USP34细菌内毒素《85》.docx
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USP34细菌内毒素《85》
REAGENTSANDTESTSOLUTIONS试剂和测试溶液
AmoebocyteLysate—Alyophilizedproductobtainedfromthelysateofamoebocytes(whitebloodcells)fromthehorseshoecrab(LimuluspolyphemusorTachypleustridentatus).Thisreagentrefersonlytoaproductmanufacturedinaccordancewiththeregulationsofthecompetentauthority.[note—AmoebocyteLysatereactstosome
-glucansinadditiontoendotoxins.AmoebocyteLysatepreparationsthatdonotreacttoglucansareavailable:
theyarepreparedbyremovingtheGfactorreactingtoglucansfromAmoebocyteLysateorbyinhibitingtheGfactorreactingsystemofAmoebocyteLysateandmaybeusedforendotoxintestinginthepresenceofglucans.]变形细胞溶解液—由鲎的〔白血细胞〕变形细胞溶解液制得的冻干产品。
该试剂仅指那些按照相关的监管机构的法规要求制得的产品。
[注:
变形细胞溶解液除了与内毒素反响外,还会与某些
-葡聚糖反响。
可以制成不与
-葡聚糖发生反响的变形细胞溶解液制品:
可通过从变形细胞溶解液中去除会与葡聚糖反响的G因子或抑制变形细胞溶解液的G因子反响系统来制得该制品,这些制品可用于在存在葡聚糖时进行内毒素检测。
]
WaterforBacterialEndotoxinsTest(BET)—UseWaterforInjectionorwaterproducedbyotherproceduresthatshowsnoreactionwiththelysateemployed,atthedetectionlimitofthereagent.细菌内毒素检测〔BET〕用水—使用注射用水或用其他方式制得的不会与鲎试剂检测限对应浓度的溶菌液发生反响的水。
LysateTS—DissolveAmoebocyteLysateinWaterforBET,orinabufferrecommendedbythelysatemanufacturer,bygentlestirring.Storethereconstitutedlysate,refrigeratedorfrozen,accordingtothespecificationsofthemanufacturer.鲎试剂—在缓慢搅拌的同时,将变形细胞溶解液溶于细菌内毒素检测用水中或溶于溶菌液生产商推荐的缓冲液中。
按照生产商的说明来冷藏或冷冻储存该再生溶菌液。
GEL-CLOTTECHNIQUE凝胶法
TheGel-ClotTechniqueisfordetectingorquantifyingendotoxinsbasedonclottingofthelysatereagentinthepresenceofendotoxin.Theminimumconcentrationofendotoxinrequiredtocausethelysatetoclotunderstandardconditionsisthelabeledsensitivityofthelysatereagent.Toensureboththeprecisionandvalidityofthetest,performthetestsforconfirmingthelabeledlysatesensitivityandforinterferingfactorsasdescribedunderPreparatoryTesting.
凝胶法通过鲎试剂与内毒素产生凝集反响的原理,来检测或定量内毒素。
在标准条件下使溶菌液凝结所需的最低内毒素浓度即为鲎试剂的标示灵敏度。
为了确保化验的精密度和有效性,按照凝胶法预备试验项所述来确认鲎试剂标示灵敏度和干扰因子。
PreparatoryTesting凝胶法预备试验
TestforConfirmationofLabeledLysateSensitivity—Confirminfourreplicatesthelabeledsensitivity,
expressedinEU/mLofthelysatepriortouseinthetest.Thetestforconfirmationoflysatesensitivityistobecarriedoutwhenanewbatchoflysateisusedorwhenthereisanychangeinthetestconditionsthatmayaffecttheoutcomeofthetest.Preparestandardsolutionshavingatleastfourconcentrationsequivalentto2
bydilutingtheUSPEndotoxinRSwithWaterforBET.
确认鲎试剂标示灵敏度—在进行化验之前,要对鲎试剂标示灵敏度
〔EU/ml〕重复确认4次。
当使用新批次的鲎试剂或当实验条件出现任何可能影响实验结果的变更时,均应进行鲎试剂灵敏度确实认。
用细菌内毒素检测用水稀释内毒素USP标准品,配制一系列标准溶液,至少含有与2
和
相当的四种浓度。
MixavolumeoftheLysateTSwithanequalvolume(suchas0.1-mLaliquots)ofoneoftheStandardEndotoxinSolutionsineachtesttube.Whensingletestvialsorampulscontaininglyophilizedlysateareused,addsolutionsdirectlytothevialorampul.Incubatethereactionmixtureforaconstantperiodaccordingtothedirectionsofthelysatemanufacturer(usuallyat37±1
for60±2minutes),avoidingvibration.Totesttheintegrityofthegel,takeeachtubeinturndirectlyfromtheincubatorandinvertitthroughabout180
inonesmoothmotion.Ifafirmgelhasformedthatremainsinplaceuponinversion,recordtheresultaspositive.Aresultisnegativeifanintactgelisnotformed.Thetestisconsideredvalidwhenthelowestconcentrationofthestandardsolutionsshowsanegativeresultinallreplicatetests.
