植物生物技术考试重点.doc
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植物生物技术考试重点.doc
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植物生物技术考试重点
1、生物技术?
现代生物技术主要包括哪几个方面的技术?
生物技术(biotechnology),也称生物工程,是指以现代生命科学为基础,结合先进的工程技术手段和其他基础科学的科学原理,按照预先的设计改造生物体或加工生物原料,为人类生产出所需要的产品或达到某种目的的一系列技术。
先进的工程技术:
基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程和蛋白质工程等新技术。
改造生物体:
获得优良的动植物品种。
为人类生产所需的产品:
食品、医药、能源、原料等。
生物技术的产生以DNA重组技术的建立为标志。
现代植物生物技术包括:
植物组织培养技术、人工种子技术、细胞工程技术、基因工程技术。
2、什么是胚培养?
有什么意义?
无菌条件下将胚从胚珠或种子中分离出来,置于培养基上进行离体培养的方法。
意义:
克服远缘杂交不亲和性和杂种不育性,获得种间或属杂种。
种间或属杂交中,受精作用能正常完成,胚也能进行早期的发育,但由于胚乳发育不良,杂种胚最终将夭折,因而不能形成有发芽能力的种子。
3、什么是基本培养基?
仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基
4、什么是转基因沉默?
5、什么是逆转录酶?
6、植物组织培养?
将植物的离体器官(如根、茎、叶、花、果实、种子等)、组织(如花药、胚珠、形成层、皮层、胚乳等)、细胞(如体细胞、生殖细胞花粉等)以及去除细胞壁的原生质体,甚至幼小的植株,在人工控制的无菌环境下,应用人工培养基创造适宜的培养条件,使其生长、分化并成长为完整植株的过程。
也称为离体培养或试管培养。
7、愈伤组织的形成的过程?
8、愈伤组织的定义和特点?
愈伤组织(Callus):
离体的植物器官、组织或细胞,在培养一段时间以后,通过细胞分裂,形成一种高度液泡化、无定形状态、由薄壁细胞组成的排列疏松的组织。
细胞分裂快,结构疏松,颜色浅而透明
9、阐述外植体的成苗途径。
10、植物组织培养常用的培养基及各自的特点?
据其营养水平分:
基本培养基、完全培养基
据其态相分:
固体培养基、液体培养基
据其作用分:
诱导培养基、增殖培养基、生根培养基
据培养物的培养过程分:
初代培养基、继代培养基
组织培养中常用的培养基主要有:
MS、White、N6、B5、Heller、Nitsch、Miller、KM-8P
培养基种类
固体培养基:
加凝固剂(多为琼脂)的培养基;
液体培养基:
不加凝固剂的培养基。
初代培养基:
用来第一次接种从植物体上分离下来的外植体的培养基。
继代培养基:
用来接种继初代培养之后的培养物的培养基。
基本培养基:
只含有机和无机成分,但不包括糖、激素和复杂有机添加物等。
完全培养基:
基本培养基的基础上,根据试验的不同需要,附加一些物质,如植物生长调节物质和其它复杂有机附加物等。
2、培养基的特点
MS培养基--大量元素。
特点:
无机盐的浓度高,具有高含量的氮、钾,尤其硝酸盐的用量很大,同时还含有一定数量的铵盐,这使得它营养丰富,不需要添加更多的有机附加物,就能满足植物组织对矿质营养的要求,有加速愈伤组织和培养物生长的作用,当培养物久不转移时仍可维持其生存。
White(WH)培养基。
特点:
无机盐浓度较低。
它的使用也很广泛,无论是生根培养还是胚胎培养或一般组织培养都有很好的效果。
N6培养基。
特点:
KNO3和(NH4)2SO4含量高,不含钼。
