磁性纳米颗粒Fe3O4@SiO2的制备及在全血DNA提取中的应用资料下载.pdf
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该提取方法与传统煮沸裂解法对96份样本进行对照研究,证实其灵敏度有较大提高。
结论利用自制的Fe,O。
SiO,磁性纳米颗粒和合适的缓冲液体系,可成功地提取纯度较高的DNA,通过PCR扩增及对比实验表明,该磁性纳米颗粒及其提取工艺经优化后,可用于传染病的体外分子诊断研究。
关键词:
磁性纳米颗粒;
制备;
乙肝病毒;
核酸提取;
PCR扩增中图分类号:
R4465文献标志码:
A磁性纳米粒子(magneticnanoparticles,MNPs)是一种新型功能材料,具有尺寸较小、比表面积大、表面活性高、生物相容性和流体稳定性好、比饱和磁化强度高及在外磁场作用下快速响应等优良特性,已在生物医学领域中应用广泛j。
本研究应用本实验室制备的Fe,O。
磁性纳米颗粒对全血样本的核酸进行提取,并将该方法与传统的煮沸裂解法的提取效果进行比较,以期为下一步的自动化乙型肝炎病毒分子实验诊断提供实验依据。
1材料与方法11样本来源收集2015年9月2_4日南京市第二医院96例乙型肝炎(简称乙肝)住院患者EDTAK,抗凝全血及血清各l份(无溶血、脂血),男64例,女32例,平均年龄435岁(年龄范围2176岁),诊断符合2000年中华医学会传染病与寄生虫学分会、肝病学分会修订的病毒性肝炎防治方案标准心。
所有标本均清晨抽取静脉血,4保存,收集完毕后集中检测。
12主要试剂与仪器六水合三氯化铁(FeCl,6H:
0)、无水醋酸铵(NH。
Ac)购自国药集团化学试剂公司;
乙二醇、正硅酸乙酯(tetraethylorthosilicate,TEOS)、氨水和无水乙醇等常用化学试剂购于南京化学试剂公司,均为分析纯;
蛋白酶K、DNAmarker、PCR及其他未提及的各种试剂均购自上海生工公司;
GelRedlM核酸荧光染料(美国Biotium公司);
JEM-2100型透射电子显微镜(日本电子公司);
NanoDrop2000超微量紫外可见分光光度计(美国ThermoScientific公司)。
13实验所用溶液的配制131裂解液配制称取1915g盐酸胍(GuHCl)pJ、0185gEDTA、003gNaCl、2mLTritonX一100,ddH20定容至100mL,混匀1。
132结合液称取20gPEG-6000,175gNaCl,ddH:
O定容至100mL。
133清洗液添加70mL无水乙醇,ddH:
134洗脱液称取0121gTris-HCl、004gEDTA,调pH至80,ddH20定容至100mL。
14方法141溶剂热法制备Fe,O。
磁性纳米颗粒及表征称取135gFeCl36H20,向其中加入50mL乙二醇,磁力搅拌使其充分溶解,向混合物中继续加入321g无水乙酸铵,磁力搅拌使其充分溶解H1。
将上述混合物缓慢转移到50mL聚四氟乙烯内衬反应釜中,将反应釜不锈钢外套拧紧后,置于鼓风干燥箱中200反应12h。
待反应结束后,自然冷却至室温后,打开反应釜,将内部所得黑色产物转移至一个洁净烧杯中,借助外加磁场分别用去离子水和无水乙醇清洗产物多次至上清液pH为中性,并最终将产物分散在无水乙醇中,4保存。
取适量充分稀释后的样品利用超声波充分混匀分散后,取一滴样:
f=基金项目:
南京市科技发展计戈tJ(201208038);
南京市医学重点科技发展项目(2KXl2038)。
作者简介:
王念跃,1958年生,男,主任技师,主要从事感染性疾病实验室诊断技术研究工作。
万方数据170临床检验杂志2016年3月第34卷第3期ChinJClinLabSci,Mar2016,V0134,No3品滴在喷有碳膜的铜网上,室温干燥后在透射电子显微镜下(加速电压为200kV)观察Fe,O。
磁性纳米颗粒的大小、形貌。
142Fe,O。
磁性复合颗粒的制备与表征首先将合成的Fe,O。
磁性颗粒(含无水乙醇)加入到三口烧瓶中,磁分离后去上清,然后分别向三口烧瓶中加人120mLH,0和30mL无水乙醇。
