蛋白质印迹手册资料下载.pdf
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处理体积100mL,直径33mm规格系列最常用(cat#SLHV033RB等)Sterifip过滤器:
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多种孔径/直径可供选择Ultrafree系列离心微滤管:
处理体积0.5或2mL,提供预除菌形式包装疏水性DuraporePVDF膜及疏水性FluoroporePTFE膜气体过滤,在线传感器保护Millex针头式过滤器:
多种孔径/直径/接头可供选择玻璃纤维膜预过滤Millex针头式过滤器:
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多种孔径可供选择超滤蛋白/核酸/病毒的浓缩、除盐、缓冲液置换再生纤维素膜超低蛋白吸附超滤膜AmiconUltra系列超滤管(cat#UFC901096等)AmiconPro纯化超滤管:
1mg以内蛋白样品操作新标准工具新!
D-tube系列透析管:
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法医刑侦专用CentriconPlus-70系列超滤管:
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3-400mL高浓度样品温和浓缩,可换膜PES超滤膜孔结构松弛,适合浓度/粘度高的样品StirredCell系列超滤杯:
3-400mL高浓度样品温和浓缩,可换膜细胞培养表面三维生长,细胞运动,结合物分析PET(聚乙烯对苯二酸酯)膜:
用于贴壁细胞的生长,无需胞外基质MillicellPET悬挂式细胞培养小室(cat#PIHT12R48,cat#PIRP12R48,cat#PIEP12R48)亲水性IsoporePCF(聚碳酸酯)膜:
用于贴壁细胞的生长,无需胞外基质Millicell站立式细胞培养小室(cat#PIHP01250,PI8P01250)Millicell24孔培养板(cat#PSHT010R5)亲水BioporePTFE(聚四氟乙烯):
低蛋白吸附、可进行活细胞观察以及免疫荧光等应用Millicell站立式细胞培养小室(cat#PICM03050,PICM01250,器官型PICM0RG50)高通量分析小体积、多样品操作疏水性PVDF膜蛋白吸附最好的膜,细胞因子高灵敏检测首选MultiScreen96孔板或8链条:
用于亲和素-生物素相关分析、DNA结合蛋白分析、效应作用分析、蛋白互作分析等,是业界公认的ELISpot专用板(cat#MSIPS4510,M8IPS4510)亲水性PVDF膜蛋白结合最低的膜MultiScreen96孔板:
用于完整细胞/细胞部分受体结合分析,蛋白激酶/磷酸酶沉淀分析,珠子/树脂形式分析,新生儿(苯丙酮尿症)筛查(cat#MSHVN4550)MultiScreen96孔板:
通过临床诊断应用验证,用于蛋白激酶/磷酸酶分析、样品制备、末端染料去除(测序用)(cat#MAHVN4550)亲水性PTFE膜MultiScreen96孔板:
用于天然产物筛选,可溶性分析,总药物分析(cat#MSRLN0410)PCF膜Millicell96孔板:
用于Caco-2细胞培养及细胞水平分析,包括细胞渗透性/粘附/培养/分化/药物转运等(cat#PSHT004S5)再生纤维素膜MultiScreen96孔板:
用于蛋白浓缩、除盐、缓冲液置换(cat#MAUF01010)其它膜MultiScreen96孔或384孔板:
用于纯化PCR产物、去除dNTPs和引物(cat#LSKMPCR10)印迹研究对生物大分子有卓越的吸附能力疏水性PVDF转印膜蛋白载量最大的膜Immobilon-P0.45m最常用的WB转印膜(cat#IPVH00010)Immobilon-PSQ0.2m小分子蛋白/肽WB转印膜(cat#ISEQ00010)Immobilon-FL0.45m背景最低的荧光检测专用转印膜(cat#IPFL00010)硝酸纤维素(NC)转印膜Immobilon-NC0.45m传统WB常用转印膜(cat#HATF00010)更好的膜,更好的印迹。
关于第六版1.SouthernE.JMolBio1975;
98:
503.随着蛋白印迹手册第六版的出版,默克密理博公司一如既往地协助研究人员紧跟蛋白检测的前沿进展。
我们在优化抗体浓度和降低背景方面增加了更全面的建议,同时扩展了荧光检测的数据和操作步骤。
这本手册代表了我们应用科学家的集体经验和智慧正是他们一直积极参与推进蛋白印迹和检测技术。
这本手册也包含了我们技术服务专家团队所提供的许多最常见的建议,世界各地的科学家常常联系他们寻求帮助。
近四十年来,默克密理博一直是转印膜的领先供应商。
1975年,E.M.Southern使用这些膜首次创建了从琼脂糖凝胶上转移核酸1。
第一款用于Western印迹的0.45m-PVDF基质,Immobilon-P膜,在1985年面市,而第一款用于蛋白印迹和测序的0.2m-PVDF基质,Immobilon-PSQ膜,在1988年面市。
除了Immobilon膜和试剂,默克密理博还为蛋白研究提供了广泛的其它工具,包括温和高效的蛋白提取试剂盒,通过PureProteome磁珠快速分离蛋白,以及通过Amicon-Ultra离心超滤管高效浓缩除盐。
从何处获得更多信息如果您有问题或需要协助,请联系默克密理博的技术服务专家团队:
电话:
400-889-1988-2分机邮箱:
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目录蛋白印迹技术简介31膜的选择4ImmobilonPVDF转印膜2蛋白结合10Immobilon-P还是Immobilon-PSQ转印膜?
