荧光定量PCR实验指南一.docx
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荧光定量PCR实验指南一.docx
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荧光定量PCR实验指南一
荧光定量PCR实验指南(一■)
基本步骤:
引物、探针的设计;
引物探针的合成;
反应体系的配制;
反应条件的设定;
反应体系和条件的优化;
荧光曲线和数据分析;
标准品的制备;
技术关键:
目的基因(DNA和mRNA
)的查找和比对;
从http:
//www.ncbi.nim.nih.gov/
网点的genbank中下载所需要的序列。
下载的方式有两
DNAstar软件中的Editseq
种:
一为打开某个序列后,直接点击“save”,保存格式为“.txt”文件。
保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。
然后,再打开软件,点击“file”菜单中的“import”,打开后点击“save”,保存为“.seq”文件。
另
一种直接用DNAstar软件中的Editseq软件,点击“file”菜单中的“openentrezsequenee",导入后保存为“.seq”文件,保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、
序列的注册号。
然后要对所有的序列进行排序。
用DNAstar软件中的Seqman软件,点击
"sequenee”菜单中的“add”,选择要比较的“.seq”的所有文件,点击“add”或“add
all”,然后点击“Done”导入要比较的序列,再点击“assemble”进行比较。
横线的上
列为一致性序列,所有红色的碱基是不同的序列,一致的序列用黑色碱基表示。
有时要设定
"minimummathpercentage"默认设置为80,可调低即可。
再选择几个组,点击"contig”
菜单下的“reassemblecontig”即可。
选择高低的原则是在保证所分析的序列在一个
"contig”内的前提下,尽量提高“minimummathpercentage”的值。
有时因此个别
析时,主要是观察是否全部为一致性的黑色或红色,对于弥散性的红色是不可用的。
2、引物和探针设计
2.1引物设计
细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。
理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列
个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点:
序列选取应在基因的保守区段;
扩增片段长度根据技术的不同有所分别:
sybrgreenI技术对片段长度没有特殊要求;
避免引物自身形成环状发卡结构;
非目的序列位点的可能性。
但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。
较长的序列可能会与错误配对序列杂交,降低了特异性,而且比短序列杂交慢,从而降低了产量。
Tm值在55—65C,GC含量在40%—60%;
引物之间的TM相差避免超过2C;
引物的3'端避免使用碱基A;
引物的3'端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基。
为避免基因组的扩增,引物设计最好能跨两个外显子。
2.2Taqman探针设计一般设计原则:
探针位置尽可能地靠近上游引物;
探针长度通常在25—35bP,Tm值在65—70C,通常比引物TM高5—10C,GC含量在40%—70%。
探针的5'端应避免使用碱基G。
整条探针中,碱基C的含量要明显高于G的含量。
异性互补区,建议重新设计引物探针。
(WWW.ncbi.nim.nih.gov/BLAST)2.3TaqmanMGB探针设计介绍
MGB探针的优点:
MGB探针较短(14-20bP),更容易找到所有排序序列的较短片段的保守区。
短片段探针(14-20bp)加上MGB后,Tm值将提高10C,更容易达到荧光探针Tm值的要求。
MGB探针的设计原则
G碱基仍可
探针的5'端避免出现G,即使探针水解为单个碱基,与报告基团相相连的淬灭基团的荧光信号。
用primerexpress软件评价Tm值,Tm值应为65-67C。
尽量避免出现重复的碱基,尤其是G碱基,应避免出现4个或4个以上的G重复出现。
原则上MGB探针只要有一个碱基突变,MGB探针就会检测到(MGB探针将不会与目的
片段杂交,不产生荧光信号)。
因此,在进行SNP检测时,为了检测到突变子,即Taqman
MGB不与目的片段杂交,不产生荧光信号,探针目的片段产生荧光信号检测将探针的突变
位点尽量放在中间1/3的地方。
注意:
为了满足上述要求的4个条件,探针的突变位点可
向3'端移动,但突变位点至少在离3'端2个碱基的前方(即必须确保探针的后两个碱基是绝对的保守),以进行SNP检测。
反过来,若要进行同类检测,找的是保守片段区,探针
中不应有突变位点。
若探针即便是只有13个bp,探针仍不完全保守。
有几个突变,突变位点也应靠近探针的5'端,这样,即便是突变,探针也可与目的片段杂交,产生荧光信号。