将三口烧瓶置于超声波清洗机中超声分散3min,将三口烧瓶固定于恒速搅拌器上,在N:
的保护下,向烧瓶内均匀加入3mL浓氨水和15mLTEOS,机械搅拌反应3h,反应完毕后在外加磁场的作用下,将反应物用ddH:
O清洗至pH为中性,定容至10mgmL,4保存备用。
利用TEM对Fe,O。
进行表征,方法与Fe,O。
磁性颗粒的透射电子显微镜表征方法相同。
143磁珠法全血DNA提取步骤:
(1)细胞裂解。
在15mLEP管中,依次加入100xL全血样本、100止裂解液和20斗L蛋白酶K(10mgmL),涡旋振荡摇匀后,56水浴20min。
(2)磁性颗粒与结合液混合。
取100IxL(10m#mL)Fe,04SiO:
磁性颗粒于新的15mLEP管中,磁力架磁分离1min,弃上清。
向EP管中加人300IxL结合液,涡旋混匀,备用。
(3)吸附DNA。
将步骤
(1)裂解处理的样品加入步骤
(2)的EP管中,涡旋混匀,室温静置5min,磁分离2min后弃上清。
(4)洗涤。
用400txL清洗液清洗(3)中的磁性复合颗粒3次,磁分离弃上清,真空离心浓缩干燥或自然晾干。
(5)洗脱。
向晾干的离心管中加入100IxL的洗脱液,涡旋混匀使颗粒悬浮,置水浴锅中65温育10min,期间摇匀23次,磁分离吸取的上清液即为提取的DNA样本。
实验重复2次。
将提取的核酸样本进行琼脂糖凝胶(10L)电泳,用NanoDrop2000超微量紫外可见分光光度计进行产量和浓度检测。
144煮沸法血清DNA提取在15mLEP管中加100IxL血清和20斗L裂解液(同磁珠法),涡旋混匀,煮沸10min;
5000rmin离心5min,轻轻吸取上清液于另一清洁的离心管中,加入20斗L04mmolLTris-HCl(pH75),4保存备用。
145DNA提取产物的PCR验证分别对磁性颗粒提取法和煮沸裂解法提取的DNA样本进行PCR扩增。
采用Blast和ClustaW软件比对分析,参照HBV的x蛋白编码基因的部分区段并稍作修改,设计一对HBVDNA特异性引物,扩增片段大小约为120bp,正向弓I物序列:
5一ccGTCTGTGcCTTcTCATCTG37,反向弓I物序列:
57一AGTCCAAGAGTTCTCTTATGCAAGACCTY37,由上海生工公司合成。
PCR扩增体系为20止,成分主要包括10Taq酶缓冲液(不含M92+)2IxL,15mmolLMgCl208弘L,250molLdNTPs05灿L,05斗molL上、下游引物各1IxL,模板2斗L和5U&
LTaqDNA聚合酶03止,ddH:
O补足体积。
扩增条件:
95预变性3min;
95变性15s,60退火60S,72oC延伸60S,循环45次;
72延伸7rain;
4oC保存。
扩增产物用16gL琼脂糖凝胶电泳检测。
15实时荧光定量PCR检测HBVDNA磁珠法与煮沸法分别提取的DNA均用同一PCR仪(ABI7500型)平行定量检测HBV载量,扩增条件如145,采用SYBGreen荧光染料进行检测引。
16统计学分析采用SPSS190软件进行。
计数资料的比较采用,检验,一致性验采用Kappa检验进行分析,回归方程采用双变量的线性回归,以P005为差异有统计学意义。
2结果21Fe,O。
磁性颗粒与Fe30。
磁性复合颗粒的表征Fe,O。
磁性颗粒和Fe,O。
磁性复合颗粒的形状均为球形,粒径比较均匀,且分散性比较好。
Fe,O。
磁性颗粒的粒径约为500liB,颗粒中心与外周颜色相同,可判断该颗粒为实心状;
同时发现,颗粒表面呈现有更为精细的结构,该结构是由粒径极小的Fe,O。
磁性纳米颗粒组成。
磁性复合颗粒具有明显的核壳结构,中间黑色区域为实心Fe,O。
磁性颗粒,周围灰色区域为SiO:
壳,厚度为5080am。
整个磁性复合颗粒粒径主要集中在550nm左右。
见图1。
22磁珠法提取DNA结果221磁珠法提取全血DNA经磁珠法提取全血DNA电泳见图2。
由图可知,磁性颗粒提取法所得DNA电泳条带单一,分子量约23000bp,无拖尾现象。
说明提取的样本DNA纯度较高。
222磁珠法提取全血DNA纯度与浓度A260。