目前在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花粉和花药培养和组织培养。
B5培养基。
特点:
含有较低的铵盐,较高的硝酸盐和盐酸硫胺素。
铵盐可能对不少培养物的生长有抑制作用,但它适合于有些植物如双子叶植物特别是木本植物的生长。
KM-8P培养基。
特点:
特点是有机成分较复杂,它包括了几乎所有的单糖和维生素、呼吸代谢中的主要有机酸。
主要用于原生质体培养。
固体培养基和液体培养基:
固体培养基:
使用简便,一般用于组织、愈伤组织、短枝、茎尖等材料的培养。
特别适合植物的快速繁殖。
缺点:
一块外植体只能部分接触培养基,不能浸没在培养基中,结果培养物上下部因接受养分不匀而形成差异,不易使细胞群体保持一致。
液体培养基(不加琼脂):
提供比较均匀的营养,而且细胞的增殖速度快,一般用于细胞,原生质体的培养,也可用于愈伤组织的培养,胚状体等材料的继代培养。
11、植物组织培养室需要控制的条件。
温度:
大多数植物组织培养温度在23~27℃之间。
低于15℃时培养,植物组织会表现生长停止,高于35℃时对植物生长不利。
不同植物培养的适温不同。
月季是25~27℃、番茄是28℃。
温度不仅影响植物组织培养育苗的生长速度,也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。
如烟草芽的形成以28℃为最好,在12℃以下,33℃以上形成率皆最低。
光照:
主要表现在光照强度、时间长短、光照质量等。
有的材料培养需要光,有的则不需光;不同的植物所需的光照强度也不一样。
一般1000-5000Lx/12-16h/天。
湿度:
湿度影响包括培养容器内湿度和环境湿度。
容器内湿度水平主要受培养基水分含量和封口材料的影响。
封口材料直接影响容器内湿度情况。
封闭性差的材料易导致培养基干燥;封闭性高的封口材料易引起透气性不好。
湿度过低会使培养基丧失大量水分,导致培养基各种成分浓度的改变和渗透压的升高,进而影响组织培养的正常进行。
湿度过高时,易引起棉塞长霉,造成污染。
气体环境:
氧气是组织培养中必需的因素,瓶盖封闭时要考虑通气问题,可用附有滤气膜的封口材料。
通气最好的是棉塞封闭瓶口,但棉塞易使培养基干燥,夏季易引起污染。
固体培养基可加进活性炭来增加通气度,以利于发根。
培养室要经常换气,改善室内的通气状况。
液体振荡培养时,要考虑振荡的次数、振幅等,同时要考虑容器的类型、培养基等。
12、植物组织培养最常用的C源、常用的激素及其作用和浓度?
蔗糖2%~5%作为植物生长发育所需的营养物质和调节培养基中的渗透压
生长素诱导细胞分裂和根的分化
细胞分裂素促进细胞分裂和由愈伤组织形成器官,分化不定芽
赤霉素刺激在培养中形成的不定胚发育成小植株
油菜素内酯促进伸长提高植物內源生长素
乙烯促进RNA和蛋白质合成和使细胞膜透性增加
脱落酸抑制外植体形成体细胞胚状体
13、植物组织培养中培养基配制过程中应注意的环节?
培养基的配制:
准备工作、母液的配置和保存、培养基配置、培养基的灭菌
配制母液时要用蒸馏水或重蒸馏水。
药品应选取等级较高的化学纯或分析纯。
各种药品要充分溶解再依次混合.配制时注意一些离子之间易发生沉淀(如Ca2+和S042-)。
铁盐容易发生沉淀,需单独配制。
培养基的配制注意事项:
1、溶解特征:
大量元素易沉淀;
2、标签(浓度、日期)
3、保存期:
发现沉淀不能用。
培养基的配制步骤:
1、将配制好的母液按顺序排列,
2、列表计算各母液用量
3、先取适量的蒸馏水放入容器,再依次加入母液
4、加入肌醇和蔗糖,定容后调pH
5、加入琼脂,煮开至完全溶解
6、分装到组培容器
7、封口,贴标签
14、植物组织培养的理论依据?
植物细胞全能性
组织培养的生理依据:
激素(植物生长调节剂)调控
15、植物组织培养技术在目前农业生产上的应用?