另一种方法是设计简并探针,也可达到即使是突变,仍可检测到突变。
2.4实时多重PCR探针的选择:
多重实时PCR的多种含意有两种:
一为选择保守的探针和引物,利用不同的染料标记探针,
目的片段,反应中加入SYBRN染料,最后根据不同目的片段的Tm值来判定不同的物品。
多重实时PCR的荧光探针应为同一类型:
如同时为Taqman探针、或同时为MGB探针、或同时为Beacon探针。
在多重PCR中,多重PCR的各个引物之间相互干扰和各个探针之间相互干扰分析
设计好各对引物和探针后,重新在用DNAstar软件中的Primerselect软件,打开保守在同一文件中的多重PCR的引物文件,然后两两分别选中所设计的多重引物或两两分别选中所
设计的多重探针后,在"report”菜单下“primerpairdimers”,分析上下游引物的dimers。
弹出的窗口中就告诉此对引物有多少个dimer,并对此对引物用dG值进行评价(通常给出
最差的dG值,理论上是dG值越大越好)。
3、影响PCR及荧光PCR的其他因素
引物的设计和选择符合荧光PCR的探针并进行设计对于实时荧光PCR尤其重要。
可以说,
光PCR的因素非常多,下面择其重要进行介绍。
3.1引物退火温度
引物的一个重要参数是熔解温度(Tm)。
这是当50%的引物和互补序列表现为双链DNA
分子时的温度。
Tm对于设定PCR退火温度是必需的。
在理想状态下,退火温度足够低,
以保证引物同目的序列有效退火,同时还要足够高,以减少非特异性结合。
合理的退火温度
从55C到70C。
退火温度一般设定比引物的Tm低5C。
设定Tm有几种公式。
确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。
大部分计算机程序使用近
始的退火温度,以2C为增量,逐步提高退火温度。
较高的退火温度会减少引物二聚体和非
物Tm不同,将退火温度设定为比最低的Tm低5C。
或者为了提高特异性,可以在根据较
高Tm设计的退火温度先进行5个循环,然后再根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循
环。
这使得在较为严谨的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
3.2引物浓度
非特异性产物扩增。
为了确定引物浓度,可以在260nm(OD260)测量光密度值。
然后使
用光吸收值和微摩消光系数的倒数(nmol/OD),通过Beers法则(公式1)计算引物浓
度。
微摩消光系数可以使用公式2计算。
与大分子双链DNA可以使用平均消光系数不同,
oligo软件上可以计算出引物的的消光系数(OD/umol)和消光系数的倒数(umol/OD)。
般商业合成的引物以O.D.值表示量的多少,在一般情况下,20个碱基长的引物,1个O.D.
加100ul水后引物浓度为50pmol/ul(50UM)。
也可以用OLIGO软件,根据引物的的消光系数(OD/mol),计算出一定的工作浓度下,弓I物的加水量。
浓度(UM)=A260(OD/ml)乂稀释系数X消光系数的倒数(nmol/OD)举例:
计算某寡核苷酸(溶于1ml水中),取其中的10讪稀释100倍(加入990讪)水中。
在A260处测吸光度为0.2。
计算消光系数的倒数为4.8nmol/OD,代入得:
浓度=0.2(OD/ml)X100X4.8(nmol/OD)=96nmol/ml=96凶
3.3引物、探针的纯度和稳定性
部分应用需要纯化,以除去在合成过
定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。
循环都可能失败。
较长的引物,尤其是大于50个碱基,截断序列的比例很大,可能需要纯
化。
引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。
定制引物以干粉形式运输。
最好在引物,使其最终浓度为100uM。
也可以用双蒸水溶解。
引物的稳定性依赖于储存条件。
应将干粉和溶解的引物储存在-20C。
以大于10uM浓度溶于TE的引物在-20C可以稳定保存6个月,但在室温(15C到30C)仅能保存不到1周。
干粉引物可以在-20C保存至少1年,在室温(15C到30C)最多可以保存2个月。
探针即寡核苷酸进行荧光基团的标记,标记本身有效率的区别。
探针标记以后一般应该纯化,
公司探针标记效率和纯度有很大的区别。
作为工作浓度分装多支,避光保存。
3.4热启动
性产物一旦形成,就会被有效扩增。
在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时,
如定点突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作,热启动PCR尤为有效。
扩增。
尤其是对高通量应用。
其他的热
TaqDNA聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐,
启动方法使用蜡防护层将一种基本成分,如镁离子或酶,包裹起来,或者将反应成分,如模板和缓冲液,物理地隔离开。
在热循环时,因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。
Transitor?