影响蛋白结合的因素3印迹方法:
原理与优化11过滤11Western印迹12在1-D或2-D凝胶上分离复杂的蛋白混合物分子量标准品聚丙烯酰胺的浓度凝胶电泳缓冲液蛋白从凝胶转移到膜上电转印技术转印缓冲液甲醇在转印缓冲液中的功能影响蛋白成功转移的因素SDS的存在电流和转印时间转印缓冲液的pH值平衡时间建立一种新的转印操作尝试建立蛋白鉴定的膜用于染色和免疫检测通过透照法观察和快速免疫检测保存透照染色可逆染料不可逆染料缓冲液封闭抗体清洗间接印迹检测底物蛋白观察4蛋白鉴定23免疫检测23标准或快速免疫检测步骤影响免疫检测的因素多轮杂交ImmobilonPVDF转印膜质谱分析29利用ImmobilonPVDF转印膜进行质谱分析1显色检测化学发光检测荧光检测2目录(续)5操作311蛋白转印的操作321.1电转印:
槽转印1.2电转印:
半干转印1.3斑点印迹/狭缝印迹:
真空过滤法1.4Spot印迹:
手工点样法1.5封闭试剂的优化1.6膜干燥方法1.7创新方法:
间接印迹以避免二抗的非特异性结合2蛋白观察的操作412.1通过透照法观察2.2通过可逆染色观察丽春红CPTS(酞菁铜四磺酸)2.3通过不可逆染色观察考马斯亮蓝R染料氨基黑3免疫检测的操作443.1标准的免疫检测方法3.2快速的免疫检测方法3.3利用SNAPi.d.2.0系统进行快速的免疫检测3.4高盐溶液清洗以去除顽固的背景4剥离膜上抗体的操作514.1通过加热和去污剂剥离4.2通过低pH条件剥离4.3利用ReBlotPlusWesternBlotRecyclingKit剥离5蛋白消化的操作535.1消化膜上蛋白以便进行质谱分析6印迹膜保存的操作经验之谈:
从容应对高难度WesternBlotting实例分析与建议专家之选WesternBlotting常用工具546.1印迹膜制备以便长期保存6常见问题与改善建议55词汇表参考文献专利7附录66666874简介3自1979年被建立以来(Towbin等,1979)蛋白印迹已成为研究型实验室的一种常规方法。
它通常用于检测复杂样品中的少量目的蛋白,或监控蛋白表达与纯化。
最简单的蛋白印迹操作被称为斑点印迹或狭缝印迹,是用真空抽滤将蛋白转移到一块微孔膜上。
尽管这种方法可提供蛋白整体表达水平的定量信息,并可以平行开展多个样品的检测,但它缺乏蛋白分子量的信息。
同时特异性也会受影响,因为蛋白降解产物或翻译后修饰的异构体也能随着完整蛋白一起被检测。
Western印迹是一种更为复杂的操作,它包含通过凝胶电泳来分离蛋白混和物,随后电转移到适当的膜(如PVDF)上。
在蛋白转移至PVDF膜后,它们可被染色以便观察,也可直接通过N端测序、质谱分析或免疫检测来鉴定。
免疫检测是通过蛋白与特异抗体的反应来鉴定这种蛋白。
通过空间分辨,这种方法能够提供各个蛋白的分子量信息,并能区分异构体、选择性加工产物及其它的翻译后修饰形式。
在临床实验室,免疫印迹已在传染病和自身免疫性疾病、过敏及其它领域被证明是非常有用的(Towbin等,1989;
Stahl等,2000)。
Western印迹被公认是在病毒感染过程中,配合ELISA共同诊断的一种可靠的临床检测方法,也是一种灵敏、明确而简单的分析,可提供内涵丰富的信息(Bauer,2001;
Mylonakis等,2000;
Heermann等,1988)。
Western印迹的应用实例包括通过定量Western分析来分析酵母中的蛋白表达(Ghaemmadami等,2003),蛋白拷贝数和亚细胞器分布(compart-mentalization)的鉴别(Rudolph等,1999),ATP竞争性蛋白激酶抑制的研究(Wang和Thompson,2001),以及作物和食品中转基因生物的检测(Ahmed,2002)等。
