/2……………………
(1)
V(OD490)=[A2(OD490)+B2(OD490)]/2……………………
(2)
N·
V(OD490)=[C1(OD490)+D1(OD490)]/2……………………(3)
S·
V(OD490)=[E1(OD490)+E1(OD490)]/2(以S1血清为例)………………(4)
V(OD490)=[E1(OD490)+E1(OD490)]/2(以S1血清为例)………………(5)
S/P=[S·
V(OD490)-S·
C(OD490)]/[P·
V(OD490)-P·
C(OD490)]……(6)
7.3.3按式(6)计算被检血清OD值与标准阳性血清OD值的比值S/P。
7.4结果的判定与解释
7.4.1有效性判定:
V(OD490)与N·
V(OD490)的比值必须大于或等于1.5时,才可进行结果判定.否则,本次试验无效。
7.4.2判定标准与解释
A)
S/P比值小于0.4,判定为PCV病毒抗体阴性,记作间接ELISA
(一).
B)
S/P比值大于或等于0.4,小于1.5,判定为疑似,记作间接ELISA(±
).
C)
S/P比值大于或等于1.5,判定为PCV病毒抗体阳性,记作间接ELISA(+).
间接ELISA(+)者表明被检猪血清中含有PCV病毒抗体.
8免疫组织化学试验(IHC)
8.1材料准备
8.1.1器材:
光学显微镜、湿盒、磁力搅拌器、恒温箱等。
8.1.2试剂
8.1.2.1PCV病毒抗原和正常细胞对照抗原,由中国农科院哈尔滨兽医研究所疫病诊断与流行病学中心提供。
8.1.2.2兔抗猪IgG辣根过氧化物酶结合物(简称酶标抗体)由中国农科院哈尔滨兽医研究疫病诊断与流行病学中心所提供。
8.1.2.3PCV病毒标准阳性血清和标准阴性血清,由中国农科院哈尔滨兽医研究所疫病诊断与流行病学中心提供。
8.1.2.4PBS缓冲液(pH7.2~7.4),0.5mol/LEDTA缓冲液(pH8.0),1mol/L的TBS缓冲液(pH8.0),0.4%胃蛋白酶液,3%甲醇-H2O2溶液,封裱剂。
TBS/PBSpH9.0~9.5。
标准兔抗PCV2特异性阳性血清,过氧化酶标记的羊抗兔二抗。
抗原修复液:
1mM的EDTA缓冲液(pH8.0),它适用于大多数需要抗原热修复的抗体。
8.1.2.5样品:
无菌采集被检猪组织,组织应新鲜、无污染,采后立即放入10%甲醛溶液中,或立即保存于-20℃。
8.2操作方法
8.2.1组织块按常规方法制成石蜡切片。
8.2.2石蜡切片经二甲苯瞬间脱蜡即可。
切片先后浸入95%乙醇、80%乙醇、60%乙醇、40%乙醇水化;
8.2.3浸入PBS洗3次各5分钟;
8.2.41-3%H2O2(80%甲醇配制)滴加在组织切片上,室温静置10分钟;
8.2.5PBS洗3次各5分钟。
8.2.6微波修复抗原;
将片子放入装有抗原修复液的容器中,置微波炉加热至95℃以上,并持续10-15分钟,室温20-30分钟自然晾凉,使蛋白复性。
8.2.7PBS洗3次各5分钟;
8.2.8滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。
甩去多余液体。
8.2.9滴加工作浓度的标准阳性血清50μl,同时设加PBS的对照,室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。
4℃过夜后需在37℃复温45分钟。
8.2.10PBS洗3次各5分钟;
10)滴加工作浓度的二抗40~50μl,室温静置,或37℃1小时。
8.2.11PBS洗3次各5分钟;
8.2.12新配制的DAB显色5~10分钟,在显微镜下掌握染色程度。
8.2.13PBS冲洗5分钟;
蒸馏水冲洗。
8.2.14苏木精复染1-2分钟,流水冲洗,
8.2.15干燥后,无水酒精脱水5min,二甲苯透明5min,加拿大胶封片,镜检。
8.3结果的判定与解释
若为PCV阳性,细胞浆内酶标抗体抗原复合物呈黄褐色,背景呈淡黄色或无色。
PBS对照的切片呈淡黄色或无色,无黄褐色。
9
综合判定
当在临床上怀疑有PMWS感染时,确诊PMWS必须符合以下三个条件:
有相应的临床症状,特征性病理变化,从病灶中检出PCV2抗原或核酸。
根据临床症状和病理变化只可作出初步诊断,猪群中普遍存在PCV2的抗体,单一的抗体阳性不能确诊为阳性。
确诊必须依靠实验室方法检测出病毒的抗原或核酸。
可根据实际情况,由上述五种方法中选用一种或两种方法进行确诊。
附录试剂的配制
A1300mMD(+)氨基葡萄糖用于病毒分离
用37℃预热蒸馏水溶解氨基葡萄糖,加入适当体积(10×
)Hanks平衡盐溶液,0.22um孔过滤。
A210%SDS用于核酸的提取
100gSDS加水到1000ml,加热到68℃助溶,浓盐酸调pH值到7.2。
A33mol/l乙酸钠(pH5.2)用于核酸的提取
408.1g乙酸钠加水到1000ml,用冰乙酸调pH到5.2,高压灭菌。
A4PBS液(0.01mol/LPBS,pH=7.2)用于IFA
氯化钠(NaCl)8.5g;
磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)2.5786g
磷酸二氢钠(NaH2PO4.2H2O)0.4368g;
去离子水加至1000
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