HotStart
象手动热启动方法一样,蜡防护层法比较烦琐,易于污染,不适用于于高通量应用。
Transitor?
HotStartTaq酶对于自动热启动PCR来说高效可靠。
Taq是在常规Taq酶的基础上进行了化学修饰,使得该酶在低温或常温下没有酶活,因此
在加样至PCR扩增前,不会产生由于引物随机粘连而形成的非特异性扩增。
高温条件下,
化学修饰集团会被剪切,从而释放酶活。
此外,随着PCR扩增的进行,酶活会被逐步释放,
有效提高扩增效率及产物量。
Transitor?
HotStartTaqDNA聚合酶在变性步骤的95C保
温过程中要持续20分钟才会被释放到反应中,从而完全恢复聚合酶活性。
3.5镁离子浓度
镁离子影响PCR的多个方面,如DNA聚合酶的活性,这会影响产量;再如引物退火,这
会影响特异性。
dNTP和模板同镁离子结合,降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。
最佳
使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液(普通PCR是1.5mM)。
较高的游离镁离子
浓度可以增加产量,但也会增加非特异性扩增,降低忠实性。
为了确定最佳浓度,普通PCR
从1mM到3mM,以0.5mM递增,进行镁离子滴定。
为减少对镁离子优化的依赖,可以
使用Transitor?
HotStartTaq酶。
Transitor?
HotStartTaqDNA聚合酶能够在比一般
的TaqDNA聚合酶更广的镁离子浓度范围内保持功能,因此仅需较少的优化。
3.6模板质量
板质量,以增加PCR反应的成功率。
3.7模板浓度
于3X104到3X105个分子,足以检测到单拷贝基因的PCR产物。
质粒DNA比较小,因
此加入到PCR中的DNA的量是pg级的。
对于一般的检测样品,10—100ng的量就足够
检测了。
当然对模板做一个梯度稀释,对于定量PCR而言是非常容易,且能分析扩增效率。
表1.基因组大小和分子数目的比例
for-10人5Molecules
E.coli4.7X10A61.8XlO^g0.001
Arabidopsisthaliana7.0X10^71.3X10^70.01
Homosapiens2.8X10^93.2X10^51.0
Xenopuslaevis2.9X10^93.1X10^51.0
1.0Musmusculus3.3X10^92.7X10^51.0
Zeamays1.5X10^106.0X10^42.0
3.8防止残余(Carry-over)污染
PCR易受污染的影响,因为它是一种敏感的扩增技术。
小量的外源DNA污染可以与目的模
会发生共同来源的污染。
这称
板一块被扩增。
当前一次扩增产物用来进行新的扩增反应时,
之为残余污染。
从其他样品中纯化的DNA或克隆的DNA也会是污染源(非残余污染)。
可以在PCR过程中使用良好的实验步骤减少残余污染。
使用带滤芯的移液管可以阻止气雾
剂进入eppendorf管内。
为PCR样品配制和扩增后分析设计隔离的区域,在准备新反应前更换手套。
总是使用不含有模板的阴性对照检测污染。