1育种上的应用:
单倍体育种:
快速纯化个体,缩短育种年限,提高育种效率等作用。
远缘杂交:
克服杂交不亲和性,用于植物的远缘杂交;体细胞杂交;胚珠培养。
体细胞变异的应用:
果树苗木等。
单细胞突变体的筛选:
抗性育种。
2种子繁育与生产:
快速繁育:
兰花、香蕉、甘蔗、咖啡等。
获得脱毒植株,提高种性:
病毒可通过维管束传递,茎尖细胞分裂很旺,几乎没有病毒,如土豆。
人工种子:
不受气候影响,苜蓿、芹菜、胡萝卜等。
3植物产品的工厂化生产:
喜树的喜树碱(抗癌),人参皂苷,香料植物的香油精。
4种质资源的保存:
对于难于产生种子,种子不易保存,或珍稀的植物。
番薯的块根保存很难,可以取其茎尖进行组织培养,进行保存。
16、简述植物组织无菌培养的一般步骤?
外植体表面消毒:
将外植体置于有螺丝盖的玻璃瓶中,注入含有几滴活化剂的浓度适当的消毒液,使材料完全浸没在消毒液中,盖上盖,把玻璃瓶置入超净工作台。
消毒期间摇动2-3次,使消毒液充分接触植物组织。
消毒处理后,打开瓶盖,倒出消毒液,注入适量的无菌蒸馏水,再盖上盖,摇动数次,将水倒掉如此重复3~4次。
将材料取出,置于一个已经灭菌的培养皿中。
器械消毒:
将所要使用的器械(如解剖刀、镊子、剪刀等)置入95%乙醇中,取出后于酒精灯火焰上灼烧,待冷却后即可使用。
所有操作器械需使用一次,消毒一次。
用这些消过毒的将已经过表面消毒的材料切取或剥取适当的外植体。
o将培养容器的盖或塞子打开,将外植体接种到培养基上,如果使用的是玻璃培养容器,把瓶口置酒精灯火馅上烘烤数秒钟,然后迅速用瓶盖或瓶塞封严。
17、与整体植物相比,植物离体组织有哪些特点?
整体植物不同的器官具有明显的分工,只要有水和无机盐就可以完成整个生命过程。
离体组织与植株没有了物质、能量和信息的交流,从而:
1、生长发育不受植株的控制,可以脱离原来的发育路线;
2、得不到生长发育所需要的培养,从自养变成异样。
3、所需要的营养与活体组织所需要的营养具有很大的差别。
能量来源(碳源);有机成分、激素等。
18、简述激素在植物组织离体培养过程中的作用?
19、常用的PCR技术有哪些?
20、PCR反应的条件?
21、PCR反应中关键的试剂有哪些?
22、什么是离体授粉?
23、柯斯质粒?
24、载体的种类以及载体应具备的特性?
25、质粒载体构建的基本原则,以及质粒载体的一般生物学特性?
26、噬菌体的特征?
什么是溶菌周期,什么是溶源周期?
27、同源基因的共抑制效应?
28、基因克隆操作中常用的工具酶种类?
29、基因克隆的本质以及基因克隆主要包括哪些内容?
30、简述植物基因组文库构建的一般步骤以及构建原则?
31、什么是转基因育种?
转基因育种有哪些特点?
32、理想的植物受体系统应符合的条件
33、根据你的理解详细说明农杆菌介导的转基因技术(包括土壤农杆菌Ti质粒转化系统和发根农杆菌Ri质粒转化系统)有哪些优点?
34、以水稻为例详细介绍农杆菌介导的转基因技术的具体操过程?
35、外源基因整合到植物染色体上的主要的分子鉴定方法?
36、转基因检测可以从哪些方面进行检测,具体的检测原理是什么?