在每个试管中将一定体积的鲎试剂与等体积〔例如0.1mL的等份〕的其中一种标准内毒素溶液进行混合。
当使用含有冻干鲎试剂的一次性实验瓶或者安瓿时,向瓶或安瓿中直接参加溶液。
按照鲎试剂生产商的规定,要在恒定时段内将反响混合物保持恒温〔通常是37±1
条件下60±2分钟〕,防止振动。
为检验凝胶体的完整性,依次直接从恒温箱中取出各个试管,并平滑地将其翻转180
。
如果已经形成的牢固凝胶在倒置后保持原位,那么将结果记录为阳性。
如果没有形成完整的凝胶,那么结果为阴性。
只有当最低浓度的标准溶液在所有重复试验中均呈阴性时,该试验方为有效。
Theendpointisthesmallestconcentrationintheseriesofdecreasingconcentrationsofstandardendotoxinthatclotsthelysate.Determinethegeometricmeanendpointbycalculatingthemeanofthelogarithmsoftheendpointconcentrationsofthefourreplicateseriesandthentakingtheantilogarithmofthemeanvalue,asindicatedinthefollowingformula:
反响终点就是引起溶菌液凝结的系列递减的标准内毒素浓度中的最低一个浓度。
如下式所示,计算四次重复试验的系列终点浓度的对数平均值,然后计算该平均值的反对数,从而得到几何平均终点。
GeometricMeanEndpointConcentration=antilog(Se/f)
几何平均终点浓度=〔Se/f〕的反对数
andnotmorethan2
thelabeledsensitivityisconfirmedandisusedintestsperformedwiththislysate.其中,Se指的是所使用的系列稀释液的终点浓度的对数和,f是重复试验的次数。
几何平均终点浓度即为鲎试剂灵敏度的测定值〔以EU/mL为单位〕。
如果该值不小于
且不大于2
,那么标示灵敏度得到了确认,并可用于使用此溶菌液进行的试验。
TestforInterferingFactors—Usuallypreparesolutions(A–D)asshowninTable1,andperformtheinhibition/enhancementtestontheSampleSolutionsatadilutionlessthantheMVD,notcontaininganydetectableendotoxins,operatingasdescribedforTestforConfirmationofLabeledLysateSensitivity.ThegeometricmeanendpointconcentrationsofSolutionsBandCaredeterminedusingtheformuladescribedintheTestforConfirmationofLabeledLysateSensitivity.干扰因子检测:
按照表1所示配制溶液A、溶液B、溶液C、溶液D,并且按照上述确实认鲎试剂标示灵敏度项所述,对稀释倍数不超过最大有效稀释倍数〔MVD〕、不含有任何内毒素的样品溶液进行抑制/增强试验。
用确认鲎试剂标示灵敏度项中提及的公式来测定溶液B和溶液C的几何平均终点浓度。
Table1.PreparationofSolutionsfortheInhibition/EnhancementTestforGel-ClotTechniques表1:
用于凝胶法抑制/增强试验的溶液制备
Solution溶液
EndotoxinConcentration/
SolutiontowhichEndotoxin
isAdded内毒素浓度/参加内毒素的溶液
Diluent
稀释液
Dilution
Factor
稀释因子
Endotoxin
Concentration内毒素浓度
Numberof
Replicates
重复次数
Aa
None/SampleSolution
无/样品溶液
—
—
—
4
Bb
2
/SampleSolution2
/样品溶液
SampleSolution样品溶液
1
2
4
8
2
1
4
4
4
4
Cc
2
/WaterforBET2
/细菌内毒素检测〔BET〕用水
WaterforBET
细菌内毒素检测用水
1
2
4
8
2
1
2
2
2
2
Dd
None/WaterforBET
无/细菌内毒素检测用水
—
—
—
2
a SolutionA:
ASampleSolutionofthepreparationundertestthatisfreeofdetectableendotoxins.溶液A:
用于化验的不含可检测到的内毒素的样品溶液。
b SolutionB:
Testforinterference.溶液B:
干扰因子检测。
c SolutionC:
Controlforlabeledlysatesensitivity溶液C:
对鲎试剂标示灵敏度的控制
d SolutionD:
NegativecontrolofWaterforBET溶液D:
细菌内毒素检测用水阴性对照
ThetestisconsideredvalidwhenallreplicatesofSolutionsAandDshownoreactionandtheresultofSolutionCconfirmsthelabeledsensitivity.仅当溶液A和溶液D的所有重复试验均显示无反响,且溶液C的结果确认标示灵敏度符合要求时,试验方为有效。
IfthesensitivityofthelysatedeterminedinthepresenceofSolutionB
andnotgreaterthan2
theSampleSolutiondoesnotcontainfactorsthatinterfereundertheexperimentalconditionsused.Otherwise,theSampleSolutiontobeexaminedinterfereswiththetest.如果用溶液B的供试品溶液测得
且不大于2
,那么该样品溶液中在实验条件下不含有干扰因子。
否那么,该样品溶液会干扰此试验。