使用预先混合的反应成分,而不是每个反应的每个试剂单独加入。
一种防止残余污染的方法是使用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)。
这种酶(也称为尿嘧啶-N-糖基化酶或UNG)移除DNA中的尿嘧啶。
在扩增过程中将脱氧尿嘧啶替换为胸腺嘧啶使
得可以把前面的扩增产物同模板
DNA区分开来。
因为前面的扩增产物对UDG敏感,所有
荧光定量PCR实验指南
(二)
影响PCR的因素如此之多,您有时很难区分是什么导致您的实验结果不佳。
降低实验的不稳定因素是使用优质可靠的产品。
使用优质、性能可靠的热启动酶、优质的dNTP、Mg离子、UNG/dUTP防污染系统预混成的定量PCR试剂体系,最大程度的降低了反应变量,提高了实验的可重复性和可靠性。
您还需要进行以下步骤的准备:
设计引物和探针、合成引物和探针、正确储藏、得到高质量的模板,随后,您仅需要进行退火温度的优化,就能得到好的实验结果。
FQPCRMASTERMix-UDG(hotstart)同竞争对手的定量PCR体系相比提供了更优异
的结果。
使用这种产品,您可以在您的PCR中得到更好特异性和更高的灵敏度,同时可以灵活地选择您所喜欢的扩增条件,检测方法和设备。
FQPCR
实时定量PCR是快速增长的PCR方法,它可以精确、可重复地定量起始物质。
MASTERMix-UDG(hotstart)是一种方便使用的反应混合液,为定量分析进行了优化。
它包含了荧光PCR所必须的成分(如缓冲液,dNTP,聚合酶)。
只需加入您的模板,扩
增引物和荧光标记探针。
您就可以得到实时qPCR所需的特异性和灵活性。
您可以利用成套的hotstartTaq酶kit(A2010A0106),来配制不含有UNG/dUTP防污染系统的热启动荧光PCR体系。
您也可以选择hotstartTaq酶,UNG酶和dNTPS,来配制含有UNG/dUTP防污染系统的热启动荧光PCR体系。
PCR试剂体系!
您可以从实验角度得到多种选择,得到高产量、特异和灵活的定量
高产量和特异性的扩增
FQPCRMASTERMix-UDG(hotstart)提供了强大的PCR扩增,可以使用多个模板组。
所使用的TaqDNA聚合酶具有热启动特性。
这极大地降低和消除了错误配对和非特异性扩
污染的能力防止了非模板DNA的扩增,从而降低了假阳性,使结果更可靠。
(hotstart)的灵敏度极高
在产量和灵敏度方面,QuantitativePCRMASTERMix-UDG
(阈循环)。
您可以更精确地定量低拷贝的基因,并在较宽的目的浓度范围内检测线性剂量反应。
高度灵活性
在分析设置,检测方法和设备上
除了灵敏度和特异性外,UniversalPCRMasterMixKit
给您提供了较高的自由度。
使用UniversalPCRMasterMixKit,您可以:
对扩增的不同模板优化镁离子浓度,由于提供了附加的氯化镁,所以您可以方便地配置Mix体系。
可以更灵活的进行普通PCR和荧光PCR。
可以在多种设备上使用,如ABIPrism?
7700,ABIGeneAmp?
5700和Bio-Rad的
l-Cycler。
可以利用多种检测方法的优点,包括TaqMan?
