法庭科学DNA实验室检验综合规范.docx
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法庭科学DNA实验室检验综合规范
法庭科学DNA实验室检查规范【GA-T383-】
1范畴
本原则规定了法庭科学DNA实验室检查应遵守基本规定。
本原则合用于所有从事法庭科学检查DNA实验室。
2定义
本原则采用下列定义。
2.1前期检查priorexamination
DNA检查迈进行预实验和确证明验。
2.2有机溶剂法organicextractionofDNA
通过酚-氯仿混合物萃取DNA溶液中蛋白质类有机物质,而保存DNA于水相溶液中提取办法。
2.3Chelex法ChelexextractionofDNA
运用Chelex能有效地去除非核酸有机物性能而提取DNA办法。
2.4硅珠法siliconbeadtest
在硫氰酸胍条件下,运用二氧化硅微粒特异捕获有机质溶液中DNA分子性能提取DNA办法。
2.5CTAB法cetyltrimethylammoniumbromidemethod
运用非离子型去污剂十六烷基三甲基溴化胺
(CTAB)具备破坏植物细胞壁和细胞膜及硬组织,并能与DNA形成复合物能力,通过抽提使DNA与蛋白质及多糖类物质有效分离而达到提取高纯度DNA目。
2.6聚合酶链反映polymerasechainreaction-PCR
一种酶促特定DNA片段扩增过程。
3案件受理
3.1刑事案件送检人员需提供公、检、法、司,以及保卫部门盖有公章鉴定委托书或公函,并出示本人工作证。
民事案件送检人员需提供委托单位或个人委托书,并出示本人身份证明。
3.2送检人员需填写送检登记表,详细填写送检单位、送检人姓名、送检日期、简要案情、送检检材名称及特性、有无作过鉴定、原鉴定单位及原鉴定结论、鉴定规定等。
3.3接案人员在理解案情和鉴定规定后,逐个确认检材,并对检材进行编号,有条件照相固定,最后在送检登记表上签名。
3.4检查人员从接案人员手中受理检材时,应详细理解案情和鉴定规定,逐个核对检材后,在送检登记表上签名。
4检材提取和保存
4.1适合DNA鉴定检材涉及血液(痕)、精液(斑)、唾液(斑)、毛发、组织、骨骼等生物检材。
4.2提取检材前注意记录检材大小、形态等特性,必要时照相、录像固定。
提取检材时必要戴手套。
提取检材必要分别包装,在包装袋上注明检材名称、来源、数量、采集日期等,并有采集人及采集见证人签名。
4.3对于活体检材,普通用医用消毒纱布或中速滤纸采集指血或耳垂血(2cm2以上),自然晾干。
可以用口腔拭子提取口腔粘膜细胞,提取前须清水漱口,检材自然晾干;或取毛发3根~5根。
以上检材均用纸袋包装后常温保存。
4.4对于血痕,类似衣裤、地毯、床单上血痕,可以剪下一某些纸袋包装后常温保存;类似衣柜、墙壁、地面、刀、斧上血迹可以刮取,或用生理盐水浸湿纱线提取,自然晾干后纸袋包装常温保存。
4.5涉嫌性侵害,应用棉签分别提取阴道外端、中部和后穹窿部,必要时还应注意会阴、下腹、口腔、肛门等部位有无精液(斑),以及现场怀疑有精斑其她检材,如床单、被褥、卫生纸、避孕套、内裤、衣物等。
所有检材应当分别提取、标明记号、自然晾干、纸袋包装后常温保存。
4.6现场可疑毛发用镊子提取,用纸折叠后置纸袋内常温保存。