蛋白印迹一直以来都是探索性研究的理想平台,也依然是评估新抗体及其它蛋白检测分析方法(如ELISA、基于磁珠的分析、流式细胞分析和免疫组化)的标准。
然而,同时分析更多蛋白以鉴定复杂的蛋白互作网络的需求,以及保留珍贵样品的相关需求,也一直在推动印迹技术在灵敏度和操作便利性等方面不断改进。
例如创新的“间接印迹(double-blotting)”方法(Lasne,2001,2003),可消除由印迹蛋白与无关二抗之间强的非特异性相互作用造成的假阳性。
Far-Western印迹技术可实现蛋白间特异相互作用的检测(Grasser,1993),而Southwestern印迹被用于鉴定与特定DNA序列相互作用的蛋白(Silva,1987)。
MultistripWestern印迹被证明能提高通量,同时最大限度减少印迹间的可变性(Aksamitiene,2007)。
新一代印迹技术的特点是产生信号所需的蛋白减少(Swank,2006),以及改善Western印迹的定量能力(Schilling,2005a;
2005b)等。
4根据膜材质的特性选择转印膜,涉及以下几方面的考虑:
膜的选择1蛋白结合能力是否需要用醇预湿开展多次剥离(stripping)和再次检测(reprobing)实验的能力蛋白观察长期印迹保存信噪比聚偏二氟乙烯(PVDF)和硝酸纤维素(NC)是Western印迹应用中最常用的两种类型的膜。
与硝酸纤维素膜相比,电转到PVDF膜上有许多优点。
PVDF膜可提供更好的蛋白截留率、物理强度和广泛的化学兼容性(Pluskal等,1986)。
其中更高的机械强度和出色的耐化学性使PVDF膜成为免疫检测中各种染色应用和多次检测的理想选择。
使用PVDF膜的另一个优点是,从单块凝胶上转移的平行重复泳道可用于后续各种应用,如考马斯蓝染色,接着切割条带进行N端测序,蛋白水解/肽段分离/内部测序,以及免疫检测(Kurien等,2003)。
市售的硝酸纤维素膜的典型结合能力是80100g/cm2,而PVDF膜的结合能力是100200g/cm2。
在检测血清中人免疫缺陷病毒(HIV)抗原的实验中,平行比较PVDF和硝酸纤维素膜的使用效果,结果表明PVDF膜有更好的总体截留率,并且有助于改善抗体对糖基化包膜抗原的检测(Lauritzen和Pluskal,1998)。
硝酸纤维素膜和PVDF膜的特性比较详见表1。
特性/应用硝酸纤维素PVDF物理强度差好蛋白结合能力80100g/cm2100300g/cm2耐溶剂性否是Western转移是是总蛋白染色胶体金胶体金丽春红丽春红氨基黑氨基黑印度墨汁印度墨汁Sypro印迹染料考马斯蓝染料检测显色显色化学发光化学发光荧光荧光放射性化学荧光放射性间接印迹方法否是快速免疫检测否是Western再次杂交否是Edman测序否是氨基酸分析是是SDS存在下的结合差好膜上消化或质谱分析否是直接MALDI-TOFMS分析否是数据可存档否是表1.PVDF和硝酸纤维素转移膜特性及应用的比较5有了Millipore的创造性贡献,我们现在有了最好的WesternBlotting1975年,Dr.Southern使用MerckMillipore的硝酸纤维素膜发明了SouthernBlotting技术1979年,Dr.Towbin使用MerckMillipore的硝酸纤维素膜发明了WesternBlotting技术1985年,MerckMillipore发明了世界上第一张0.45mPVD膜(Immobilon-P)1988年,MerckMillipore发明了世界上第一张0.2mPVD膜(Immobilon-PSQ),提高小分子蛋白检测效率再后来,MerckMillipore上市了世界上第一张0.45m荧光检测专用PVD膜(Immobilon-FL)现在Immobilon成为转印膜的代名词,在实验室中支持您获得每一次WB检测的成功(*2010年默克集团成功收购Millipore)6默克密理博提供三种PVDF膜:
ImmobilonPVDF转印膜Immobilon-P膜(0.45m)是一种通用的基质,适用于一般的免疫印迹应用。
Immobilon-PSQ膜(0.2m)适用于蛋白测序和低分子量蛋白的免疫印迹。
它有着更高的蛋白结合能力以及比0.45m膜更高的截留率。
Immobilon-FL膜(0.45m)是为荧光免疫检测而开发的。
它在多种激发和发射波长范围内的荧光背景都极低。
Immobilon转印膜以卷膜和方片膜形式提供。
预切好的膜与所有预制胶以及大部分市售的凝胶电泳系统兼容。
Immobilon转印膜的性质详见表2。
表3列出了与最常用的电泳系统相匹配的Immobilon预切膜的尺寸。
表4列出了与现有的预制胶相匹配的Immobilon预切膜的尺寸。
7Sypro印迹染料Sypro印迹染料Immobilon-P转印膜Immobilon-PSQ转印膜Immobilon-FL转印膜描述成分PVDFPVDFPVDF孔径大小0.45m0.2m0.45m疏水性疏水疏水低分子量疏水应用Western印迹Western印迹Western印迹结合分析斑点/狭缝印迹斑点/狭缝印迹氨基酸分析氨基酸分析荧光免疫检测N端蛋白测序N端蛋白测序质谱分析糖蛋白观察脂多糖分析质谱分析检测方法显色显色荧光(最推荐)显色荧光化学荧光化学荧光化学发光化学发光化学荧光化学发光放射性放射性蛋白结合能力胰岛素:
160g/cm2胰岛素:
262g/cm2胰岛素:
155g/cm2BSA:
215g/cm2BSA:
340g/cm2BSA:
205g/cm2山羊IgG:
294g/cm2山羊IgG:
448g/cm2山羊IgG:
300g/cm2兼容的可逆染料透射法透射法透射法丽春红丽春红丽春红CPTSCPTSCPTS甲苯胺蓝甲苯胺蓝Sypro印迹染料兼容的不可逆染料考马斯亮蓝考马斯亮蓝考马斯亮蓝氨基黑氨基黑氨基黑印度墨汁印度墨汁ColloidalgoldColloidalgold表2.常用ImmobilonPVDF转印膜的特点和应用适合从各种凝胶基质上转移蛋白的高效结合孔结构均一,特别适合分子量20kDa蛋白的高灵敏度检测应使用Immobilon-P转印膜,但如果分析较小的蛋白,或必须捕获100%的蛋白进行肽段测序,则首选Immobilon-PSQ转印膜。
113滤纸转印膜转印方向图2.过滤印迹系统在制备过滤法印迹时,请注意以下方面:
印迹方法:
原理与优化过滤(抽滤)过滤是将蛋白上样到膜上的直接方法。
一个溶解的样品可以通过抽真空而滤过膜。
蛋白吸附到膜上,而样品的其它组分则穿过膜(图2)。
或者将样品直接点在膜表面上,并让其干燥。
固定在膜上的蛋白随后可用于分析。
斑点印迹(图3)和狭缝印迹是过滤方法的两种形式,它们采用多联岐管装置(manifold),将样品以斑点状或狭缝状上样到膜上。
这些技术被作为快速筛选大量样品的定性方法,或分析相似样品的定量技术。
它们在测试实验设计参数是否适用于更复杂分析时特别有用。
过滤方法的另一个形式是网格免疫印迹。
当样品量非常有限而无法用ELISA等传统技术来开展分析时,这种技术很有用,适合高度平行的样品分析。
例如,网格免疫印迹已用于过敏原特异的抗体应答鉴定,只需要极少量的患者血清即可完成分析(Reese等,2001)。
去污剂会抑制蛋白吸附到膜上。