IfthesampleundertestdoesnotcomplywiththetestatadilutionlessthantheMVD,repeatthetestusingagreaterdilution,notexceedingtheMVD.Theuseofamoresensitivelysatepermitsagreaterdilutionofthesampletobeexaminedandthismaycontributetotheeliminationofinterference.如果供试品在稀释倍数小于最大有效稀释倍数〔MVD〕的情况下不符合该试验的要求,那么用一个更大的稀释倍数〔但不超过MVD〕来重复该试验。
使用灵敏度更大的溶菌液允许对样品进行更大倍数的稀释,这样可以起到排除干扰的作用。
Interferencemaybeovercomebysuitabletreatment,suchasfiltration,neutralization,dialysis,orheating.Toestablishthatthechosentreatmenteffectivelyeliminatesinterferencewithoutlossofendotoxins,performtheassaydescribedaboveusingthepreparationtobeexaminedtowhichUSPEndotoxinRShasbeenaddedandwhichhasthenbeensubmittedtothechosentreatment.可以通过适当的处理来克服干扰,例如过滤、中和、透析、或加热。
为了确定所选用的处理方法能有效地排除干扰且不会造成内毒素的减少,要使用参加了内毒素USP标准品并用所选方法进行了处理的供试品溶液,进行上述化验。
LimitTest限度检测
Procedure—PrepareSolutionsA,B,C,andDasshowninTable2,andperformthetestonthesesolutionsfollowingtheprocedureforTestforConfirmationofLabeledLysateSensitivityunderPreparatoryTesting.程序—根据表2配制溶液A、溶液B、溶液C、溶液D,并按照凝胶法预备试验中‘鲎试剂标示灵敏度确实认’项所述对这些溶液进行检测。
Table2.PreparationofSolutionsfortheGel-ClotLimitTest表2:
凝胶限度检测,溶液的制备
Solution*溶液*
EndotoxinConcentration/SolutiontowhichEndotoxinisAdded内毒素浓度/参加内毒素的溶液
NumberofReplicates重复次数
A
None/DilutedSampleSolution无/稀释的样品溶液
2
B
2
/DilutedSampleSolution2
/稀释的样品溶液
2
C
2
/WaterforBET2
/细菌内毒素检测用水
2
D
None/WaterforBET无/细菌内毒素检测用水
2
* PrepareSolutionAandthepositiveproductcontrolSolutionBusingadilutionnotgreaterthantheMVDandtreatmentsasfortheTestforInterferingFactorsunderPreparatoryTesting.ThepositivecontrolSolutionsBandCcontaintheStandardEndotoxinSolutionataconcentrationcorrespondingtotwicethelabeledlysatesensitivity.ThenegativecontrolSolutionDconsistsofWaterforBET.使用不超过最大有效稀释倍数〔MVD〕的稀释度并按照凝胶法预备试验中干扰因子的检测项规定的处理方法来配制溶液A和阳性产品对照溶液B。
阳性对照溶液B和C含有浓度为标示称鲎试剂灵敏度两倍的标准内毒素溶液。
阴性对照溶液D由细菌内毒素检测用水组成。
Interpretation—ThetestisconsideredvalidwhenbothreplicatesofSolutionBandCarepositiveandthoseofSolutionDarenegative.WhenanegativeresultisfoundforbothreplicatesofSolutionA,thepreparationundertestcomplieswiththetest.WhenapositiveresultisfoundforbothreplicatesofSolutionA,thepreparationundertestdoesnotcomplywiththetest.说明:
只有当阳性对照溶液B和C的两次重复试验均呈阳性,且阴性对照溶液D均呈阴性,此试验方为有效。
假设溶液A的两次重复检测结果呈阴性,那么溶液配制符合试验要求。
当溶液A的两次重复检测均呈阳性结果,那么供试品不符合此检测的要求。
WhenapositiveresultisfoundforonereplicateofSolutionAandanegativeresultisfoundfortheother,repeatthetest.Intherepeattest,thepreparationundertestcomplieswiththetestifanegativeresultisfoundforbothreplicatesofSolutionA.ThepreparationdoesnotcomplywiththetestifapositiveresultisfoundforoneorbothreplicatesofSolutionA.However,ifthepreparationdoesnotcomplywiththetestatadilutionlessthantheMVD,thetestmayberepeatedusingagreaterdilution,notexceedingtheMVD.当溶液A的两次重复测试中,1个呈阳性结果,1个呈阴性结果时,须重复该实验。
在重复该实验时,如果溶液A均呈阴性结果,那么溶液配制符合此测试的要求。
如果溶液A的一次或者两次的检测结果都是阳性,那么溶液配制不符合试验要求。
但是,如果其稀释
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