4.7具有唾液斑检材如烟头、果核、香口胶等用镊子提取,纸袋包装后常温保存。
4.8人流刮宫组织,取5g以上确以为绒毛组织;引产胎儿,取5g以上组织;羊水,取2ml以上液体。
提取检材干净容器包装、冰冻保存、冷藏送检。
4.9新鲜尸体,可用医用消毒纱布或中速滤纸提取血液(3cm2以上),自然晾干,纸袋包装后常温保存。
新鲜尸体也可取肌肉组织(50g以上);
腐败尸体,尽量提取相对新鲜组织,涉及指甲(2枚以上)、肋软骨(5cm以上)或者其他软骨(5g以上)、深部肌肉组织(50g以上)、毛发(10根以上);白骨化尸体尽量提取指甲、长骨、牙齿、毛发。
以上检材干净容器包装、冰冻保存、冷藏送检。
4.10依照案件状况,注意提取对照样本。
5前期检查
5.1血痕检查
5.1.1预实验—联苯胺实验
5.1.1.1试剂
a)联苯胺无水乙醇饱和液;
b)3%过氧化氢溶液;
c)冰醋酸。
5.1.1.2办法
取滤纸轻轻擦拭斑迹,分别加冰醋酸、联苯胺无水乙醇饱和液、3%过氧化氢溶液,及时浮现翠蓝色为阳性反映。
5.1.2种属实验—环状沉淀实验
5.1.2.1试剂
a)抗人血红蛋白血清或抗人血清;
b)生理盐水。
5.1.2.2办法
取少量血痕检材,滴入适量生理盐水制成浸出液。
取试管加入抗人血红蛋白血清或抗人血清,然后小心加入上述浸出液,60min内两液界面间浮现白色沉淀环者为阳性。
5.1.3种属实验—对流免疫电泳法
5.1.3.1试剂
a)巴比妥缓冲液;
b)高电渗琼脂糖;
c)抗人血红蛋白血清或抗人血清;
d)双蒸馏水。
5.1.3.2办法
取高电渗琼脂糖和巴比妥缓冲液制成琼脂溶液,取琼脂溶液平铺于载玻片上,凝固后打两排成对孔。
取少量血痕检材,滴入适量双蒸馏水或巴比妥缓冲液制成浸出液,加入上述琼脂板负极侧孔内,在琼脂板正极侧孔内加入抗人血红蛋白血清或抗人血清,电泳30min~40min。
电泳完毕后在黑色背景上方,通过斜光照射,观测两孔间形成抗原-抗体复合物白色沉淀线,有白色沉淀线者为阳性。
5.1.4种属实验—金标试纸检查法
试剂和办法以阐明书为准。
5.2精斑检查
5.2.1预实验—酸性磷酸酶实验
5.2.1.1试剂
a)碳酸钙b-萘酯;
b)1-氯化重氮蒽醌;
c)缓冲液:
氯化钠、冰醋酸、醋酸钠。
5.2.1.2办法
取适量碳酸钙b-萘酯和1-氯化重氮蒽醌溶于缓冲液制成检测试剂,取少量可疑斑迹置白瓷板凹内,滴加上述试剂,如检材确为精斑,在30s内即可见橘红色反映。
5.2.2确证明验—精子检出法
5.2.2.1试剂
a)1%酸性复红溶液;
b)1%美蓝溶液;
c)1%盐酸;
d)生理盐水。
5.2.2.2办法
取少量可疑斑迹用适量生理盐水浸泡后,涂于载玻片上,干燥后分别用1%酸性复红溶液和1%美蓝溶液染色,1%盐酸和清水洗涤,干燥后镜检。
精子头部被染成红色,而尾部被染成蓝色。
5.2.3确证明验—金标试纸检查法
试剂和办法以阐明书为准。
5.3唾液斑检查
5.3.1淀粉酶实验
5.3.1.1试剂
a)0.01%淀粉溶液;
b)碘-碘化钾溶液;
5.2.2.2办法
取少量可疑斑迹加适量0.01%淀粉溶液,37℃温箱30min,加碘-碘化钾溶液,呈淡黄色和无色时为阳性反映,呈蓝色则为阴性。
6DNA提取
6.1有机溶剂法
6.1.1器材和试剂
a)高速离心机;