样品溶解和清洗所用的缓冲液中的去污剂应不超过0.05%,且只在需要时添加。
样品量应足够大,以覆盖每孔中暴露的膜,但又不能超过膜的结合能力。
富含颗粒的样品可能会堵塞膜,而那些高粘度的样品会降低流速。
颗粒应通过预过滤或离心来去除,并只将上清上样到膜上。
粘稠的样品应用缓冲液稀释。
图3.采用ImmobilonWestern化学发光HRP底物在人血清的斑点印迹上检测转铁蛋白(详见操作步骤1.4斑点印迹)。
山羊抗转铁蛋白抗体(稀释度1:
10,0000)和兔抗山羊HRP结合的二抗(稀释度1:
50,000),在Immobilon-P膜上检测连续稀释血清中的转铁蛋白,重复两次。
12Western印迹包含下列步骤:
一个成功的Western印迹必须满足四个要求:
在1-D或2-D凝胶上分离复杂的蛋白混合物Western印迹在聚丙烯酰胺凝胶上分离一个复杂的蛋白样品。
将分离好的蛋白转移到膜上。
膜上特定蛋白的鉴定。
从凝胶上洗脱在转移过程中蛋白必须从凝胶上洗脱。
如果它仍保留在凝胶上,则无法开展印迹分析。
吸附到膜上在转移过程中蛋白必须吸附到膜上。
如果蛋白不吸附,则无法开展印迹分析。
处理过程中的蛋白截留在转移后的印迹膜处理过程中蛋白必须仍然吸附在膜上。
处理过程中蛋白的可及性吸附的蛋白必须能与检测它的化学试剂接触。
如果蛋白被掩蔽,那它就无法被检测。
在印迹之前分离复杂蛋白混合物最常用的方法是一维(1-D)十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),其中蛋白是根据其分子量分离的(图4)。
在某些情况下也使用非变性条件来分离天然蛋白。
尽管这种方法通常不及变性电泳的分辨率,但是在一抗只识别非变性蛋白或必须在膜上保留蛋白的生物活性时,非变性电泳特别有用。
二维(2-D)凝胶电泳是分析细胞类型、组织和体液中蛋白组成的理想技术,也是蛋白组学的核心技术。
2-D凝胶的免疫印迹提供了分子量和等电点的信息,在区分翻译后修饰所产生的蛋白异构体上很有用(Celis和Gromov,2000)。
在某些情况下,通过等电聚焦的一维分离后的免疫印迹可实现蛋白分型(Poland等,2002;
Eto等,1990)。
二维印迹的例子如图5所示。
下列章节将讨论Western印迹中所涉及操作的理论和实际经验。
13分子量标准品图4.图5.A未染色胶的Western转印膜(半预染marker)BAPWestern(AP偶联S-蛋白)的显色反应CAPWestern(AP偶联S-蛋白)的化学发光检测100ABC225225kDakDakDa150100755035251515010075503525151615凝胶中包含分子量(MW)标准品,即marker,有助于在电泳分离后估计感兴趣的蛋白的大小。
目前有两种类型的标准品,未染和预染。
未染的MWmarker通常包含已纯化的、分子量已知的天然或重组蛋白。
观察它们在凝胶或膜上的定位需要借助一个染色步骤。
预染的MW-marker如图4所示。
使用预染marker既有优点也有缺点。
但预染marker可实现在电泳过程中监控凝胶上的蛋白分离。
它们也能指示后续转印步骤中的转移效率。
但预染marker相对较贵,且染料的添加可能影响蛋白迁移率。
在确定分子量时,预染marker也没那么准确,因为蛋白上结合的染料会改变印迹过程中它们吸附到膜上的能力。
TrailMix蛋白标准品(目录号70982)上带有三个预染marker和八个未染marker(它们都带有HisTag和STag),实现了电泳过程中蛋
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