植物基因工程理论上的三大发现:
DNA为遗传信息的携带者。
DNA的双螺旋模型和半保留不不连续复制机制。
中心法则和操纵子模型。
植物基因工程技术上的三大发明:
DNA体外切割与连接技术。
基因工程载体的使用。
DNA分析技术:
电泳、测序、杂交技术。
基因工程的定义:
用人工的方法,从不同生物中提取外源基因及载体DNA,经过体外切割、拼接和重组,然后采取某种方法,把重组后的带有外源基因的载体DNA引入植物细胞,并使其在植物细胞内进行复制和表达,以达到预期改变受体植物细胞遗传特性的目的。
它的核心是重组DNA技术。
也称:
遗传工程,基因操作,基因克隆,分子克隆。
基因工程的生产应用:
克服远缘杂交(有性杂交)的困难。
1、使基因在动物、植物,微生物不同生物系统中传递。
2、快速、定向的获取人类所需要的生物新类型。
细胞工程的定义:
利用细胞培养、细胞融合等细胞生物学方法对细胞进行改造,使细胞按人类需要生产有用的产品,或者遗传物质,从而培育新的生物类型。
包括:
细胞杂交技术、单克隆抗体、细胞大规模培养技术。
细胞工程的应用--原生质体融合
植物组织培养室设计:
准备室(培养基室)
接种室(无菌操作)
培养室(控制温光)
细胞室(细胞研究)
培养基的成分:
水、无机盐、有机成分、植物生长调节剂、碳源、凝固剂及其它附加物
1、无机营养
无机物中有16种是植物必须的,即C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl。
I虽然不是植物必需元素,但几乎所有的培养基中都添加I。
植物所需要的浓度大于0.5mmol/L的元素为大量元素,小于0.5mmol/L的元素为微量元素。
缺氮:
表现出一种很注目的花色素苷的颜色,愈伤组织不能形成导管;
缺钾或磷:
细胞过度生长,形成层组织减退;
缺硫:
愈伤组织褪绿;
缺铁:
细胞分裂停止;
缺硼:
细胞分裂停滞,细胞伸长;而缺锰铜则会影响细胞伸长。
2、有机成分--氨基酸
氨基酸是蛋白质的组成成分,也是一种有机氮化合物。
常用的有甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、丝氨酸、丙氨酸、半胱氨酸以及多种氨基酸的混合物(如水解酪蛋白、水解乳蛋白)等。
有机氮作为培养基中的惟一氮源时,离体组织生长不良,只有在含有无机氮的情况下,氨基酸类物质才有较好的效果。
有机成分--维生素类
能明显地促进离体组织的生长。
培养基中的维生素主要是B族维生素,如硫胺素(维生素B1)、吡哆醇(维生素B6)、烟酸(维生素B3,又称维生素PP)、泛酸(维生素B5)、生物素(维生素H)、钴胺素(维生素Bl2)、叶酸(维生素B11)、抗坏血酸(维生素C)等。
有机成分--天然有机物
有机附加物包括有些成分尚不清楚的天然提取物,如椰乳(CM)、香蕉泥、番茄汁(TJ)、马铃薯泥、苹果汁、生梨汁、西瓜汁、酵母提取液(YE)、麦芽浸出物(ME)等。
有机成分--肌醇
肌醇:
环己六醇,帮助活性物质作用
其他:
单核苷酸等。
3、碳源
糖在植物组织培养中是不可缺少的。
它不但作为离体组织赖以生长的碳源,且还能使培养基维持一定的渗透压(一般培养基渗透压维持在1.5~4.1MPa)。
渗透压对细胞的增殖和胚状体的形成都有十分明显的影响。
一般多用蔗糖调节渗透压,其浓度为1%~5%,也可用麦芽糖、葡萄糖或果糖等。
葡萄糖或果糖价格稍贵,但可防褐化。
麦芽糖价格贵,细胞培养时用。
4、激素
激素对愈伤组织的诱导、器官分化及植株再生具有重要的作用.