探针和
MolecularBeacon,您不必局限于
特定的试剂盒。
您还可以灵活的选择进行自配荧光PCR体系,不论是含
UNG/dUTP防污染系统还是不含
该系统的。
反应体系配制:
A2010A0101试剂盒:
(探针体系)
FQ-PCRMasterMix-UNG混合物(2X)25ul(终浓度为
1X);
上游引物(终浓度为50~900nM)(可先设200nM),下游引物(终浓度为50~900nM)
(可先设200nM);探针(终浓度为200nM);待检样品5ul(终浓度为10~100ng);
无菌去离子水补足,使总体积达到50ul。
您可以选择荧光染料SYBGREEN体系,具体请参照说明书。
您可灵活使用20-50UI间其他体积,注意保证终浓度相同。
A2010A0106试剂盒:
反应体系终浓度(自配热启动荧光系统):
1-2U的hotstartTaq酶、3-5.5mM的Mg2+、0.2mM的dNTPs、1XPCRbuffer
(A2010A0106);50—900nM的上游引物(可先设200nM)、50—900nM的下游引
物(可先设200nM)、200nM的探针、通常取2-5ul的模板,无菌去离子水补足,反应
总体积通常为20—50ul
自配热启动荧光—UNG体系:
1-2U的Taq酶、1XPCRbuffer、2.5-4.0mM的Mg2+(A2010A0105);0.2-1U的
UNG酶(A2010A0107)(可先设为0.5U)、0.2mM的d(A,C,G)TPs、0.2-0.4mMdUTP
(要调整)(A2010A0108);50—900nM的上游引物(可先设200nM八50—900nM的
下游引物(可先设200nM)、200nM的探针、通常取2-5ul的模板、反应总体积通常为
20—50ul
3、反应体系和条件的优化
使用高产量,特异和灵活的定量PCR试剂体系FQPCRMASTERMix-UDG(hotstart),
优化参数最少。
您只需要优化退火温度,就可以得到更灵敏、更可靠的定量结果。
对于特殊
结构的荧光PCR,您可以优化引物浓度,来得到更特异或更灵敏的结果。
使用通用PCRMasterMix试剂盒进行反应体系的配制,可以适合更多的反应体系,如
mRNA的普通RT-PCR检测,适用于合成质粒的PCR,同时也适用于荧光PCR,范围更宽。
采用成套的hotstartTaq酶kit(A2010A0106),该试剂盒中含有进行热启动荧光核心试剂
盒的所有成分,也降低了选择纯度不够或不合适产品的风险。
您需要根据以下原则进行优化:
1、您需要对酶量和镁离子浓度进行优化。
酶的推荐反应浓度为
1.25—1.5U(50ul),
要时可在1-2U之间探讨酶的最佳条件;Mg离子推荐浓度普通
PCR终浓度为1—3mM,
光PCR终浓度为3—5.5mM,请在该范围内探讨最佳条件。
2、试剂盒中提供的dNTP已经预混,能够充分保证产品质量和
PCR的忠实性。
dNTP
择经典的0.2mM的浓度即可。
3、另外,上游引物和下游引物浓度可先设为200nM。
当结果不理想时,可以在50nM
900nM之间进行探讨。
4、如选用Taqman探针,探针浓度可设为200nM,不须探讨。
选择其他种类的探针需
根据要求设置探针浓度。
可以先用推荐的反应条件,如果结果不佳,可根据引物、探针设计的具体情况适合的退火温度,退火时间和循环数。
6、DNA模板的添加量通常在100ng以下,因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的
超过PCR反应液总体积的10%。
无菌无酶无热源。
如进行RNA反应应采用无RNA降解酶的水和容器进行操作。
如采用hotstartTaq酶来配制与A2010A0101相同的热启动荧光体系(含UNG/dUTP防
建议先使用A2010A0106优化好产品体系后,再来优化该防污染系统。
0.2-1U的UNG酶(A2010A0107)(可先设为0.5U)、0.2mM的d(A,C,G)TPs、
0.2-0.4mMdUTP(A2010A0108)。
反应条件如酶量、Mg离子等都已经调好(参照
A2010A0106),您可以固定d(A,C,G)TPs的浓度为0.2mM,并设定UNG浓度为
0.5U(50ul),dUTP浓度也设为0.2mM,初步来看反应结果。
如结果不理想可调整dUTP
请参照3:
影响PCR及荧光PCR的其他因素进行优化。
总之,优化的指标越多,实验的不
Mix-UDG(hotstart)使用注意事项。
适用的荧光仪器、实验设计、荧光曲线和数据分析;
(Linegene)。
不同的仪器使用方法有所区别,但都具备对Taqman探针和sybgreen染料法的检测波长和检测能力。
QPCRMASTERMix-UDG(hotstart)和通用PCRMasterMix均适合在这
些仪器上进行使用。
复孔。
基线或阀值的设定通常是以10—15个循环的荧光值作为阀值,也可以以阴性对照荧光值的最高点作为基线。
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- 关 键 词:
- 荧光 定量 PCR 实验 指南