们。
值为153,略低于170,说明存在少量蛋白质污染。
本研究磁性颗粒提取的全血DNA样品浓度为15056ng斗L。
万方数据临床检验杂志2016年3Jj第34卷第3期ChillJClinLabSci,Mar2016,V0134,No3AB口图1Fe,O。
磁性颗粒(A)及Fe、O。
Si02磁性复合颗粒(B)的透射电镜表征注:
I,分子量标准;
2、3,磁性颗粒法提取全血的DNA。
图2磁性颗粒法提取全血DNA的凝胶电泳结果223磁珠法提取DNA扩增产物凝胶电泳为体现磁珠法提取全血的核酸效果,将磁珠法提纯后的DNA与传统煮沸法提取后的DNA进行对比,分别进行HBV部分序列的PCR扩增,磁珠法与煮沸法均得到了清晰的目的条带,且符合理论条带120bp长度,两区带的亮度相差不明显。
但煮沸法提取样本的扩增条带中略有拖尾现象,而磁珠法所得DNA样品的扩增条带较单一,无拖尾。
见图3。
23两种DNA提取方法检测结果比较96例乙肝患者全血与血清样本分别用磁珠法和煮沸法提取DNA后,经荧光定量PCR法检测,结果显示HBVDNA均阳性37例(385),均阴性52例(542),7例磁珠法检测结果阳性、而煮沸法检测结果为阴性(73)。
经统计学分析差异有统计学意义(=719,P005)。
见表1。
171注:
1,分子量标准;
2,煮沸法提取血清DNA的扩增条带;
3,磁珠法提取全血DNA的扩增条带。
图3煮沸法和磁珠法提取样本DNA的PCR结果表1两种DNA提取方法检测结果比较3讨论由于操作简单,血清煮沸裂解提取核酸后用于HBVDNA扩增检测的方法仍在大部分实验室应用,但较低的扩增效率使其检测灵敏度、准确性均有所降低,特别对低拷贝HBVDNA样本,往往提供给临床的可能是一个假阴性报告,这对临床乙肝病毒感染诊断及疗效判断带来较大误差。
本研究初步建立了一种稳定的磁性颗粒全血提取法,提取出纯度高、产率高、重复性好、完整的全血DNA样本。
姚娟等【7o用NaI裂解法提取全血DNA获得成功,但手续繁杂,不适合常规开展。
而煮沸法与磁性纳米颗粒提取法相比,有一定的差异,其原因可能是由于血清样本的复杂成分,虽经煮沸并高速离心沉淀,上清中仍可含有少量可溶性抑制扩增检测的成分如蛋白质、肝素及微量血红蛋白等,因此,抑制了扩增效率1。
而磁珠法提取全血DNA时,因磁性颗粒吸附法通过颗粒的高比表面积对核酸分子进行吸附,并通过多次清洗,可较彻底地去除可溶性抑制扩增检测的成分。
因此,抑制扩增的杂质成分去除较为完全。
目前,采用传统的血清标本仅可检测血清中的HBVDNA含量,而对存在于白细胞内的HBV却不能检出。
而乙肝患者特别是静止型慢性肝炎患者,其血液中HBV含量极微,由于病毒的寄生性强,在外周血中的HBV可能部分寄生于有核细胞中9。
10|。
因此,这样也会导致一些HBV健康携带者其血清中HBVDNA大都呈阴性的原因之一。
而直接从全血万方数据172临床检验杂志2016年3月第34卷第3期ChinJClinLabSci,Mar2016,V0134,No3样品中进行核酸样本提取,可使寄生于有核细胞内的HBV分子同时释放出HBVDNA。
因此,用全血提取核酸检测HBVDNA较血清来说更能反映病毒的实际浓度。
本研究通过96例乙肝患者DNA定性分析,初步得出全血磁珠法阳性率高于血清煮沸法,但未进行定量分析研究,下一步将在此基础上进一步完善优化全血提取方案,并进行定量分析研究。
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4041(收稿日期:
2015-09-22)(本文编辑:
周万青,陈维忠)读者作者编者作者更正由于作者疏忽,ll占床检验杂志2016年第34卷第2期非小细胞肺癌患者血清中MALATl表达水平及其临床意义一文中的基金项目改为:
中南大学硕士生自主探索创新项目(2016zzts501);
湖南省教育厅科学研究项目(15C0145);
湖南省自然科学基金(2015JJ4073)。
临床检验杂志编辑部万方数据
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