b)水浴或干浴;
c)移液器
d)细胞溶解缓冲液(CLB):
蔗糖,MgCl2,Tris-HCl,TritonX-100;
e)蛋白溶解缓冲液(PLB):
NaCl,EDTA-Na2;
f)DNA提取缓冲液:
Tris-HCl、EDTA、NaCl、SDS、DTT;
g)TNE缓冲液:
Tris-HCl、EDTA、NaCl;
h)TE缓冲液:
Tris-HCl、EDTA;
i)5×精子提取液:
Tris-HCl、EDTA、NaCl、SDS、DTT;
j)纯化试剂;
k)CentriconTM-100;
l)SDS;
m)DTT;
n)饱和酚和氯仿;
o)无水乙醇和70%乙醇溶液;
p)NaCl或NaAc;
q)蛋白酶K。
6.1.2办法
6.1.2.1血液
a)取适量血液加入等体积细胞溶解缓冲液,混匀至透明;
b)离心后去上清液,沉淀中加入蛋白溶解缓冲液匀浆;
c)加入SDS和蛋白酶K,37℃消化4h以上;
d) 加入等体积酚、酚和氯仿(1:
1混合)、氯仿各提取一次后,加1/10体积NaCl或NaAc溶液和2.5倍体积冷无水乙醇混匀,得到团状DNA沉淀;
e)离心去上清液,沉淀中加入70%乙醇混匀;
f)离心去上清液,晾干后加入TE缓冲液备用。
6.1.2.2混合斑
a)剪碎带有精子检材,加入适量TNE缓冲液,37℃保温0.5h~1h,加入SDS和蛋白酶K,37℃保温1h~2h消化女性上皮细胞;
b)底部带孔离心管离心分拜别除载体,并去除上清液,沉淀物用TNE洗涤离心多次;
c)沉淀物内加入5×精子提取液、蛋白酶K,置37℃消化3h~4h;
d)如下同6.1.2.1d)、e)、f)。
6.1.2.3组织
a)取少量组织(脑、肌肉等)加入适量蛋白溶解缓冲液进行匀浆;
b)加入SDS和蛋白酶K,37℃消化4h~6h。
c)如下同6.1.2.1d)、e)、f)。
6.1.2.4毛干
a)将毛干剪成3mm~5mm长,无水乙醇、水、无水乙醇各冲洗一次,晾干后加入DTT、SDS、蛋白酶K、蛋白溶解缓冲液,37℃消化至完全溶解;
b)加入等体积酚、酚∶氯仿(1∶1混合)、氯仿各抽提一次,加入1/10体积NaCl或NaAc溶液和2.5倍无水乙醇,混合后-20℃冷冻1h以上;
c)离心去上清液,沉淀中加入70%乙醇混匀;
d)离心去上清液,晾干后加入TE缓冲液备用。
6.1.2.5骨和牙齿
a)以手术刀刮净骨骼和牙齿表面垢物,用温热蒸馏水冲洗两次,紫外光照射1h。
再用锤子将牙齿砸成粉末和用电钻取出骨松质,并将其用研磨器进一步磨碎;
b)取适量骨或牙齿粉末,加入DNA提取缓冲液、蛋白酶K,于37℃消化过夜;
c)酚和氯仿提取,提取液置CentriconTM-100中离心浓缩后,加1/10体积NaCl和2.5倍无水乙醇-20℃冰箱过夜;
d)离心去上清液,晾干加入TE缓冲液溶解后纯化,纯化试剂和办法以阐明书为准。
6.2Chelex法
6.2.1器材和试剂
a)高速离心机;
b)水浴或干浴;
c)移液器;
d)Chelex-100溶液;
e)TNE缓冲液
f)蛋白酶K溶液;
g)SDS;
h)DTT溶液;
i)双蒸馏水。
6.2.2办法
6.2.2.1血液和血痕
a)取少量血液或血痕加入适量双蒸馏水,室温30min;
b)离心后去上清液,沉淀中加入Chelex-100,56℃消化30min;