培养基中的关键物质:
主要包括生长素、细胞分裂素、赤霉素(GA3)、脱落酸(ABA)、乙烯。
激素--生长素
生长素能影响植物茎和节间的伸长、向性、顶端优势、叶片脱落、生根等现象。
离体培养中的作用:
诱导愈伤组织的产生;促进细胞脱分化;促进细胞的伸长;促进生根。
常用的生长素有吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、2,4—二氯苯氧乙酸(2,4-D)。
IAA、NAA、IBA、2,4-D之类生长素,可先用少量0.1N氢氧化钠或乙醇溶解,然后再定容到所需要的体积。
激素--细胞分裂素
细胞分裂素影响植物细胞分裂、顶端优势的变化和茎的分化等。
培养基中加入细胞分裂素,主要是为促进细胞分裂和由愈伤组织形成器官,分化不定芽。
由于这类化合物有助于解除顶端优势对腋芽的抑制作用,可用于茎的增殖。
细胞分裂素有天然的和人工合成的。
常用的有玉米素(ZT)、苄氨基腺嘌呤(6-BA)、激动素(KT)等。
KT、BA等细胞分裂素则可用少量0.1N盐酸加热溶解,然后加水定容。
激素比
当配制的培养基中生长素/细胞分裂素的比例高时则有利于生根;生长素/细胞分裂素的比例低时则有利于生芽;若两者浓度相当时,既不利于生根,也不利于生芽,而是愈伤组织的产生占优势。
其它的一些激素:
赤霉素,植物组织培养中常用的是GA3。
脱落酸,在植物组织培养中对培养物有间接的抑制作用,它可抑制外植体形成体细胞胚状体。
水杨酸(阿司匹林),能抑制ABA的形成,有利于胚状体的形成。
5、凝固剂
在固体培养时,琼脂是使用最方便、最好的凝固剂。
琼脂是一种高分子的碳水化合物,以色白、透明、洁净的为佳,仅溶解于热水,冷后(40℃以下)即凝固为固体状的凝胶。
琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式等有关外,还与高压灭菌时的温度、时间、pH等因素有关,长时间的高温会使凝固能力下降,过酸、过碱也会使琼脂发生水解,丧失凝固能力。
琼脂糖:
原生质体培养时用。
Phytogel:
新型凝固剂。
6、水
植物组织培养所必需
培养基的配制必须用超纯水
细胞培养主要用蒸馏水
7、活性炭(AC)
活性炭加入培养基中的目的主要是利用其吸附能力,减少一些有害物质的影响,如防止酚类物质污染而引起组织褐化死亡。
这在兰花组织培养中效果更明显。
活性炭使培养基变黑,有利于某些植物生根。
活性炭对物质吸附无选择性,因此使用时应慎重考虑,不能过量,一般用量为0.1%~0.5%。
活性炭对形态发生和器官形成有良好的效应。
8、培养基的pH
培养基的pH因培养材料不同而异,大多数植物都要求在pH5.6~5.8的条件进行组织培养。
在培养过程中,培养基的pH不是一成不变的,往往随着培养基的水分和养料的消耗,pH会发生一些变化。
高压灭菌会降低培养基中的pH。
配制培养基时,常用0.lmol/L的NaOH和0.lmol/L的HCl来调节培养基的pH。
pH的高低会影响琼脂的凝固能力:
pH>6培养基变硬,pH<5琼脂不易凝固
培养基的灭菌和存储:
培养基一般采用湿热灭菌法,压力108kPa、温度为121℃时,维持20min。
某些激素(如GA3、ZT、IAA)、抗生素以及某些维生素等,遇热时容易分解,不能进行高压灭菌。
当使用这类化合物时,可选择使用孔径为0.45μm或更小的细菌滤膜过滤灭菌。
培养基一般需冷却到60℃以下(恰在琼脂凝固之前)再加入这些遇热分解化合物。
将滤膜安在过滤器里面进行高压灭菌。
过滤器的灭菌温度不应超过121℃。
植物组培培养中污染的来源:
(1)培养容器;
(2)培养基本身;
(3)外植体;
(4)接种室的环境;
(5)操作用的器械;
(6)培养室的环境。
可以通过灭菌措施防止或减少污染源
常用的灭菌方法:
物理灭菌:
高温高压灭菌、干热灭菌(烘烧和灼烧)、湿热灭菌、辐射(紫外线、超声波、微波)灭菌、过滤灭菌。
化学灭菌:
酒精、升汞、过氧化氢、高锰酸钾、次氯酸钠、抗生素等化学药品处理,根据工作中的不同材料不同目的适当选用。
包括:
熏蒸灭菌、喷雾灭菌、消毒液灭菌。
高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖,从而改变培养基的渗透压。
培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解为葡萄糖和果糖。