c)煮沸8min,离心后4℃冰箱内备用。
6.2.2.2混合斑
a)剪碎带有精子检材,加入适量TNE缓冲液,37℃保温0.5h~1h,加入SDS和蛋白酶K,37℃保温1h~2h消化女性上皮细胞;
b)底部带孔离心管离心分拜别除载体,并去除上清液,沉淀物用TNE离心洗涤多次;
c)沉淀物内加入Chelex-100溶液、蛋白酶K和DTT溶液,置56℃消化1h~2h;
d)煮沸8min,离心后4℃冰箱内备用。
6.2.2.3组织
a)取少量组织(脑、肌肉等)加入适量蛋白溶解缓冲液进行匀浆;
b)加入Chelex-100、蛋白酶K,56℃消化2h~3h;
c)煮沸8min,离心后4℃冰箱内备用。
6.2.2.4唾液斑
a)信封和邮票用灭菌双蒸水润湿棉签涂抹信封封口处和邮票背面,烟蒂直接剪取外层纸,剪碎后加入Chelex-100、蛋白酶K溶液,56℃消化1.5h;
b)煮沸8min,离心后4℃冰箱内备用。
6.2.2.5毛发
a)毛根剪取毛发毛根某些5mm~10mm,毛干则剪成3mm~5mm长,无水乙醇、水、无水乙醇各冲洗一次,晾干后加入
Chelex-100、蛋白酶K、DTT溶液,56℃消化至完全溶解;
b)煮沸8min,离心后4℃冰箱内备用。
6.2.2.6骨和牙齿
a)研碎牙髓或骨髓,加入Chelex-100、蛋白酶K溶液,56℃消化过夜;
b)煮沸8min,离心后4℃冰箱内备用。
6.3硅珠法
6.3.1器材和试剂
a)高速离心机;
b)水浴或干浴;
c)移液器;
d)吸附液:
硫氰酸胍、Tris-HCl、EDTA、TritonX-100;
e)漂洗液:
硫氰酸胍、Tris-HCl;
f)硅珠悬液:
二氧化硅;
g)TES缓冲液:
Tris、NaCl、EDTA;
h)十二烷基肌氨酸钠;
i)SDS;
j)DTT;
k)蛋白酶K;
l)无水乙醇和70%乙醇;
m)双蒸馏水。
6.3.2办法
6.3.2.1血液和血痕
a)取适量血液和血痕,加入TES缓冲液和十二烷基肌氨酸钠,煮沸5min以上,血痕离心去载体;
b)加入吸附液,混和后加入硅珠悬液,混和后室温15min左右;
c)离心去上清液,加入漂洗液,混和;
d)离心去上清液,加入冷70%乙醇,混和;
e)离心去上清液,加入TES,56℃保温10min以上;
f)离心后4℃冰箱内备用。
6.3.2.2混合斑
a)剪碎带有精子检材,加入适量TES缓冲液、SDS和蛋白酶K溶液,37℃消化1h~2h;
b)去载体,离心去上清液,TES缓冲液洗涤沉淀物多次;
c)加入TES缓冲液和十二烷基肌氨酸钠,煮沸5min以上;
d)离心后上清液按6.3.2.1b)、c)、d)、e)、f)操作进行。
6.3.2.3毛发和指(趾)甲
a)毛发或指(趾)甲分别用双蒸馏水和无水乙醇洗涤,剪碎后加入TES缓冲液、十二烷基肌氨酸钠和DTT溶液,56℃消化至完全溶解;
b)离心后上清液按6.3.2.1b)、c)、d)、e)、f)操作进行。
6.3.2.4骨和牙齿
a)取适量骨或牙齿粉末(见有机溶剂提取法)
分别用TES缓冲液和EDTA洗涤,加入TES缓冲液、十二烷基肌氨酸钠和蛋白酶K、DTT溶液,56℃消化过夜;
b)离心后上清液按6.3.2.1b)、c)、d)、e)、f)操作进行。
6.4CTAB法
6.4.1器材和试剂
a)高速离心机;
b)水浴或干浴;
c)移液器;
d)CTAB提取缓冲液:
CTAB(十六烷基三甲基溴化胺)、Tris-HCl、EDTA、NaCl、巯基乙醇;
e)氯仿/异戊醇(24:
1);
f)纯化试剂盒;
g)蛋白酶K;
h)SDS;
i)DTT;
j)双蒸馏水。
6.4.2办法
6.4.2.1骨和牙齿
a)取适量骨或牙齿粉末(见有机溶剂提取法),加入CTAB提取缓冲液,室温过夜;
b)65℃保温1h,离心后保存上清液,加入等体积氯仿/异戊醇,离心后保存上清液;
c)上清液加入MicroconTM-100中,离心浓缩;
d)浓缩液进行纯化,纯化试剂和办法以阐明书为准。
6.5PCR缓冲液解决法
6.5.1器材和试剂
a)高速离心机;
b)水浴或干浴;
c)移液器;
d)10×PCR反映缓冲液;
e)蛋白酶K;
f)DTT;
g)无水乙醇;
6.5.2办法
6.5.2.1毛干
a)将毛干剪成3mm~5mm长,用无水乙醇、水、无水乙醇各冲洗一次,晾干。
b)加10×PCR反映缓冲液、DTT、蛋白酶K溶液,混匀后56℃消化至完全溶解;
c)煮沸变性,离心后4℃冰箱内备用。
7DNA质和量检测
7.1紫外分光光度计法
7.1.1原理
通过测定DNA溶液对光吸取,拟定核酸含量和核酸纯度,不能区别DNA和RNA含量。
7.1.2办法
a)预置分光光度计零点;
b)充分混匀样品,读取260nm和280nmOD值;
c)计算A260/A280比率,比率>1.6为得到较纯DNA;
d)计算DNA浓度:
单链DNA:
1OD=40μg/ml;
双链DNA:
1OD=50μg/ml;
DNA浓度(μg/ml)=稀释倍数×A260×40μg/ml÷1000μg。
7.2定量胶检测法
7.2.1原理
荧光染料溴乙锭可嵌入DNA分子碱基平面之间,在紫外线照射下发出荧光,其光强度与DNA含量成正比。
比较同一凝胶中待测DNA样品与系列原则DNA荧光强度,拟定DNA含量。
7.2.2试剂
a)10′载样缓冲液:
溴酚篮、二甲基晴篮、聚蔗糖;
b)50′TAE缓冲液:
Tris、乙酸钠、EDTA;
c)溴乙锭;
d)DNA原则液,依照详细需要选用。
7.2.3办法
a)配制琼脂糖凝胶;
b)电泳;
c)染色;
d)紫外灯下观测。
7.3人类DNA定量试剂盒
试剂和办法以阐明书为准。
7.4定量PCR仪
试剂和办法以阐明书为准。
8PCR反映
8.1基因座
建议在如下范畴内选取:
D1S80、D2S1338、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、CSF1PO、TPOX、TH01、vWA、FGA、Penta
E、PentaD、F13A01、FESFPS、Amelogenin。
8.2试剂
a)建议选用国际通用试剂盒;
b)自行开发试剂体系须经有关专家委员会承认后方可使用于寻常检案。
8.3仪器
PCR扩增仪。
8.4扩增反映体系及循环参数
以各阐明书为准。
9反映产物检测
9.1银染检测
9.1.1器材和试剂
a)电泳仪器及制备凝胶板套具;
b)移液器;
c)尿素;
d)40%Acr:
bis(19:
1);
e)TEMED;
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