培养基值小于5.5,其水解量更多,培养基中含有活性炭时,高压下蔗糖水解大大增强。
灭菌注意事项:
1、GA3、维生素、蔗糖等的降解问题;
2、灼烧问题;
3、紫外灯的危害;
4、消毒剂对皮肤的损害。
脱分化:
指高度分化的植物器官、组织或细胞,在离体培养条件下经过多次细胞分裂逐渐失去原来的结构、功能和分化状态,形成无组织结构的愈伤组织或细胞团的过程。
再分化:
指离体培养的植物细胞和组织可以由脱分化状态重新进行分化,形成另一种或几种类型的细胞、组织、器官,甚至形成完整植株。
植物组织培养步骤:
植物组织培养的类型:
愈伤组织培养:
最为常见的组织培养
器官培养:
根、茎、叶、花等
胚培养:
胚、胚乳、珠心、子房、
细胞培养和原生质体培养:
悬浮培养、单细胞培养
外植体消毒的一般步骤:
1、预处理,先对植物组织进行修整,去掉不需要的部分,将准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。
经过预处理的植物材料,其表面仍有很多细菌和真菌。
2、将外植体置于无菌的玻璃瓶中,加入75%的酒精溶液浸泡材料10S左右。
倒出酒精,用无菌水冲洗一次。
3、将适当浓度的消毒液(0.1%升汞或2%次氯酸钠),使材料完全浸没在消毒液中,盖上瓶盖,把玻璃瓶置入超净工作台灭菌一定时间。
在灭菌期间须摇动玻璃瓶2-3次。
4、消毒处理后,将消毒液倒出,注入适量的无菌蒸馏水漂洗,将水倒掉,重复3-4次。
外植体培养
固体培养法:
用琼脂或植物胶固化培养基来培养植物材料的方法。
该方法操作简单,通气好,外植体固定,利于愈伤组织的诱导、分化,应用最广;但养分分布不均,生长速度不均衡,有毒物质积累,并常有褐化中毒现象发生。
液体培养法:
即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。
一般用于愈伤组织的繁殖、分散;主要用于分离单细胞和产生体细胞无性系,生产次生代谢物质。
由于液体中氧气含量较少,所以通常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给,
优点:
生长繁殖快、均匀,工厂化生产
缺点:
需要摇床,频繁继代,不利分化。
初代培养旨在获得无菌材料和无性繁殖系。
即接种某种外植体后,最初的几代培养。
初代培养时,常用诱导或分化培养基,即培养基中含有较多的细胞分裂素和少量的生长素。
初代培养建立的无性繁殖系包括:
茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等。
根据初代培养时发育的方向可分为:
顶芽和腋芽的发育、不定芽的发育、体细胞胚状体的发生与发育。
继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁培养过程,外植体或愈伤组织在培养基上生长一段时间以后,由于营养物质枯竭,水分散失,以及代谢产物的积累,必须转移到新鲜培养基上培养。
继代培养的后代是按几何级数增加的过程。
生根培养是使无根苗生根的过程,目的是使生出的不定根浓密而粗壮。
生根培养可采用1/2或者1/4MS培养基,全部去掉细胞分裂素,并加入适量的生长素(NAA、IBA等)。
快速繁殖中初代培养只是一个必经的过程,而继代培养则是经常性不停的进行过程。
但在达到相当的数量之后,则应使其中一部分转入生根阶段。
增殖只是贮备母株,而生根才是增殖材料的分流,生产出成品。
若不及时将培养物转到生根培养基上去,就会使久不转移的苗子发黄老化,或因过分拥挤而使无效苗增多造成抛弃浪费。
(1)愈伤组织
外植体先形成愈伤组织,再分化成完整的植株。
在愈伤组织上同时长出芽和根,以后连成统一的轴状结构(较少),育成植株;
在愈伤组织中先形成茎,后诱导成根,再发育成植株;
在愈伤组织中先形成根,再诱导出芽,得到完整植株。
但在培养中一般先形成根的,往往抑制芽的形成;而相反,一般先产生芽的,则以后较易产生根。
(2)胚状体发生
组织培养中再生植株可通过与合子胚相似的胚胎发生过程,即形成胚状体,再发育成完整植株。
胚状体可以从以下几种培养物产生:
直接从器官上发生;
愈伤组织发生;
从游离单细胞发生;
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